专利名称：性能改善的抑肽酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有改善的酶抑制活性、免疫学性质和药物动力学性质的抑肽酶变异体及其制备。
抑肽酶也称为牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI)，属于Kunitz类型丝氨酸蛋白酶抑制剂家族。可抑制的丝氨酸蛋白酶的范围包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、纤维蛋白溶酶和血浆血管舒缓素(W.Gebhard，H.Tschesche and H.Fritz，Proteinase Inhibitors，Barrett and Salvesen(eds.)，Elsevier Science Publ.BV 375-387，1986)。
抑肽酶由58个氨基酸组成。借助于X-射线结构分析和NMR光谱分析，阐明了蛋白质的三级结构(Wlodawer et al.，J.Mol.Biol.198(3)，469-480，1987；Wager et al.，J.Mol.Biol.196(1)，227-231，1987；Berndtet al.，Biochemistry 32(17)，4564-4570，1993)。
商品名为Trasylol的天然抑肽酶最初用于胰腺炎的治疗。今天Trasylol用于心脏外科，因为临床研究表明，用抑肽酶进行治疗显著降低该类型手术中输血的需要，并减少术后出血(D.Royston，J.Cardiothorac.Vasc.Anesth.676-100，1992)。
有迹象表明，在决定抑制特异性的15位氨基酸的置换可产生具有改善的抑制性质的有用的抑肽酶变异体(德国专利说明书3339693)。这样，根据导入的氨基酸不同，可以产生例如可抑制胰腺或白细胞弹性蛋白酶的各种有效抑制剂。
还有迹象表明，抑肽酶抑制活性以及在第15位置换产生的变异体们的抑制活性还由被抑制的靶蛋白酶与抑制剂分子之间接触区中的氨基酸残基所决定。这些氨基酸尤其包括在第14、16、17、18、19、34、38和39位上的其它氨基酸残基。在以下专利申请例如WO89/01968、WO89/10374、EP 0307592、EP 683229中描述了其中包括由于在接触区中置换一个或多个氨基酸残基产生的性能改善的抑肽酶变异体。
有趣的是，通过置换确定物质物化性质的氨基酸，可能改进抑肽酶及其变异体的药物动力学性质。因此通过降低分子的净正电荷可能显著降低肾脏的结合。专利申请WO92/06111中描述了该类型的变异体。
为了提高工业的制备性，在某些情况下最好进行抑制分子的N-末端修饰。这类修饰可以是N-末端收缩或延伸，或是缺失一个或多个氨基酸。EP 419878中描述了N-末端修饰的抑肽酶变异体。
本发明的抑肽酶变异体本专利申请中描述的抑肽酶变异体的区别在于以下特征1.置换分子活性中心的一个或多个氨基酸，以改进活性性质。
2.置换氨基酸降低净正电荷，以改进免疫学性质和药物动力学性质。
3.修饰N-末端氨基酸序列，以改进工业制备性。
上述专利申请中描述的每个抑肽酶变异体只含有其中一个上述特征。现在，本发明的抑肽酶变异体在其分子结构中结合了两个或三个上述特征。图中举例显示了某些变异体的氨基酸序列。
然后，本发明的抑肽酶变异体不限于
图1所示的实例。本发明抑肽酶变异体也包括具有N-末端延伸Ala(-2)-Gln(-1)的变异体、在2位具有中性氨基酸残基脯氨酸的变异体、由中性或带负电荷的氨基酸残基置换带正电荷的氨基酸的变异体、或由带负电荷的氨基酸残基置换中性氨基酸的变异体。这里氨基酸残基置换的选择按照以下原则进行产生的物质在生理pH下净正电荷降低，最好为+2至-2。上述氨基酸序列的改变(包括N-末端收缩或延伸或缺失)可以根据需要相互结合来加以利用。因此，本发明的抑肽酶变异体包括含有上述特征组合、并在生理pH下净正电荷降低的所有化合物。
令人惊讶的是，两个或三个上述特征的组合似乎不仅使得我们获得各个特征的表达，而且在某些情况下甚至增强各个特征的表达。此外，也可能产生涉及例如免疫学性质、药物动力学性质和表面结合性质的明显新的物质性质。这些新变异体表现出与多克隆人抗血清和多克隆兔抗血清(使用抑肽酶所产生)的反应减小。我们还发现，与抑肽酶相比，新变异体显著地降低了其免疫原行为，即它们诱导的免疫反应较弱。还有迹象表明，本发明的变异体与抑肽酶相比，诱导血细胞释放的组胺数量降低。此外，与抑肽酶相比，新变异体还表现出明显较少肾脏蓄积量。与该分子的早期变异体相比，尽管在该分子中存在大量变化，其酶动力学抑制常数(Ki值)都令人惊讶地提高了。
因此，本发明涉及在pH7下净电荷为+3至-3、具有氨基酸Arg 15或Arg 15-Ala 17的抑肽酶变异体。优选变异体的净电荷为+2至-2，特别优选为+1至-1。
这些抑肽酶变异体适用于血浆血管舒缓素、组织血管舒缓素和纤维蛋白溶酶的抑制。
另外，这些抑肽酶变异体具有修饰的N-末端序列。
因此，本发明的目的是提供具有N-末端延伸或收缩或具有缺失的氨基酸的抑肽酶变异体。
