专利名称：透明质酸锌抗消化性溃疡的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有透明质酸的锌复合物(络合物)、具有抗消化性溃疡作用的药物组合物，以及制备这种组合物的方法。
本发明还涉及透明质酸的锌复合物(络合物)，即透明质酸锌在制备抗消化性溃疡的组合物中的用途，以及治疗和预防消化性溃疡的方法。本发明还涉及透明质酸锌在防止消化性溃疡愈合后的再感染中的用途。
人们了解通常以其钠盐形式存在的称为透明质酸的大分子化合物已有50年以上历史。Meyer等人[《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)107，629(1934)]最早描述了透明质酸，它是具有高度粘性的天然氨基葡萄糖聚糖，其中含有可改变的β-1，3葡萄糖醛酸和β-1，4氨基葡萄糖部分，其分子量为50,000-几百万。透明质酸在所有哺乳动物的结缔组织中都有发现；它以较高水平存在于皮肤、眼睛玻璃体、滑液、脐带以及软骨组织中。
直到近几年，透明质酸已经以钠盐的形式用在治疗(主要用在眼科、皮肤病、手术、关节的治疗中)和化妆品中。透明质酸与碱金属、碱土金属、镁、铝、铵和取代的铵离子形成的盐可用作促进药物吸收的载体(参见比利时专利说明书904547)。透明质酸的重金属盐，如银盐，可用作杀真菌剂；其中金盐能用于治疗类风湿性关节炎(参见专利说明书WO 87/05517)。然而，已知银和金化合物有严重的副作用，即它们对免疫系统、haematopoietic器官和神经系统的有害作用[M.Shinogi，S.Maeizumi“金属硫蛋白的隔代诱发对银在组织中的分配和肝脂质的过氧化作用的影响(Effect of preinduction of metallothioneinon tissue distribution of silver and hepatic lipid peroxidation)”《生物药理学通报》(Biol.Pharm.Bull.)(日本)，4月，1993 16(4)，第372-374页；C.Masson等人Rev.Med.Interne(法国)5-7月，1992，13(3)第225-232(1992)]。
匈牙利专利说明书203372公开了去质子化的透明质酸与元素周期表第4周期第3族金属的离子例如锌离子的复合物(络合物)和透明质酸钴，其尤其对脚溃疡、褥疮等类似疾病有疗效，这些疗效是通过外用证实的。
现在已经发现，透明质酸的锌复合物(络合物)，即透明质酸锌具有显著的胃保护活性，因此可用于预防和治疗包括幽门螺旋杆菌诱导的溃疡在内的消化性溃疡。
消化性溃疡病是涉及很大一部分城市人口的复杂及多因素疾病。与此疾病的确切发病机理有关的许多问题有待回答。在最近5年中，由于幽门螺旋杆菌的“重新发现”而出现了新进展。人们通常接受的观点是，人体内消化性溃疡病的发生与感染幽门螺旋杆菌有关，但是另一方面，幽门螺旋杆菌不是导致消化性溃疡的全部原因。直到现在，消化性溃疡的治疗基本上没有改变虽然在文献中主要报道了杀死幽门螺旋杆菌的可能治疗方法，但是H2阻滞剂和质子泵抑制剂仍然是治疗所使用的药物(arsenal)中的最重要的必需成分。此外，对由非甾体抗炎药引起的胃-十二指肠损伤的治疗成为这方面的研究热点。
由任一上述两个因素所引起消化性溃疡，其特征可以是下述平衡，即在健康状况下存在于攻击性因素(诱发溃疡)和防卫性因素(保护胃免于发生溃疡)之间的平衡被打乱。因此，当攻击因素增强至超出一定限度和/或防卫性因素变弱时，就会产生溃疡。防卫性因素包括，例如胃粘膜的抵抗力，胃粘膜充足的血液供应，以及粘液的形成[H.Shay消化性溃疡的病因学，《美国消化系统疾病杂志》(Am.J.Dig.Dis.)6，29-49(1961)]。在攻击性因素中，占主导地位的是，盐酸和胃蛋白酶的分泌以及刺激这两种物质分泌的所有因素。病理性的迷走神经兴奋或胃泌素的形成增加，自身免疫机制，以及在一些情况下激素作用也会增加酸的分泌。此外，攻击性因素和防卫性因素之间的平衡也可被影响全身的损伤扰乱。因此，消化性溃疡是多因素病。用于治疗溃疡的活性剂是打算减弱攻击性因素的作用，和/或增强防卫性因素的作用。直到近几年，药理研究已经集中在减弱攻击性因素的作用方面，因此首要目标是调节酸-胃蛋白酶的活性。用于治疗溃疡的药物的目标首先是中和酸(抗酸药例如碳酸氢钠、或氢氧化铝)或抑制酸的分泌(H2阻滞剂，例如西咪替丁、法莫替丁，质子泵抑制剂，例如奥美拉唑)；只是最近，与发展用于杀死幽门螺旋杆菌的单一治疗相差甚远的、对能增强防卫性因素作用的活性剂的研究才变得更重要。
然而，可利用的增强防卫性因素的组合物的数量有限，并且表现出一些副作用。这些组合物是次柠檬酸铋胶体(CBS，DeNol)，硫糖铝和米索前列醇。CBS含有会引起毒理学问题的铋。硫糖铝是硫酸化蔗糖的碱性铝盐，具有一些副作用，例如恶心、呕吐、铝中毒等，米索前列醇是合成的前列腺素类似物，其会诱发肠活动增强或恶心。
