专利名称：鸡传染性法氏囊病病毒疫苗、制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于病毒领域，尤指一种利用高压力技术(high hydrostatic pressuretechnique)制备鸡传染性法氏囊病病毒疫苗。
鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)是引起鸡急性高度接触性传染病—鸡传染性法氏囊病的病原，鸡法氏囊是其侵染的靶器官，该病毒不仅直接引起雏鸡发病，发病率近100％，死亡率20-30％，而且雏鸡发病后可以导致长期严重的免疫抑制，大大增加了继发感染的概率，是目前世界养禽业危害最严重的疾病之一。目前一般采用注射IBDV疫苗来预防和控制IBDV感染，较广泛使用的IBDV疫苗有鸡法氏囊弱毒疫苗和鸡法氏囊油乳剂灭活苗(阎继业主编，畜禽药物手册，第二版，金盾出版社，1997，646-648)，前者是采取感染鸡法氏囊病毒合格的鸡胚和鸡胚液加佐剂制成，后者则是发病鸡的法氏囊磨碎后加入保护剂而成。
由于IBDV抗原变异快、血清亚型多等因素的影响，目前的弱毒疫苗在安全性和免疫效果上变化很大(彭发泉，中国畜禽传染病，1995，355-58)。油乳剂灭活苗免疫效果较好，但病鸡法氏囊来源少，成本高。用不同基因工程方法制备的IBDV疫苗可靠性和免疫效率变化也很大，而且成本较高，周期较长，目前还难以推广应用(姜平，蔡宝祥，中国兽医杂志，1996，2253-54)。高压力技术是研究生物体系的有效工具之一，同时在生物技术中显示出很高的应用价值(Heremans K.ed.，High PressureResearch in the Bioscience and Biotechnology，Leuven University Press，1997)。利用高压力技术制备IBDV疫苗至今尚未见报导。病毒一般是由蛋白质和核酸构成的大分子复合物，其外壳蛋白包含多个亚基，如同寡聚蛋白在高压力下会解离并发生构象漂移，在一定的高压力范围内病毒外壳蛋白亚基也可能解离并发生更加复杂的变化，降低压力后病毒难以恢复天然状态，从而影响到病毒的感染性，另一方面表面抗原(外壳蛋白亚基)的结构和构象又可能不改变，因此免疫原性不受高压力影响(Ruan K.and Weber G.，Biochemistry，1989，282144-2153；Silva J.L.et al.，Current Opinion in Srtuctural Biology，1996，6166-175)。病毒在高压力下的结构和性质变化虽然已有文献报导，但本发明首次将理论与实践相结合，制备出了安全、高效的鸡传染性法氏囊病病毒疫苗。
本发明的目的是提供一种安全、高效的鸡传染性法氏囊病病毒疫苗，该疫苗对雏鸡具有很好的免疫保护作用，它是利用高压力技术处理天然IBDV原材料制得，能够广泛用于预防和控制鸡传染性法氏囊病。
本发明是利用高压力(high hydrostatic pressure)技术制备得到的鸡传染性法氏囊病病毒疫苗。该高压力疫苗经感染性和免疫性能测试证实具有安全、稳定和高效免疫保护等特性。
本发明中IBDV疫苗的高压力制备方法可通过三种方法取得制备疫苗的IBDV原材料1.IBDV强毒接种鸡胚成纤维细胞进行增殖，经反复冻融、离心得到病毒培养液；2.将IBDV强毒接种鸡胚绒毛尿囊膜进行增殖，收获绒毛尿囊膜及尿囊液，经匀浆、离心等步骤得到病毒溶液；3.发病鸡法氏囊体经匀浆、生理盐水稀释、反复冻融、离心等步骤后得到病毒溶液。高压力设备是根据Paladini和Weber的设计(Paladini A.A.and Weber G.，Rev.Sci.Instrum.，52419-427，1981)制造而成，该设备主要由高压力容器和压力发生器组成，使用液体(水、油、乙醇等)为压力传送介质。首先将原材料无气泡密封于耐压的塑料管中(如聚乙烯塑料管)，然后置入高压力容器，并与压力发生器连接。选择适当的压力(800-6000大气压)、温度(0-25℃)及时间(20分钟-6小时)，将原材料进行处理，取出后即成为高压力IBDV疫苗，无需其它后处理过程。压力、温度、时间等条件的选择对于高压力IBDV疫苗的制备十分重要。IBDV疫苗的高压力制备方法简便，周期短，可针对不同血清亚型的IBDV病毒较快地制得相应的疫苗产品。