推荐的抑肽酶变异体是DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、DesPro2-Ser10-Arg15-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、DesPro2-Ser10-Arg15-Ser17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶和DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-抑肽酶。
这些抑肽酶变异体在第2位也携带氨基酸脯氨酸。
本发明也涉及包含一个或多个这些抑肽酶变异体的药物。
描述的新蛋白酶抑制剂适于治疗多种疾病，在这些疾病中(也由于相对复杂的手术方法，诸如在心脏外科或在移植术中的异常关节成形的关节置换中的方法等)，由于血液广泛的或增强的外源表面接触，使血浆中酶系统的活性发生而造成。
抑制剂能降低那些具有高度出血危险的手术中血液的损失(例如心脏手术、骨外科和关节外科)。它们适于治疗休克、多处创伤和颅脑创伤、败血症、散播性血管内凝血(DIC)、多器官衰竭、涉及血管舒缓素系统的炎症(诸如风湿性关节炎和哮喘等)。通过抑制血纤维蛋白溶酶，阻止恶性肿瘤的生长的转移。由于抑制舒缓激肽的合成，它们也适用于疼痛和水肿的治疗。它们也适用于透析疗法和预防人造器官炎症、血凝固和出血风险的增加。
本发明抑肽酶变异体的制备为了制备本发明抑肽酶变异体，最好使用基因工程方法。为此，使用常规分子生物学方法，将在各种情况下考虑用于抑肽酶变异体合成的基因工程信息引入适当的表达微生物体内。重组微生物进行发酵；通过选择适宜的条件，表达异源遗传信息。随后从培养肉汤中获得表达的抑肽酶变异体。
用于生产本发明抑肽酶变异体的适宜的宿主微生物可以是细菌、酵母菌或真菌。表达可以在细胞内进行，或用适当的分泌系统在细胞外进行。抑肽酶变异体可以正确地加工或融合为多肽或蛋白质。
专利申请EP 683229、WO89/02463、WO90/10075以及上述各种其它专利申请中描述了用于表达抑肽酶变异体的适宜系统。
实施本发明的方法酶所用的酶(限制性内切酶、来自牛肠的碱性磷酸酶、T4多核苷酸激酶和T4 DNA连接酶)得自Boeringer Mannheim和GIBCO/BRL，按照生产商的说明书使用。
分子生物学技术诸如从大肠杆菌中分离质粒DNA(所谓的微制备)和用质粒DNA转化大肠杆菌等的常规克隆工作按照Sambrook等人的方法进行(Molecular Cloning，Cold Spring Harbor，1989)。用于转化的宿主生物是大肠杆菌菌株DH5α(GIBCO/BRL)。为了分离大量的质粒DNA，使用Qiagen牌取液器枪头(Qiagen)。按照生产商(Genomed)的详细说明，借助于Jetsorb从琼脂糖凝胶中提取DNA片断。
用于“定点诱变”实验的寡核苷酸和用于PCR和测序反应的引物用Applied Biosystems的“380 A DNA合成仪”进行制备。诱变实验按照Deng和Nickoloff的方法(Deng et a.，Anal.Biochem.200，81-88，1992)，用Pharmacia Biotech的试剂盒(“Unique Site EliminationMutagenesis”)进行。所有构建的载体和诱变实验，在“ABI 373 A测序仪”(Applied Biosystems)上通过使用荧光标记终止子的Taq循环DNA序列分析法进行证实。
酿酒酵母的转化酵母菌细胞例如菌株JC34.4D(MATα，ura3-52，suc2)在10mlYEPD(2％葡萄糖；2％蛋白胨；1％Difco酵母抽提液)中进行培养，在O.D.600nm为0.16-0.8时收获。细胞用5ml溶液A(1M山梨醇；10mM N-二(羟乙基)甘氨酸pH8.35；3％乙二醇)洗涤，再悬浮于0.2ml溶液A中，并于-70℃保藏。
将质粒DNA(5μg)和载体DNA(50μg，来自青鱼的精液)加入冷冻细胞中。细胞于37℃振荡5分钟进行复苏。加入1.5ml溶液B(40％PEG 1000，200mM N-二(羟乙基)甘氨酸pH8.35)后，细胞于30℃保温60分钟，然后用1.5ml溶液C(0.15M NaCl；10mM N-二(羟乙基)甘氨酸pH8.35)洗涤，再悬浮于100μl溶液C中。在具有2％琼脂的选择培养基上涂平板。于30℃培养3天后获得转化子。用于发酵的营养培养基1.SD2培养基Bacto酵母含氮培养基 6.7g/l葡萄糖*20g/lKH2PO46.7g/lpH6.02.SC5培养基葡萄糖*20g/lDifco酵母抽提液 20g/lKH2PO46.7g/l(NH4)2SO42.0g/lMgSO4×7H2O 1.0g/l微量元素溶液SL4 1.0ml/lpH6.0微量元素溶液SL4Titriplex III 5g/lFeSO4×7H2O 2g/lZnSO4×7H2O 0.1g/lMnCl2×4H2O 0.03g/lH3BO30.3g/lCoCl2×6H2O 0.2g/lCuCl2×2H2O 0.01g/lNiCl2×6H2O 0.02g/lNa2MoO4×2H2O0.03g/l*＝单独高压灭菌3.发酵罐培养基葡萄糖*2.0g/l大豆蛋白胨 25.0g/lKH2PO41.4g/lMgSO4×7H2O1.0g/l盐酸硫胺 5.1mg/l肌醇 20mg/l微量元素溶液SL4 3ml/l维生素溶液 3ml/l(NH4)2SO43.8g/lpH5.5进料溶液葡萄糖*530g/l(NH4)2SO45.0g/lKH2PO42.9g/lMgSO4×7H2O3.8g/l盐酸硫胺 13mg/l肌醇 70mg/l微量元素溶液SL4 6.8ml/l维生素溶液 6.8ml/l*＝单独高压灭菌微量元素溶液FeCl3×6H2O13.5g/lZnCl2×4H2O2.0g/lH3BO30.5g/l