从上面的描述可以看出，仍需要不伴有酸分泌增加的治疗溃疡的有效及安全的药物。当治疗的目的是阻止由胃刺激，胃损害作用，例如非甾体抗炎药如吲哚美辛、阿司匹林的胃损害作用导致的胃损害时，这类组合物能通过增强粘膜的保护机制而成功地使用。如果我们考虑到下面的数据，即目前在全世界范围内每天消耗一千万片以上的非甾体抗炎药，从而使其成为使用最广泛的一类药物，那么将来由于服用NSAID(非甾体抗炎药)而患有消化性溃疡的病人的数量可能会增加。
增强保护机制对于由幽门螺旋杆菌感染引起的溃疡也很重要，这是因为幽门螺旋杆菌会产生一定数量损害胃粘膜并给酸和胃蛋白酶提供通向胃上皮的自由通道的毒素和酶(脲酶、蛋白酶、过氧化氢酶、脂酶)。
为了满足上述要求，我们的目标集中在，通过试验透明质酸锌，即透明质酸的锌复合物(络合物)的胃保护活性来治疗消化性溃疡。根据我们的试验结果，透明质酸锌表现出了相当好的胃保护作用，看上去在上述作用领域，即在防止(预防)消化性溃疡形成，和/或治疗已形成的溃疡方面均非常有效。
因此，本发明涉及具有抗消化性溃疡作用的药物组合物，其中含有透明质酸的锌复合物(络合物)，即透明质酸锌作为活性成分；以及制备所述药物组合物的方法，所述方法包括，将活性成分透明质酸锌(用已知方法制备)与可治疗用载体和/或添加剂混合，并将混合物转变成药物组合物。
本发明还涉及透明质酸的锌复合物(络合物)在制备具有抗消化性溃疡作用的药物组合物中的用途，以及治疗和预防消化性溃疡的方法。
在文献中有已知的结构类似的胃保护化合物。已公开的日本专利申请6-48950描述了酸性多糖及其中的粘多糖的锌盐的抗胃溃疡作用，并列出了作为酸性多糖的得自藻类的海生琼脂胶，角叉菜胶，藻酸；作为粘多糖的透明质酸，肝素，硫酸软骨素；以及其它化合物，例如葡聚糖硫酸酯，羧甲基纤维素及类似物，和植物果胶酯酸。然而，依据此日本申请，酸性多糖的分子量约为数千，优选约为2万。透明质酸锌盐及其药理活性在实施例中则完全没有公开。
US专利说明书5,514,660描述了含有低聚糖型活性成分的药物组合物的抗溃疡作用，并在实施例中测试了这类化合物对由幽门螺旋杆菌诱导的溃疡的作用。透明质酸及其锌复合物在说明书中都没有涉及，并且没有提及任何伤口愈合作用。
通过多种药理试验证实了透明质酸锌的胃保护作用。这些试验使用了依据匈牙利专利说明书203372的透明质酸锌溶液。对用来制备透明质酸锌的透明质酸钠和氯化锌也进行了研究。
在用来证明透明质酸锌的胃保护作用的药理试验中，还研究了随着透明质酸锌分子量的改变和随着纯度的不同，效力是怎样变化的。为了这个目的，测试分子量分别为750,000、900,000和1,200,000的透明质酸锌(I)、透明质酸锌(II)和透明质酸锌(III)的溶液，其中试验中的样品都具有最高纯度级(“purissimum”)。透明质酸锌(M)是“purum”质量级，是由低级质量的材料制备的。我们最后的目标是，将透明质酸锌与使用最广泛的胃保护药之一的硫糖铝进行比较。
对于本领域技术人员显而易见的是，化合物例如透明质酸类化合物由于含有具有不同聚合度和分子量限度很宽的分子的混合物，所以不能用精确的分子量值来描述其特征。对于透明质酸锌，与所有其它透明质酸类化合物类似，分子量是指分子混合物的平均分子量值，其中混合物分子具有不同的、通过给定的测定分子量的方法测定的聚合度。
将具有不同分子量的透明质酸锌复合物制成1.0％的水溶液以用于药理试验中。下述实施例描述了1.0％的透明质酸锌溶液的制备步骤。如果不是特别指明，那么百分比是重量/体积％值。实施例1制备1.0％的透明质酸锌溶液在不停搅拌下，将透明质酸钠(1.0g)在30ml水中溶胀，加入18.75ml 0.1摩尔的氯化锌溶液后，用蒸馏水将溶液加至100ml。
下表总结了用于制备在药理试验中使用的、具有不同分子量和纯度的透明质酸锌溶液的透明质酸钠的特征。<
>为了进行试验，将使用量的含有具有不同分子量和纯度的透明质酸锌以及透明质酸钠和氯化锌的溶液用蒸馏水稀释，并以10ml/kg体重的体积给药。将使用量的作为参照物质的硫糖铝以及吲哚美辛和木炭粉末悬浮在1-2滴吐温80中，用生理盐水(0.9％重量体积比的氯化钠水溶液)稀释至5ml/kg体重。将使用量的N-乙基马来酰亚胺和NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)稀释至5ml/kg体重。把血小板活化因子(PAF)溶解在0.25％(重量/体积)的牛血清白蛋白中，其中牛血清白蛋白是用0.9％(重量/体积)的氯化钠溶液配制的。所用物质的来源如下。