高压力IBDV疫苗的感染性测试采用鸡胚成纤维细胞、SPF(specificpacigen free)鸡胚和SPF雏鸡为模型，分别测定高压力IBDV疫苗的细胞半致死量TCID50、鸡胚致死率和雏鸡致死率及发病状况。测试结果显示高压力疫苗不导致细胞病变，鸡胚致死率和雏鸡致死率均为零，且雏鸡无一发病，说明该高压力疫苗已失去感染性。免疫性能测试以SPF雏鸡为模型，肌肉注射高压力IBDV疫苗进行免疫，并做非免疫对照，天然IBDV强毒擦肛攻毒，计算保护率；对所有试验鸡进行病理解剖，观察是否有IBDV感染发病的典型症状(大腿和胸部肌肉出血，法氏囊出血水肿，肌胃和腺胃交界出血)；用琼脂糖抗原抗体双扩散方法跟踪免疫后雏鸡血清中IBDV中和抗体水平变化(用琼扩价表示)。测试结果表明非免疫雏鸡攻毒后有高死亡率且全部具有典型发病症状，而高压力疫苗免疫雏鸡无一死亡，也无任何发病症状，且免疫雏鸡血清IBDV中和抗体效价很高，说明该高压力疫苗完全可以达到免疫保护雏鸡的目的。此外，用本发明的高压力技术制备的不同IBDV毒株的疫苗都具有上述特点。
本发明的高压力IBDV疫苗具有安全、稳定和高效免疫保护的特点，制备过程简单，在-20℃可保存半年以上，免疫使用剂量仅需0.2毫升/只雏鸡，免疫保护时间至少可达60天，可以广泛用作预防和控制鸡传染性法氏囊病的药物。
本发明利用高压力技术制备得到IBDV疫苗，该疫苗可以有效地诱发雏鸡免疫反应，产生高效价的中和抗体，达到保护的目的，且产品稳定性好，不会引起雏鸡发病；与传统方法制备的疫苗相比，高压力疫苗完全采用物理方法制备而无化学试剂(如甲醛等)参与，尚未观察到任何副作用。高压力处理过程操作简便，针对IBDV血清亚型多、抗原变异快的特点，只要能得到足够量的天然病毒即可较快地得到相应的疫苗产品，此外利用高压力技术生产疫苗周期短，成本较低。高压力疫苗可广泛用于预防和控制鸡传染性法氏囊病。
由于高压力技术适用于IBDV所有血清亚型，下面以IBDVNM和LH毒株为例对本发明的技术特征作进一步描述。
实施例1.用高压力方法制备IBDV疫苗(细胞增殖病毒)按常规方法(戴华生等编著，新实验病毒学，中国学术出版社，1983，108)用鸡胚成纤维细胞增殖IBDV NM毒株，收获的培养液在-20℃和25℃冻融3次、10000转/分钟离心10分钟去沉淀，所得含病毒上清液作为原材料，将此材料无气泡密封于塑料管中并置入高压力容器，与压力发生器相连，以乙醇为压力传送介质。本例中所采用的处理条件为800大气压、10℃、6小时，经处理即得到高压力IBDV疫苗。
实施例2.用高压力方法制备IBDV疫苗(鸡胚增殖病毒)按常规方法(黄祯祥主编，医学病毒学基础及实验技术，科技出版社，1990，124)经鸡胚绒毛尿囊膜接种IBDV NM毒株进行增殖(每个鸡胚接种0.1毫升种毒)，收获的绒毛尿囊膜和尿囊液经匀浆、-20℃和25℃冻融3次、10000转/分钟离心10分钟去沉淀，所得含病毒上清液作为原材料，将此材料无气泡密封于塑料管中并置入高压容器，与压力发生器相连，以乙醇为压力传送介质。本例中所采用的处理条件为6000大气压、25℃、20分钟，经处理即得到高压力IBDV疫苗。
实施例3.用高压力方法制备IBDV疫苗(法氏囊病毒)采集感染IBDV LH毒株并已发病的鸡的法氏囊，匀浆，用生理盐水10倍(V/V)稀释、-20℃和25℃冻融3次、10000转/分钟离心10分钟去沉淀，所得含病毒上清液作为原材料，将此材料无气泡密封于塑料管中并置入高压容器，与压力发生器相连，以乙醇为压力传送介质。本例中所采用的处理条件为3000大气压、0℃、3小时，经处理即得到IBDV高压疫苗。