CoCl2×6H2O2.0g/lCuSO4×5H2O1.9g/lNa2MoO4×2H2O 2.0g/lCaCl2×2H2O1.0g/l浓盐酸 100ml/l维生素溶液核黄素 0.42g/l泛酸钙 5.9g/l烟酸 6.1g/l盐酸吡哆醇 1.7g/l生物素 0.06g/l叶酸 0.04g/l接种液的制备于1L锥形瓶中，在200ml SD2培养基中接种保藏原种至浓度为1％。培养物在摇床上(260rpm)于28℃培养72小时。然后以每份2ml装入保藏容器中并在液氮中冷冻。
在摇床上的烧瓶中进行的发酵作为预培养，于1L锥形瓶中，将200ml SD2培养基用接种液接种至浓度为1％，然后在摇床上(260rpm)于28℃培养72小时。用预培养物接种主培养物(在1L烧瓶中的200ml SC5培养基)至浓度为1％，然后在摇床上(260rpm)于28℃培养72-96小时。
在10L生物反应器中的发酵作为预培养，于11锥形瓶中，将200ml SD2培养基用接种液接种至浓度为1％，然后在摇床上(260rpm)于28℃培养72小时。10L发酵罐中的主培养在96小时的过程中分批进料进行发酵。所用的营养培养基为发酵罐培养基，起始体积为7L。发酵罐用200ml预培养物进行接种。
发酵条件温度28℃搅拌器的旋转速度500rpm通气10l/minpH5.5head space压力200mbar发酵7小时后，开始进料。进料速率由呼吸商(RQ)(RQ＝产生的CO2/消耗的氧气)控制。如果RQ升至＞1.15，那么降低进料速率，如果RQ降至＜1.05，那么增加进料速率。
按一定的时间间隔，从发酵罐中取出样品，通过测定700nm的光密度检测细胞的生长。另外，通过活性测量测定上清液中Bay 19-8757的浓度。
发酵结束时，通过加入50％(w/v)柠檬酸将pH降至pH3，发酵罐于70℃加热10分钟。然后以7,500×g离心分离出细胞，上清液用于蛋白质纯化。
用于蛋白质化学分析的材料序列分析用Applied Biosystems(Forster City，USA)的473型蛋白质测序仪进行。使用标准测序程序。在操作手册中详细描述了测序仪、各种测序程序和PTH检测系统(用户手册，473 A型蛋白质测序系统(1989)Applied Biosystems Forster City，CA 94404，USA)。
用于测序仪操作的试剂和用于PTH检测的HPLC柱得自AppliedBiosystems。
HPLC分析用Hewlett Packard(D-Waldbronn)的HP 1090 HPLC系统进行。将Bakerbond(D-Groβ Gerau)的RP-18 HPLC柱(250mm×4.6mm，5μ材料，孔径为300)用于分离。
270A-HT型毛细电泳仪来自Applied Biosystems(Forster City，CA94404，USA)。通常按不同的时间间隔流体动力学地注射样品。所用的毛细管柱(50μm×72cm)来自Applied Biosystems。
氨基酸分析用Eppendorf Biotronik(D-Maintal)的LC 3000氨基酸分析仪进行。使用稍微修改的Biotronik的标准分离程序。仪器手册中详细描述了分离程序和分析仪的功能。
分子量用Kratos/Shimadzu(D-Duisburg)的MALDI I系统进行测定。SDS电泳用Pharmacia(D-Freiburg)的电泳系统进行。
动力学数据用SLT(D-Crailsheim)的微量滴定板读板仪进行测定。微量滴定板用Dynatec(D-Denkendorf)的洗涤仪进行洗涤。
酶和底物来自Calbiochem(D-Bad Soden)。所有其它化学品和试剂都来自Merck(D-Darmstadt)或Sigma(D-Deisenhofen)。96孔板购自Greiner。
多克隆兔抗抑肽酶抗体通过用抑肽酶免疫兔来获得。人多克隆抗抑肽酶抗体来自用抑肽酶治疗的病人。
蛋白质的化学分析N-末端序列分析将溶于水中的1-3nmol蛋白酶抑制剂加到用Polybrene预保温的测序纸上。用快速正常的测序仪周期进行序列分析。PTH氨基酸用联机的PHLC，借助于50pmol PTH标准进行识别。
氨基酸分析将200μg蛋白质溶于200μl 6N HCl中，于166℃水解1小时。将大约1nmol样品加入氨基酸分析仪中。用5nmol标准测定氨基酸的量。
SDS凝胶电泳按照Laemmli的条件进行SDS凝胶电泳。用10-20％强度的SDS凝胶分析10μg蛋白酶抑制剂，并用银染法进行目测检验(Merril等人)。
U.K.Laemmli，Nature 227，680-685(1970)。
C.R.Merril，M.L.Dunau，D.Goldman，Anal.Biochem.100201-207(1981)。
毛细电泳在玻璃柱(长度为72cm，内径为50μm)上进行毛细电泳，研究8ng蛋白酶抑制剂。条件电流密度为90μA，柱温为25℃，100nM磷酸盐缓冲液pH3.0，测定210nm，在3秒内在压力下加样。