透明质酸锌(I)、(II)、(III)和(M)以及透明质酸钠(GedeonRichter)；氯化锌(Merck)；硫糖铝(UlcerlminRChugai)；吲哚美辛(Sigma)；N-乙基马来酰亚胺(Fluka)；NG-硝基-L-精氨酸甲酯(Sigma)；L-精氨酸(游离碱)(Sigma)；D-精氨酸(游离碱)(Sigma)；牛血清白蛋白(Sigma)；木炭(Sigma)。
用下述方法研究透明质酸锌复合物的药理活性。
1.抑制由酸化乙醇诱导的胃损伤使用体重为120-150g的雌性RG-Wistar大鼠。试验前，将大鼠禁食24小时，但是喂以任意量的水和。
按照与A.Robert[胃肠病学(Gastroenterology)77，7661(1979)]描述的方法相类似的方法进行试验。
使用酸化乙醇(50ml无水乙醇和1ml浓盐酸的混合物)作为强刺激剂。酸化乙醇的剂量是0.5ml/100g体重，通过胃内给药。在酸化乙醇攻击胃之前30分钟，将测试化合物口服给药。当研究测试化合物的作用持续时间时，在酸化乙醇诱导刺激作用之前60或120分钟，将测试材料给药。用酸化乙醇处理1小时后，将大鼠拉颈处死。取出胃，沿着胃大弯切开，并柔和地洗涤。分析纵向出血性损害的长度。
ED50值定义为使溃疡指数下降50％的剂量。
为了研究测试化合物的作用机制，通过将NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)腹膜内给药，也研究了内源性NO对由酸化乙醇诱导的胃损害的发展的影响。在以测试化合物给药前15分钟，以25mg/kg的剂量腹腔注射L-NAME。在随后的试验中，将测试化合物(p.o.)、L-NAME(25mg/kg i.p.)、L-精氨酸(400mg/kg i.v.)分别在酸化乙醇灌胃之前30、45或60分钟给药。
下表总结了试验结果。表中所示对照组仅给药载体(蒸馏水)以代替透明质酸锌。
表1透明质酸锌(I)对酸化乙醇诱导的胃损伤的作用N 剂量 损伤长度/胃 抑制％mg/kg p.o.对照 12 -82.4±11.5 -透明质酸锌 6 195.3±14.8 0(I) 13 10 53.6±7.3*35.07 50 27.4±7.6*66.713 100 5.4±2.0*93.4*与对照组比较P＜0.05ED50＝15.9mg/kg/10ml p.o.
表2透明质酸锌(II)对酸化乙醇诱导的胃损伤的作用N剂量 损伤长度/胃 抑制％mg/kg p.o. mm±S.E.M.对照21- 83.7±7.3 -透明质酸锌 1310 48.0±10.9*42.7(II)6 25 19.0±4.4*77.38 50 13.3±4.8*84.18 100 1.6±0.5*98.1*与对照组比较P＜0.05ED50＝11.1mg/kg/10ml p.o.
表3透明质酸锌(III)对酸化乙醇诱导的胃损伤的作用N 剂量 损伤长度/胃抑制％mg/kg p.o. mm±S.E.M.对照14 - 69.4±12.8-透明质酸锌 14 10 98.4±12.70(III) 725 43.7±7.7 37.013 50 14.9±4.5*78.581009.9±3.5*85.7*与对照组比较P＜0.05ED50＝33.18mg/kg/10ml p.o.
表4透明质酸锌(M)对酸化乙醇诱导的胃损伤的作用N 剂量 损伤长度/胃 抑制％mg/kg p.o. mm±S.E.M.对照 18 - 110.7±16.0 -透明质酸锌 18 1057.9±8.2*47.7(M) 62533.3±7.7*69.965013.0±3.0*88.36100 2.7±1.4*97.6*与对照组比较P＜0.05ED50＝10.4mg/kg/10ml p.o.-30分钟表5透明质酸钠对酸化乙醇诱导的胃损伤的作用N 剂量 损伤长度/胃 抑制％mg/kg p.o.mm±S.E.M.对照 18 - 77.8±10.3 -透明质酸钠18 5065.7±9.8 15.618 100 49.9±6.0*35.9*与对照组比较P＜0.05表6氯化锌对酸化乙醇诱导的胃损伤的作用N 剂量 损伤长度/胃 抑制％mg/kg p.o.mm±S.E.M.对照 10 - 51.5±13.8 -氯化锌10 3.2 29.0±4.043.710 6.4 24.7±7.752.010 12.8 6.7±1.6*87.0*与对照组比较P＜0.05ED50＝4.5mg/kg/10ml p.o.-30分钟表7硫糖铝对酸化乙醇诱导的胃损伤的作用N 剂量 损伤长度/胃 抑制％mg/kg p.o. mm±S.E.M.对照 4 - 60.8±14.6-硫糖铝 4 50 64.0±25.904 100 15.0±5.5*75.34 400 7.5±3.0*87.7*与对照组比较P＜0.05ED50＝112.2mg/kg/p.o.