实施例4.高压力方法制备的IBDV疫苗(见实施例1)感染性测定按常规方法(戴华生等编著，新实验病毒学，中国学术出版社，1983，30，113)测定并计算实施例1中的高压力IBDV疫苗和天然IBDV对照对于鸡胚成纤维细胞的半致死量(TCID50)。测定结果天然IBDV对照的TCID50值达10-6，有较高的感染性，而高压力IBDV疫苗不导致鸡胚成纤维细胞发生细胞病变，即失去了鸡胚成纤维细胞感染活性。
实施例5.高压力方法制备的IBDV疫苗(见实施例2)感染性测定将实施例2中的高压力IBDV疫苗和天然IBDV对照分别接种(腿部肌肉注射)7日龄SPF雏鸡5只，每只0.8毫升，逐日观察雏鸡死亡情况。测定结果7日内对照组5只鸡全部死亡，病理解剖表明有典型发病症状(如前所述)，而疫苗组5只鸡无一死亡，且无发病症状，这说明该高压力疫苗无致病性。
实施例6.高压力方法制备的IBDV疫苗(见实施例3)感染性测定按常规方法(黄祯祥主编，医学病毒学基础及实验技术，科技出版社，1990，124)将实施例3的高压力IBDV疫苗和天然IBDV对照分别接种SPF鸡胚绒毛尿囊膜(每个鸡胚接种0.1毫升)，每组5只鸡胚，每只鸡胚接种0.1毫升，逐日观察鸡胚死亡情况。测定结果7天内对照组5只鸡胚全部死亡，而高压疫苗组5只鸡胚无一死亡，说明该疫苗无鸡胚感染活性。
实施例7.高压力方法制备的IBDV疫苗(见实施例2)免疫性能测定以实施例2中IBDV疫苗为例测定高压力疫苗的免疫性能。7日龄SPF雏鸡10只分为二组非免疫对照组和高压力IBDV疫苗免疫组各5只，免疫组每只鸡腿部肌肉注射0.8毫升高压力IBDV疫苗进行免疫，对照组每只鸡注射等量的生理盐水。15日后以天然IBDV强毒株擦肛攻毒，观察雏鸡发病和死亡情况。测定结果60小时内对照组5只雏鸡全部死亡，且有明显发病症状(如前所述)，而高压力IBDV疫苗免疫组5只鸡无一死亡，仅有1只鸡有轻微发病症状(大腿肌肉轻度出血)。本结果说明本发明的高压力IBDV疫苗有比较好的免疫保护作用。
实施例8.高压力方法制备的IBDV疫苗(见实施例3)免疫性能测定以实施例3的IBDV疫苗为例测定高压力疫苗的免疫性能。17日龄SPF雏鸡18只分为二组非免疫对照组6只，高压力IBDV疫苗免疫组12只，免疫组鸡腿部肌肉注射高压力IBDV疫苗进行免疫，每只0.2毫升，同时对照组注射等量生理盐水，免疫40天后以天然IBDV强毒擦肛攻毒。测定结果非免疫对照组6只鸡在4天内死亡5只，死亡率为83％，而高压力IBDV疫苗免疫组12只鸡全部存活；病理解剖表明对照组6只鸡100％有典型发病症状(如前所述)，而免疫组12只鸡无一出现发病症状。免疫后血清IBDV中和抗体水平变化用琼脂糖抗原抗体双扩散试验测定(1.2％琼脂糖)(黄祯祥主编，医学病毒学基础及实验技术，科技出版社，1990，182-183)，免疫后第二周血清IBDV中和抗体效价即达1∶8，第四周血清抗体效价可达到1∶64，这说明本发明的高压力IBDV疫苗确能有效诱导血清IBDV抗体产生，达到免疫保护的目的。
权利要求
1.一种鸡传染性法氏囊病病毒疫苗，其特征在于它是采用高压力技术处理天然鸡传染性法氏囊病病毒原材料制得的病毒疫苗。
2.按权利要求1所述的鸡传染性法氏囊病病毒疫苗的制备方法，其特征在于是将天然鸡传染性法氏囊病病毒原材料置入高压力设备中处理，压力为800-6000大气压，温度为0-25℃，时间为20分钟-6小时。
3.按权利要求1所述的鸡传染性法氏囊病病毒疫苗的应用，其特征在于该病毒疫苗可用作预防和控制鸡传染性法氏囊病的药物。
全文摘要
一种鸡传染性法氏囊病病毒疫苗、高压力制备方法及应用。采用高压力技术制备得到IBDV疫苗,可以稳定有效地诱导雏鸡产生高效的中和抗体,达到免疫保护的目的,且高压力疫苗本身无致病性和副作用。高压力技术生产过程简单,周期短,成本低,对于不同病毒血清亚型可以很快得到相应的疫苗产品。高压力疫苗可广泛用作预防和控制鸡传染性法氏囊病的药物。
文档编号A61P31/14GK1247090SQ98111059
公开日2000年3月15日 申请日期1998年9月4日 优先权日1998年9月4日
发明者阮康成, 钱建飞, 田少敏, 邵国青, 唐国庆, 毛洪先 申请人:中国科学院上海生物化学研究所