反相色谱法将5nmol蛋白酶抑制剂在Bakerbond RP-18 HPLC柱(5μ材料，4.6nm×250mm，孔径为300)上进行色谱分离。所用的洗脱液为乙腈/TFA梯度。条件流速为0.7ml/min，柱温为40℃，测定温度为40℃，溶剂A为0.1％TFA，溶剂B为0.1％TFA/60％乙腈；梯度0min 0％B，10min 0％B，70min 100％B，80min 0％B。
分子量的测定1μg蛋白酶抑制剂用MALDI技术进行分析。所用的基质为芥子酸。用于质量校准的标准为牛胰岛素、细胞色素C和蜂毒肽。
蛋白含量蛋白含量按照BCA法进行测定。在该方法中，Cu2+离子借助于存在的蛋白质反应为Cu1+离子，后者与bicinchoninic acid形成络合物，在560nm处有吸收峰。
冻干的蛋白质在浓度为1mg/ml时达到平衡含湿量，并溶于0.9％NaCl。制备稀释系列。将1000μl BCA试验试剂(Pierce)加入50μl样品溶液中，用塞子紧紧塞住试管，并于60℃恰好保温30分钟。在冰浴中将样品冷却5分钟后，于25℃、波长为560mm进行测定。
活性(胰蛋白酶抑制试验，滴定分析)活性按照修改的F.I.P.胰蛋白酶抑制试验进行测定。Bay 19-8757抑制胰蛋白酶催化的Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)的水解。通过碱滴定测定反应中释放的羧基基团。胰蛋白酶的残留活性是活性化合物抑制活性的度量标准。
冻干的蛋白质在浓度为1mg/ml时达到平衡含湿量，并溶于0.9％NaCl，制备稀释系列。将2ml缓冲液(15mM硼酸盐缓冲液，pH8.0，含有200mM CaCl2)和0.8ml胰蛋白酶溶液(2mg/ml)加入1ml样品中，混合物于25℃保温5分钟。然后加入0.2ml BAEE溶液(6.8mg/ml)，在5分钟内测定KOH的消耗量。
蛋白酶抑制剂与多克隆兔或人抗抑肽酶抗体交叉反应的测定将溶于偶联缓冲液的0.5-10ng蛋白酶抑制剂或抑肽酶于4℃过夜结合到微量滴定板上。每个孔用洗涤缓冲液洗涤4次，每次200μl，然后加入100μl封闭溶液。盖上微量滴定板，于37℃保温1小时。按上述方法洗涤后，加入多克隆兔抗抑肽酶抗体(在含有1％BSA的PBS缓冲液中0.2μg/ml)或人抗体(在含有1％HSA的PBS缓冲液中20μg/ml)。盖上微量滴定板，于37℃保温1小时，然后按上述方法洗涤。然后加入100μl生物素化的抗兔或抗人抗体(25μl+10ml含有1％BSA的PBS缓冲液或含有1％HSA的PBS缓冲液)，混合物于37℃保温1小时。按上述方法洗涤微量滴定板，然后每孔加入100μl抗生蛋白链霉素-过氧化物酶复合物(50μl+10ml含有1％BSA的PBS缓冲液或含有1％HSA的PBS缓冲液)。盖上微量滴定板，于37℃保温1小时，然后按上述方法洗涤。
底物反应用TMB底物+过氧化物酶溶液(1+1；每孔100μl)进行。10分钟后每孔用100μl 2M磷酸终止反应，然后于450nm(参考为570nm)进行测定。
溶液1.保温缓冲液15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH9.62.样品缓冲液将样品以适当的浓度溶于保温缓冲液。
3.洗涤缓冲液含有0.1％(v/v)Tween 20的PBS4.封闭缓冲液含有3％(w/v)BSA或HSA的PBS实施例实施例1
用于分泌重组DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶的酵母表达载体的制备用于制备DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶基因的起始材料为DesPro2-Arg15-Ala17基因，用限制性内切酶HindIII和BamHI将后者克隆到载体pUC18中。产生的载体(pEM6.6.L)按照U.S.E.法(Pharmacia Biotech)，用诱变引物A和Scal/MlulU.S.E.选择引物进行双链诱变反应。诱变引物A具有以下序列引物A5’GGCTGCAGAGCTAACCGTAACAACTTCAAATCCGCGGAAGACTGCATGGAAACTTGCGGTGGTGCTTAG3’。该引物在DesPro2-Arg15-Ala17抑肽酶基因中产生突变Asn41和Glu53。用酶SacI和SphI进行限制性降解来进行该克隆的分析。所需的序列再通过克隆pEM31.8.L的DNA序列分析加以证实。由pEM31.8.L质粒DNA开始，用引物B和‘反24-mer M13’引物借助于PCR技术在基因的5’区产生进一步的置换(Ser10-Asp24-Thr26-Glu31)。引物B具有以下序列引物B5’TGCCTCGAGCCGCCGTCTACTGGGCCCTGCAGAGCTATCATCCGTTACTTCTACGATGCAACTGCAGGCCTGTGTGAAACCTTCGTATACGGC 3’。横线上为XhoI酶的识别序列。