表8将预处理时间增加到60分钟后透明质酸锌(M)对酸化乙醇诱导的胃损伤的作用N剂量 损伤长度/胃 抑制％mg/kg p.o.mm±S.E.M.对照 18 - 69.7±7.1-透明质酸锌 11 25 49.7±5.928.7(M) 12 50 37.9±12.2*45.612 1004.6±1.7*93.4*与对照组比较P＜0.05ED50＝44.1mg/kg/10ml p.o.-60分钟表9将预处理时间增加到120分钟后透明质酸锌(M)对酸化乙醇诱导的胃损伤的作用N 剂量 损伤长度/胃抑制％mg/kg p.o.mm±S.E.M.对照 12 - 60.6±7.4 -透明质酸锌 12 2553.2±7.7 12.2(M) 12 5032.8±7.5*45.912 100 10.3±4.6*83.0*与对照组比较P＜0.05ED50＝53.0mg/kg/10ml p.o.-120分钟表10NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)对透明质酸锌(M)(ZH/M)抗酸化乙醇诱导的胃损伤的保护作用的影响N 剂量 损伤长度/胃抑制a％mg/kg p.o. mm±S.E.M.载体+载体 20 0+0 60.5±6.8 -载体+ZH/M 20 0+5018.4±2.3*69.6L-NAME+ZH/M 20 25+50 41.2±4.6*b31.9L-Arg+L-NAME+ZH/M 21 400+25+50 24.1±4.4*c60.2D-Arg+L-NAME+ZH/M 21 400+25+5031.2±3.5*d48.4a与载体+载体组比较*与载体+载体组比较P＜0.05b与载体+ZH/M组比较P＜0.05c与载体+L-NAME+ZH/M组比较P＜0.05d与载体+ZH/M组比较P＜0.05表11NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)对氯化锌抗酸化乙醇诱导的胃损伤的保护作用的影响N 剂量 损伤长度/胃 抑制a％mg/kg p.o. mm±S.E.M.载体+载体 23 0+0 74.3±13.5 -载体+氯化锌22 0+25 8.0±2.6*89.2L-NAME+氯化锌 22 25+25 19.9±5.5*73.2a与载体+载体组比较*与载体+载体组比较P＜0.05从表1、2、3和4所示结果可以看出，具有不同分子量和纯度的透明质酸锌具有显著的胃保护作用口服给药后，它们能以剂量-依赖方式抑制由酸化乙醇诱导的胃损伤的形成。各种透明质酸锌的ED50值为透明质酸锌(I)15.9mg/kg；透明质酸锌(II)11.1mg/kg；透明质酸锌(III)33.2mg/kg；透明质酸锌(M)10.4mg/kg。与透明质酸锌复合物(I)、(II)、(III)和(M)相反，将透明质酸钠以100mg/kg剂量口服给药，对酸化乙醇诱导的胃损伤仅起36％的保护作用(表5)。氯化锌口服给药后的ED50值为4.5mg/kg(表6)。用作参照化合物的、已知细胞保护剂硫糖铝所表现出的活性比测试的透明质酸锌要弱(其ED50值为112mg/kg)(表7)。
研究了透明质酸锌复合物(M)的作用持续时间。增加预处理时间导致ED50值增加(表8和9)。从这些结果中可以看出，透明质酸锌(M)不以不可逆方式与胃粘膜结合。
使用氧化氮(II)生物合成抑制剂即NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)，研究了透明质酸锌的细胞保护作用与内源性NO之间的关系。因为考虑到透明质酸锌(II)和透明质酸锌(M)在酸化乙醇试验中表现出相同的活性，所以后者是这项试验的唯一受试对象。
从所得结果(表10)中可以明显看出，用L-NAME预处理会使透明质酸锌(M)的胃保护活性显著降低；用L-精氨酸预处理会消除L-NAME的这种影响，但是用D-精氨酸预处理则不能消除这种影响。另一方面，在此试验中氯化锌的保护作用不受L-NAME预处理的影响(表11)。没有测试L-NAME对透明质酸钠保护作用的影响，这是因为，透明质酸钠的胃保护作用太弱(表5)以致于不能精确地进行评价。这种现象，即透明质酸锌的保护作用被L-NAME显著地降低，而氯化锌的保护作用则不受影响，看来是能证明NO可能在透明质酸锌(M)的细胞保护作用过程中起作用。
2.抑制由吲哚美辛诱导的胃损伤使用体重为120-150g的雌性RG Wistar大鼠。试验前，将大鼠禁食24小时，但是喂以任意量的水。给大鼠皮下注射40mg/kg剂量的吲哚美辛30分钟后，将测试化合物口服给药。用刺激性吲哚美辛给药4小时后，将大鼠拉颈处死。取出胃，沿着胃大弯处切开，在胃腺上计数出血性损害的数目。
ED50值表示保护胃使吲哚美辛的损害作用被抑制50％所需的剂量。
下表总结了试验结果。表中所示对照组仅给药载体(蒸馏水)以代替透明质酸锌。
表12透明质酸锌(I)对吲哚美辛诱导的胃损伤的作用N 剂量 损伤数目/胃抑制％mg/kg p.o. ±S.E.M对照 6 - 8.3±2.1 -透明质酸锌6 1.0 4.7±2.1 43.4(I) 6 10.0 3.7±1.9 55.46 100.0 0.8±0.4*90.4*与对照组比较P＜0.05ED50＝2.8mg/kg/10ml p.o.