总体积为100μl的PCR混合物中含有20ng pEM31.8.L质粒DNA、20pmol‘反24-mer M13’引物、60pmol引物B、200μMdNTPs、1×PCR反应缓冲液II(Perkin Elmer)、4mM MgCl2和2.5UTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer)。‘循环’条件为94℃3分钟，然后以94℃1分钟、55℃1分钟和72℃1分钟进行30个循环，随后于72℃保温5分钟。将PCR混合物按1∶5稀释，与载体pCRII(Invitrogen)连接。用连接混合物转化大肠杆菌DH5α细胞。用酶XhoI和BamHI进行限制性降解后识别阳性克隆，并对几个克隆进行序列分析。克隆pES9.10.L含有所需的序列，将其用于进一步的研究。
大肠杆菌/酵母菌穿梭载体(例如pA202)用于酵母菌分泌载体的构建，其中将DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶序列连接到酵母α-因子的pre-pro序列上。
载体pA202携带的氨苄青霉素抗性基因(bla)和URA3基因作为大肠杆菌和酵母菌的选择性标记基因。载体的另一基本要素为Co1 E1和2μ复制原点(ori)。REP3位点也位于该区内。1200bp EcoRI-HindIII片断携带MFα1启动子和酵母α-因子蛋白前体的N-末端pre-pro序列(Kujan and Herskowitz，Cell 30，933-943，1982)。通过导入作为HindIII-BamHI片断的已修饰DesPro2-Arg15-抑肽酶cDNA，酵母α-因子pre-pro序列内KexII蛋白酶的识别位点(‘Lys-Arg’)得已制备(EP 0419878)。
在DesPro2-Arg15-抑肽酶序列的3’末端，载体携带酵母URA3基因的BamHI-SalI片断，后者在该位置作为转录的终止信号(Yarger et al.，Mol.Cell.Biol.6，1095-1101，1986)。
用XhoI和BamHI从载体pES9.10.L切下180bp DNA片断，通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化，然后克隆到也用XhoI和BamHI切割并去磷酸化的载体pA202中。通过该克隆，载体pA202中的DesPro2-Arg15-抑肽酶被DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶置换。用该克隆产生的载体pES13.10.L克隆酵母菌细胞(JC34.4D)。
具有不同启动子(诸如组成型GAPDH启动子或可诱导型GAL 10启动子等)的其它大肠杆菌/酵母菌穿梭载体可以以相似的方式进行制备，也导致DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶的分泌。
另外，当然也可以使用具有其它酵母复制原点(诸如自主复制染色体的片断(ars)等)的穿梭载体。
除USA3基因外，适合的选择性标记基因是那些帮助酵母恢复原养型的营养缺陷型突变体基因，诸如LEU2、HIS3或TRP1基因。此外，当然也可以使用那些其产物赋予各种抗生素(诸如氨基葡糖苷G418等)抗性的基因。
其它酵母菌(诸如甲基营养型酵母菌Pichia pastoris或Hansenulapolymorpha等)在用适当的载体转化后，也能够生产DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶。
实施例2用于分泌具有天然N-末端序列‘Arg-Pro-Asp’的重组DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶的酵母表达载体的制备为了制备能够分泌具有天然N-末端序列‘Arg-Pro-Asp’的DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶的酵母表达载体，首先通过PCR扩增和克隆具有α-因子pre-序列和抑肽酶基因5’末端(直到限制性内切酶XhoI的识别位点)的MFα1启动子。所用的引物具有以下序列引物C5’GGGATATCTATTGATAAGATTTAAAGGTATTTGACAAG3’。横线上为EcoRV酶的识别序列。引物D5’GGGCTCGAGGCAGAAATCTGGTCTAGCCAAAGCAGAAGAAGCAGCGAACAAGACAGCAGTGAAAATAGATGGAATCTCATTCTTTTAATCGTTTATATT3’。横线上为XhoI酶的识别序列。
总体积为50μl的PCR混合物中含有200ng pA202质粒DNA、0.2μM引物C、0.2μM引物D、200μM dNTPs、1×PCR反应缓冲液11(Stratagene，Opti-PrimeTM)和2.5U Taq DNA聚合酶(PerkinElmer)。‘循环’条件为94℃1分钟，然后以94℃1分钟、50℃1分钟和72℃2分钟进行30个循环，随后于72℃保温5分钟。将PCR混合物按1∶5稀释，与载体pCRII(Invitrogen)连接。用连接混合物转化大肠杆菌DH5α细胞。用酶EcoRI进行限制性降解后识别阳性克隆，并对几个克隆进行序列分析。克隆pIU20.11.L用于进一步的研究。
大肠杆菌/酵母菌穿梭载体pYES2(Invitrogen)用于酵母分泌载体的构建，其中将DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶序列直接连接到酵母α-因子的pre-序列上。载体pYES2首先用限制性内切酶SspI和BamHI进行酶切、去磷酸化，然后进行凝胶纯化。以这种方式取出存在于载体pYES2上的GAL1启动子和flori。用EcoRV和XhoI从载体pIU20.11.L切下大约1030bp DNA片断，通过琼脂糖凝胶电泳纯化，然后与载体pES9.10.L的大约180bpXhoI和bamHI片断一起克隆到用SspI和BamHI酶切的载体pYES2中。用连接混合物转化大肠杆菌DH5α细胞。用酶XhoI进行限制性降解后识别阳性克隆并进行序列分析。用产生该克隆的载体pIU28.11.L转化酵母菌细胞(JC34.4D)。表达载体不再含有α-因子的pro-序列，因此，只能通过信号肽酶进行DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶的加工，而不受KexII蛋白酶酶切的影响。
实施例3酿酒酵母的发酵酿酒酵母表达菌株按上述方法进行发酵。
实施例4在中性pH不带净电荷的抑肽酶衍生物的纯化1.适宜纯化方法的调查发酵后，通过离心分离出细胞，过滤留下的上清液，以除去留下的细胞。
加入浓柠檬酸，将无细胞的上清液调至pH3。溶液必须用纯水进行适当地稀释，以建立低于8mS/cm的电导率。随后，将溶液装到预先用酸性缓冲液平衡的阴离子交换柱上。用起始缓冲液进行大量地洗涤，除去未结合的物质。借助于盐梯度洗脱产物。获得的部分借助于反相高压液相色谱(RP-HPLC)以及测定蛋白酶抑制的生物学活性试验进一步调查产物内含物。合并获得的部分，直接装到制备型RP-HPLC柱上。柱子预先用起始缓冲液进行平衡。用有机溶剂梯度洗脱产物。获得的部分再按上述方法调查产物内含物，合并含有产物的部分。根据达到的产物纯度，可能必须在第二个RP-HPLC柱上纯化合并的部分。条件基本上与上述条件相同。获得的产物溶液用水稀释，以用于注射，以适当的份数进行调制并冷冻干燥。
可以与上述方法一起使用的、在中性pH不带净电荷的抑肽酶衍生物的其它纯化方法是琼脂糖-固定化胰蛋白酶亲和层析法以及凝胶渗透色谱法。
2.DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶的纯化来自101发酵的材料按照以下方法进行纯化。在发酵完成后，将发酵罐内含物用浓柠檬酸调至pH3，并于70℃加热10分钟。然后通过离心除去细胞(Heraeus离心机，7500×g，15分钟)，过滤获得的上清液(8-0.2μm，Millipore，Germany)。上清液可以从该阶段开始，于-18℃冷冻储藏直至下一次使用。然后加入纯水，将溶液稀释为电导率低于8mS/cm，装到SP-琼脂糖FF柱上(Pharmacia，Sweden)。柱子预先用50nM柠檬酸盐-NaOH缓冲液pH3平衡。用相同的缓冲液进行充分洗涤，除去未结合的蛋白质。然后借助于盐梯度(1M NaCl)洗脱产物。获得的部分借助于反相高压液相色谱(RP-HPLC，C4)以及蛋白酶抑制活性试验调查产物内含物。合并那些含有所需产物的部分。
然后将产物溶液直接装到预先用0.1％三氟乙酸/水平衡的第一RP-HPLC柱上(Source 15 RPC，Pharmacia，Sweden)。用相同的缓冲液进行充分洗涤，除去未结合的蛋白质。借助于线性乙腈梯度(0-70％)洗脱产物。获得的部分再用上述方法调查产物内含物，然后合并那些含有产物的部分。
对于最后的纯化，含有产物的溶液用水稀释，以用于注射，然后装到预先用0.1％三氟乙酸/水平衡的第二RP-HPLC柱上(Vyadc C8，Vydac，USA)。用相同的缓冲液进行充分洗涤，除去未结合的蛋白质。然后借助于线性乙腈梯度(0-70％)洗脱产物。获得的部分用上述方法调查产物内含物，然后合并那些含有产物的部分。
获得的产物溶液用水稀释，以用于注射，以适当的份数进行调制(20、10、1和0.2mg)，冻干并进行分析。
实施例5使用DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶进行的人血浆血管舒缓素的Ki的测定实施例将1单位的人血浆血管舒缓素用缓冲液(0.05M Tris/0.1M NaCl，0.05％Treen 20；pH8.2)稀释至16ml。在200μl该酶溶液加入体积逐级减少的试验缓冲液(250μl、240μl、230μl、220μl、200μl、180μl、170μl、150μl、100μl和50μl)混合，然后增加加入在分析缓冲液中的抑制剂量(10μl、20μl、30μl、50μl、70μl、80μl、100μl、150μl、200μl和250μl；浓度为0.7μg/μl)。
将酶/抑制剂溶液于室温预保温4小时。然后将180μl的每种溶液加入微量滴定板的孔中，与20μl底物溶液混合。于450nm测定10分钟的吸收变化。测定酶的反应速率，由此按照Bieth的方法计算Ki值(Biochemical Medicine 32387-397(1984)。
底物储液 含0.1M底物的DMSO(二甲亚砜)底物溶液 含1×10-3MS-2302的分析缓冲液分析缓冲液0.05M三(羟甲基)-氨基甲烷，0.1M NaCl，0.05％Treen 20；pH8.2；1ml苯甲醇/l用同样的步骤测定与酶纤维蛋白溶酶因子XIa、牛胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶络合的动力学常数。纤维蛋白溶酶的底物为ChromozymPL，因子XI的底物为HD-Pro-Phe-Arg-pNA，胰蛋白酶的底物为S-2444，而胰凝乳蛋白酶的底物为Suc-Phe-Leu-Phe-pNA。