表13透明质酸锌(II)对吲哚美辛诱导的胃损伤的作用N 剂量损伤数目/胃 抑制％mg/kg p.o. ±S.E.M.对照14 - 12.9±2.7 -透明质酸锌(II) 14 1.0 8.8±2.1 31.8对照14 - 17.0±3.3 -透明质酸锌(II) 14 10.07.4±1.9*56.57 100.0 3.7±0.8*78.2*与对照组比较P＜0.05ED50＝5.79mg/kg/10ml p.o.
表14透明质酸锌(III)对吲哚美辛诱导的胃损伤的作用N 剂量损伤数目/胃 抑制％mg/kg p.o. ±S.E.M对照 7 -18.4±3.4 -透明质酸锌7 1.0 17.0±4.5 7.6(III) 7 10.0 7.9±2.5*57.67 100.03.0±1.4*83.7*与对照组比较P＜0.05ED50＝10.2mg/kg/10ml p.o.
表15透明质酸锌(M)对吲哚美辛诱导的胃损伤的作用N 剂量 损伤数目/胃 抑制％mg/kg p.o. ±S.E.M对照 24 - 18.5±2.9 -透明质酸锌 18 1.015.6±6.2 15.7(M)12 10.0 5.9±1.9*68.16 100.0 2.0±0.9*89.2*与对照组比较P＜0.05ED50＝6.2mg/kg/10ml p.o.
表16透明质酸钠和氯化锌对吲哚美辛诱导的胃损伤的作用N剂量 损伤数目/胃 抑制％mg/kg p.o. ±S.E.M.对照 18 - 22.9±3.1 -透明质酸钠 18 100 14.6±3.3 36.2对照 12 - 12.2±3.6 -氯化锌 11 2515.1±3.7 0表17硫糖铝对吲哚美辛诱导的胃损伤的作用N 剂量 损伤数目/胃 抑制％mg/kg p.o. ±S.E.M对照 11 - 16.9±3.4-硫糖铝 11 40 14.4±4.814.811 80 6.4±2.2*62.111 160 2.9±1.4*82.8*与对照组比较P＜0.05ED50＝74.9mg/kg p.o.
从试验结果中可以看出，透明质酸锌(I)、(II)、(III)和(M)对吲哚美辛诱导的胃损伤有效(表12、13、14和15)。从结果中还可以明显看出，透明质酸锌以剂量-依赖方式抑制由吲哚美辛诱导的胃损伤的发展。口服给药后，其ED50值分别为2.8mg/kg、5.8mg/kg、10.2mg/kg和6.2mg/kg(参见表12、13、14和15)。
从表16的数据可明显看出，透明质酸钠和氯化锌不提供任何保护作用以使胃粘膜免受吲哚美辛的损害。此外，从硫糖铝的较高ED50值(74.9mg/kg)(表17)可以看出，透明质酸锌的保护作用比硫糖铝强。
3.抑制由紧张诱导的胃损伤使用体重为120-150g的雌性RG-Wistar大鼠。试验前，将大鼠禁食24小时，但是喂以任意量的水。按照与Senay等人.(1967).[Proc.Soc.Exp.Biol.Med.124，1221，(1967)]描述的方法相类似的方法进行试验。
由于在酸化乙醇试验中透明质酸锌(II)和透明质酸锌(M)被证实具有同等活性，因此在紧张试验模型中仅用透明质酸锌(M)进行试验。
将测试化合物口服给药给药。30分钟后，把大鼠固定在塑料监禁盒中，然后放在4℃-8℃的冰箱中。4小时后，将大鼠从冰箱和监禁盒中取出，1小时后将其拉颈处死。取出胃，沿着胃大弯切开，用0-3级给出血性损伤打分没受任何损伤的胃是0分，仅有几处出血性损伤的胃是1分，有10处以上损伤的胃是2分，有大量损伤的胃是3分。
ED50值定义为使胃损伤的分数下降50％所需的剂量。试验结果见下表。
表18透明质酸锌(M)对紧张诱导的胃损伤的作用N剂量 损伤分数/胃 抑制％mg/kg p.o. ±S.E.M.对照 10- 1.7±0.4 -透明质酸锌 5 251.0±0.3 41.2(M) 5 500.4±0.2*76.55 100 0*100*与对照组比较P＜0.05ED50＝29.4mg/kg/10ml p.o.-30分钟表19透明质酸钠和氯化锌对紧张诱导的胃损伤的作用N 剂量损伤分数/胃 抑制％mg/kg p.o. ±S.E.M.对照30 - 1.5±0.2 -透明质酸钠 29 100 0.9±0.2*40.0氯化锌 29 25 0.6±0.2*40.0各种紧张情境，例如寒冷和相当程度的运动限制，会诱导大鼠的急性胃损伤。从试验结果中可以看出，透明质酸锌(M)以剂量-依赖方式防止了寒冷-限制性紧张的胃损伤作用，且口服给药时ED50值＝29.4mg/kg(表18)。相反，透明质酸钠和氯化锌对寒冷-限制性紧张诱导的胃损伤仅有轻微的保护作用(表19)。
4.抑制由血小板活化因子(PAF)诱导的胃损伤使用体重为200-250g的雄性RG-Wistar大鼠。试验前，将大鼠禁食24小时，但是喂以任意量的水。按照与Wallace和Whittle在(1986).[英国药理学杂志(Br.J.Pharmac).89，415，(1986)]中描述的方法相类似的方法进行试验。按1g/kg的剂量以10ml/kg的体积给大鼠腹腔注射乌拉坦使其麻醉。然后制备股静脉插管以给予致溃疡的PAF。手术后，将PAF以0.1ml/分钟的速度静脉输注10分钟，剂量是200ng/kg/min。在输注PAF前30分钟给予测试化合物。输注PAF1小时后，将大鼠拉颈处死，取出胃，沿着胃大弯切开。通过0-3打分体系评价出血性侵蚀。没受任何损害的胃是0分，与正常胃相比有轻微变化的胃是1分，有中度损伤的胃是2分，有严重的、弥散性充血和/或出血的胃是3分。
PAF(血小板活化因子)是内源性磷脂，现在已经被描述为最强的致胃溃疡物质。其内源性释放可能在一些形式的消化性溃疡的发生中起作用[Rosam等人(1986)；Wallace等人(1986)]。
试验结果列在下表20中。
表20透明质酸锌(M)、透明质酸钠和氯化锌对血小板活化因子(PAF)诱导的胃损伤的作用N 剂量 损伤分数/胃 抑制％mg/kg p.o.±S.E.M.对照32 - 2.2±0.1 -透明质酸锌(M) 550 1.6±0.4 27.315 1001.3±0.2*40.9透明质酸钠 51002.6±0.2a0氯化锌 15 25 1.7±0.2*b22.7*与对照组比较P＜0.05a与透明质酸锌(M)100mg/kg组相比P＜0.05b与透明质酸钠组相比P＜0.05依据上述紧张试验模型，在PAF-诱导模型中仅对透明质酸锌(M)进行了测试。透明质酸锌(M)强有力地降低了PAF的致溃疡作用，而透明质酸钠没有表现出这种作用。氯化锌表现出一些抗PAF的保护作用；然而，其作用比透明质酸锌复合物弱很多(表20)。
5.抑制由乙酸诱导的慢性胃溃疡使用体重为120-150g的雌性RG-Wistar大鼠。手术前，将大鼠禁食24小时，但是喂以任意量的水。
按照与Takagi等人(1969)描述的方法相类似的方法，在轻度乙醚麻醉下，将20％(v/v)的乙酸以每只动物25μl的剂量注射到大鼠的胃壁中来诱发慢性胃溃疡。手术5天后开始给大鼠口服给药测试化合物，然后每天口服给药一次直到第14天为止。在第15天，把大鼠杀死，将其胃解剖。通过测定溃疡的直径来评价溃疡的严重性，并计算溃疡的面积。
愈合效果以对照组和测试组的差值百分比表示。
乙酸刺激大鼠胃壁并导致形状明显的溃疡形成，溃疡在形状和显微照片方面都与人的溃疡非常相似。试验结果列在下表中。
表21透明质酸锌(II)对乙酸诱导的慢性胃溃疡的作用N剂量溃疡面积 对愈合的影响mg/kg p.o. mm2±S.E.M. ％对照27 - 8.9±1.2 -透明质酸锌(II) 10 0.016.2±1.0 30.3↑10 0.1 5.8±1.1 34.8↑10 1.0 3.7±0.6*58.4↑↑愈合速度加快*与对照组相比P＜0.05
表22具有不同分子量的透明质酸锌对乙酸诱导的慢性胃溃疡的作用N 剂量溃疡面积 对愈合的影响mg/kg p.o. mm2±S.E.M. ％对照 9 -9.2±1.6 -透明质酸锌(I)10 1.0 10.0±2.3 8.8↓对照 27 - 8.9±1.2 -透明质酸锌(II) 10 1.0 3.7±0.6*58.4↑对照 9- 9.2±1.6 -透明质酸锌(III) 10 1.0 6.8±0.8 26.1↑↓愈合速度减慢 ↑愈合速度加快表23硫糖铝对乙酸诱导的慢性胃溃疡的作用N 剂量 溃疡面积 对愈合的影响mg/kg p.o. mm2±S.E.M. ％对照 9 - 5.7±1.2 -硫糖铝 101006.7±1.5 18.0↓对照 10- 9.2±1.6 -硫糖铝 105004.3±1.3*53.0↑↓愈合速度减慢 ↑愈合速度加快*与对照组相比P＜0.05表24透明质酸锌(M)对乙酸诱导的慢性胃溃疡的作用N 剂量溃疡面积 对愈合的影响mg/kg p.o.mm2±S.E.M.％对照 10- 12.9±2.5-透明质酸锌(M) 100.19.4±2.3 27.1↑9 1.07.6±1.4 41.1↑↑愈合速度加快透明质酸锌(II)促进了乙酸诱导的慢性胃溃疡的愈合(表21)。以1mg/kg的剂量给药时，观察到了显著变化(p＜0.005)；然而，甚至以0.01mg/kg的剂量也可测试到不可忽略不计的治愈效果。以1.0mg/kg剂量给药时，无论透明质酸锌(I)还是透明质酸锌(III)对慢性溃疡的愈合均无效果(表22)。
如表23所示，参照化合物硫糖铝促进胃溃疡愈合的作用也比透明质酸锌(II)弱。硫糖铝的剂量必须增加到500mg/kg时才能使愈合效果增加53％。