实施例6DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶蛋白质化学表征的结果蛋白酶抑制剂DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶通过基因工程修饰的酵母有机体的分泌进行制备。由酵母上清液用各种色谱法纯化为同质。用克隆的序列进行的抑制剂的识别用以下蛋白质分析研究来表明。
N-末端序列分析蛋白酶抑制剂完全的序列分析超过57步。以下序列显示出测定的蛋白质序列，与克隆的序列相同。
1Arg-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Ser-Thr-Gly-Pro-Cys-Arg-Ala-Ala-Ile-Ile-Arg-Tyr-21Phe-Tyr-Asp-Ala-Thr-Ala-Gly-Leu-Cys-Glu-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg-Ala-40Asn-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Glu-Thr-Cys-Gly-Gly-AlaDesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶的序列分析超过57步。
氨基酸分析氨基酸分析是蛋白质表征的重要的定量参数。除蛋白质含量外，在已知一级结构的情况下，测定各个氨基酸的数。DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶的氨基酸分析与来自一级结构的理论值(表1)很好地吻合。
表1DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶的氨基酸分析。残基数基于Ala＝7。
氨基酸残基数 理论数CysSO3H 5.286Asp6.276Thr3.494Ser1.582Glu4.254Gly6.166Ala7.007Val0.981Met1.101Ile1.662Leu1.892Tyr2.493Phe4.114Lys1.051Arg4.735Pro3.233*) 半胱氨酸和甲硫氨酸用过甲酸氧化进行测定(Met表示甲硫氨酸磺基)。
反相色谱法在化学结合的反相蛋白质HPLC色谱中，通过蛋白质的疏水作用结合到所用的相上。随结合到固定相的强度的不同，蛋白质被有机溶剂(流动相)取代。因此，该方法是评价蛋白质纯度的很好的判别准则。DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶从RP-18相中作为单独的峰洗脱出来。表明分离的蛋白酶抑制剂是纯净的。
CE色谱法毛细电泳允许根据在电场中的电荷分离多肽和蛋白质。在这种情况下分离的质量取决于缓冲液、pH、温度以及所用的添加剂。所用的毛细管是所谓的“熔凝硅石”柱，内径为50-100μm。DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶在电场中的“熔凝硅石”柱上分离。电泳图谱显示出一个窄峰。
分子量的测定DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶的分子量用MALDI技术测定为6223道尔顿。这样，测定的分子量在测定方法精确度的范围内与理论值6215道尔顿很好地吻合。芥子酸用作基质。
SDS凝胶电泳在还原和非还条件下用SDS电泳分析DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶。显示的带大约为6.5kD。
实施例7DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶与酶络合的Ki值的测定测定各种酶的DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶的抑制常数。表2显示Ki值。
表2DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶与酶血浆血管舒缓素、因子XIa、牛胰凝乳蛋白酶和牛胰蛋白酶络合的抑制常数。
实施例8蛋白酶抑制剂与多克隆兔或人抗抑肽酶抗体的相互作用用重组方法制备的蛋白酶抑制剂用多克隆兔或人抗抑肽酶抗体进一步研究其交叉反应。现已发现各种蛋白酶抑制剂变异体与抑肽酶抗血清只显示非常弱的相互作用。