透明质酸锌(M)也促进了乙酸诱导的溃疡的愈合，然而，促进效果不如透明质酸锌(II)显著。透明质酸锌(M)在1mg/kg的剂量表现出了其最大活性，此结果证实了上述观测，即不同起源的透明质酸锌在作用效果方面彼此之间的差异不显著(表24和
图1)。
6.抑制由吲哚美辛诱导的肠溃疡使用未禁食的、体重为120-150g的雌性RG-Wistar大鼠。将吲哚美辛以15mg/kg的剂量口服给药来诱导肠溃疡。将测试化合物在48小时期间内以24小时的相等给药间隔口服给药3次。测试化合物第一次给药是在吲哚美辛给药前60分钟。在测试化合物第一次给药72小时后，将大鼠杀死。对照组的大鼠口服载体以替代测试化合物，正常大鼠表示未禁食、未处理过的大鼠。
取出从幽门到盲肠的小肠部分，置于37℃的0.9％(w/v)氯化钠溶液中，通过聚乙烯套管将小肠一端与BP记录仪相连。将制备的肠段(preparatum)两端都扎起来以后，提高小肠内压直到肠壁溃疡处出现气泡为止。压力以Hgmm表示，并指示拉伸强度(TS)。试验结果示于表25中。
表25透明质酸锌(II)对吲哚美辛诱导的肠溃疡的作用N 剂量作为溃疡指数的肠壁拉伸强度mg/kg p.o.Hgmm±S.E.M.正常 7 -227.1±7.6对照 18载体 16.7±6.0透明质酸锌(II) 7 3×1 27.9±8.98 3×1041.3±10.9*8 3×100 48.8±11.3**与对照组比较P＜0.05由试验结果中可以看出，透明质酸锌(II)具有保护肠壁抗吲哚美辛诱导的溃疡的作用。以10mg/kg和100mg/kg的剂量给药时，与对照组相比，肠壁的拉伸强度几乎增加了3倍。然而，拉伸强度的增加并没伴有溃疡的显著下降(表25)。
7.在木炭推进试验中对胃肠蠕动性的抑制除了用不同的急性和慢性模型测定了透明质酸锌的活性以外，还研究了透明质酸锌对胃肠蠕动性是否有影响。
使用体重为120-140g的雌性RG-Wistar大鼠进行试验。试验前，将大鼠禁食24小时，但是喂以任意量的水。按照与P.A.Janssen和A.J.Jageneau在[J.Pharm.Pharmacol.9，381(1957)]中描述的方法相类似的方法进行试验。
测试化合物以100mg/kg的剂量口服给药。对照组大鼠灌以生理盐水以替代测试化合物。30分钟后，将5％(w/v)的木炭悬浮液以每只动物0.5ml的用量经口施给。用木炭处理60分钟后，将大鼠拉颈处死。取出从幽门到盲肠的肠部分，测定其长度以及木炭悬浮液穿越的距离。
蠕动性用木炭悬浮液穿越的长度与整个肠长度的比值表示。结果见下表。
表26透明质酸锌(I)、(II)和(III)对胃肠蠕动性的影响N 剂量 肠的长度 木炭悬浮液 比值**mg/kg p.o. mm±S.E.M.的推进距离mm±S.E.M.对照5 - 766±2.0604±3.1 0.79±0.04透明质酸锌(I) 5 100916±3.4718±5.6 0.79±0.07透明质酸锌(II) 5 100792±2.7610±3.9 0.77±0.04透明质酸锌(III) 5 100768±3.868±2.50.89±0.03**与对照组比较P＜0.05**木炭悬浮液穿越的长度与整个肠长度的比值表27透明质酸锌(M)对胃肠蠕动性的影响N 剂量 肠的长度木炭悬浮液比值**mg/kg p.o. mm±S.E.M. 的推进距离mm±S.E.M.对照6 - 782±2.3 688±4.0 0.88±0.03透明质酸锌(M) 6 100 788±2.5 655±3.9 0.83±0.03**木炭悬浮液穿越的长度与整个肠长度的比值从试验结果(表26和27)可以看出，透明质酸锌(I)和(II)以及(M)对肠蠕动性均无任何影响胃肠蠕动性没有变化证实了这些透明质酸锌不与胃粘膜不可逆地粘着，另一方面，它们不刺激肠而致肠活动过度。
在一些溃疡试验中比较了具有不同分子量的透明质酸锌的作用效力，我们惊奇地发现，在胃保护活性和分子量之间存在一定的关系。从前面的试验中可以看出，分子量在700,000-1,200,000道尔顿之间的透明质酸锌中，最有效的是分子量约为900,000道尔顿的透明质酸锌。进一步增加分子量并没能使效果提高。我们从此试验结果中得出的结论是，分子量在获得最佳效果中具有突出作用。
抗幽门螺旋杆菌作用的研究使用从患有不同溃疡的病人的胃活组织检查样本中培养的幽门螺旋杆菌菌株进行这些研究。用1％(w/w)的De-Nol(枸橼酸铋胶体(colloidal bismuth subcitrate))溶液作为参照物质。使用添加有10％牛血的琼脂培养基。用不含有任何测试化合物的培养皿作为对照。把接种的培养皿在含有5％氧气和7-8％二氧化碳的空气中于37℃培养3-5天。
最小抑制浓度(MIC)值被认为是，能将在对照培养皿上很好地繁殖的细菌的生长(繁殖)全部抑制的测试物质的最小浓度。下表列出了在试验菌株中测定的透明质酸锌复合物和De-Nol的MIC值。