序列表(1)一般资料(i)申请者(A)姓名Bayer AG(B)街道Bayerwerk(C)城市Leverkusen(E)国家德国(F)邮政编码51368(G)电话0214-3061455(H)电传0214-303482(ii)发明的题目性能改善的抑肽酶变异体(iii)序列数目5(iv)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.30B(EPA)(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特性(A)长度69个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型基因组DNA(iii)假设否(iv)反向否(vi)来源(A)有机体引物A(xi)序列说明SEQ ID NO1GGCTGCAGAG CTAACCGTAA CAACTTCAAA TCCGCGGAAGACTGCATGGA AACTTGCGGT 60GGTGCTTAG 69(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特性(A)长度93个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型基因组DNA(iii)假设否(iv)反向否(vi)来源(A)有机体引物B(xi)序列说明SEQ ID NO2GGCTGCAGAG CTAACCGTAA CAACTTCAAA TCCGCGGAAGACTGCATGGA AACTTGCGGT 60GGTGCTTAG 69(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特性(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑学线形(ii)分子类型基因组DNA(v)片断类型线性(vi)来源(A)有机体引物C(xi)序列说明SEQ ID NO3GGGATATCTA TTGATAAGTA TTAAAGGTAT TTGACAAG38(2)SEQ ID NO4的资料(i)序列特性(A)长度99个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型基因组DNA(iii)假设否(iv)反向否(vi)来源(A)有机体引物D(xi)序列说明SEQ ID NO4GGGCTCGAGG CAGAAATCTG GTCTAGCCAA AGCAGAAGAAGCAGCGAACA AGACAGCAGT 60GAAA TAGAT GGAATCTCAT TCTTTTAATC GTTTATATT99(2)SEQ ID NO5的资料(i)序列特性(A)长度57个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型多肽(v)片断类型线性(vi)来源(A)有机体抑肽酶变异体(xi)序列说明SEQ ID NO5Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Pro Cys Arg Ala Ala1 5 10 15Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe20 25 30Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu35 40 45Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala50 5权利要求
1.pH7时净电荷为+3至-3、在结合区内具有氨基酸Arg15或Arg15-Ala17的抑肽酶变异体。
2.按照权利要求1的抑肽酶变异体用于抑制丝氨酸蛋白酶。
3.按照权利要求1或2的抑肽酶变异体，它具有修饰的N-末端序列。
4.按照权利要求1或2的抑肽酶变异体，它具有N-末端延伸或收缩或在N-末端具有缺失的氨基酸。
5.包括以下蛋白质的抑肽酶变异体DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、DesPro2-Ser10-Arg15-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、DesPro2-Ser10-Arg15-Ser17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-抑肽酶、Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、Ser10-Arg15-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、Ser10-Arg15-Ser17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、Ser10-Arg15-Ala17-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶和Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶。
6.包含一种或多种权利要求1-5的抑肽酶变异体的药物。
7.按照权利要求1-5的抑肽酶变异体在外科中用来减少血液损失的药物生产以及在治疗严重损伤、休克和炎症的药物生产中的用途。
全文摘要
本发明涉及具有改进的酰－抑制性质、 免疫学性质和药物动力学性质的抑肽酶变异体及其制品。
文档编号A61K38/04GK1172116SQ97115348
公开日1998年2月4日 申请日期1997年7月25日 优先权日1996年7月25日
发明者W·施罗伊德尔, S·比约恩, K·诺里斯, V·迪尼斯, L·诺尔斯科夫－劳里特森, N·D·克里斯滕森 申请人:拜尔公司