从上表的数据中可明显看出，透明质酸锌抗幽门螺旋杆菌的体外活性与用在治疗中的De-Nol的活性相等。这一事实是不同寻常的，因为含有铋的组合物具有比较严重的副作用(毒性问题；其吞服令病人感觉不适)，因此使用透明质酸锌复合物可避免De-Nol的这些副作用。结论本发明中的研究证实，不同分子量的透明质酸锌具有显著的胃保护活性。用几种急性和慢性胃溃疡模型研究了其抗溃疡作用，并在大多数所述模型中将其与众所周知的胃保护药硫糖铝进行了比较。
结果证实，所有类型的透明质酸锌都是有效的细胞保护剂，因为其能保护胃粘膜抗酸化乙醇的损害作用。从试验结果中可推断出，无论用来制备透明质酸锌的原料的质量如何(“purum”或“puriss”)，分子量在700,000-1,200,000道尔顿之间的透明质酸锌是有效的细胞保护剂。分子量为900,000道尔顿的透明质酸锌的效果最佳。
延长预处理时间后，细胞保护作用仅有很小程度的降低，这一事实表明透明质酸锌具有不伴随不利的、不可逆改变的持续活性。我们的试验打算阐明透明质酸锌的作用机制，此试验仅是用基于上述原料的“purum”质量的透明质酸锌进行的，试验结果看来能证实，透明质酸锌是通过既不与氯化锌相同也不与透明质酸钠相同的机制来发挥其胃保护作用的。为了弄清楚透明质酸锌的作用机制，我们研究了内源性NO的作用。试验结果表明，NO可能在透明质酸锌发挥细胞保护作用的过程中起作用。这是很重要的，因为近来致力于胃保护作用与内源性NO之间可能关系的研究工作正在不断增加。根据一些观点(Konturek等人1994)，推断从L-精氨酸中生物合成的NO(Moncada等人1991)参与了不同的抗溃疡药物例如含铝抗酸剂的胃保护作用。此外，也显示出内源性NO在胃粘膜血流中(Lippe等人1992)以及在肥大细胞反应性中(Salvemini等人1994)起调节作用。
从上述试验结果中也可以看出，透明质酸锌胃保护作用的力度也超过了(一个数量级的)代表性的抗溃疡药硫糖铝。
非甾体抗炎药(NSAID)引起胃损伤或更严重情况下引起胃溃疡，这是因为它们直接损伤胃粘膜，具有局部刺激作用，以及由于对前列腺素合成的系统抑制而具有间接的不利作用。经证明，透明质酸锌(I)、(II)、(III)和(M)也能有效地抗吲哚美辛诱导的胃损伤作用。比较透明质酸锌(II)与透明质酸锌(M)的作用后发现，其ED50值近似相等(分别是5.8mg/kg和6.2mg/kg)，再加上在酸化乙醇诱导的胃损伤试验中观察到的结果，可得出这样的结论，即无论制备透明质酸锌的原料怎样(“purum”或“puriss”)，透明质酸锌都具有相同的胃保护活性。
吲哚美辛试验的结果还支持这样的观点，即透明质酸锌不仅仅只是胃腔和胃粘膜之间的简单物化屏障，因为其作用不仅在口服后显示(参见酸化乙醇试验)，皮下施以吲哚美辛后也能显示其作用。
还可以进一步推断出，透明质酸锌能保护胃粘膜抗吲哚美辛损伤作用。此外，透明质酸锌的保护作用也超过了硫糖铝。
用紧张模型进行的试验结果进一步提供了透明质酸锌具有胃保护作用的证据。这些试验非常重要，因为紧张性溃疡的其中一种主要原因可能是组胺从肥大细胞中过度释放，不能排除这样一种可能性，即透明质酸锌抗紧张诱导性损伤的显著胃保护作用可能与其假设的肥大细胞稳定作用有关。
PAF诱导胃损伤的试验结果进一步支持了在急性模型中证明的观察结果，即透明质酸锌具有特别的胃保护作用，因为透明质酸锌也能保护胃粘膜以对抗PAF的损伤作用。此外，此研究结果还提供了进一步的证据，以证明透明质酸锌不仅是通过形成胃粘膜的物化屏障来保护它不受局部作用的化学物质的损伤作用，而且是通过激活胃粘膜的保护机制来发挥保护作用的。
在乙酸诱导的慢性溃疡模型中获得的试验结果的最重要之处在于，其证明了这样的观察，即与例如H2阻滞剂不同，透明质酸锌不仅在急性模型中具有活性，而且在慢性溃疡模型中也具有活性。基于这些结果，可以认为透明质酸锌能刺激上皮的再生成，并因此促进溃疡愈合。
从上述模型的试验结果中还可以看出，至于有效性，不同分子量的透明质酸锌有显著差异。经证明，分子量为900,000道尔顿的透明质酸锌比分子量高于或低于900,000道尔顿的透明质酸锌更为有效，这一事实证明在分子量和活性之间存在一定关系。
在吲哚美辛诱导的肠溃疡模型中进行的试验的结果表明，透明质酸锌除了具有突出的胃保护作用以外，还具有肠保护作用，而硫糖铝在这项试验中则没有任何效果。透明质酸锌具有肠保护作用的事实进一步支持了我们的观点，即透明质酸锌不仅仅是粘膜和肠腔之间的物化屏障。
除了在不同的急性和慢性胃溃疡模型中研究了透明质酸锌的有效性以外，我们还要检测透明质酸锌是否具有不利的副作用。于是，测定了肠的蠕动性。
从试验结果中可明显看出，透明质酸锌不改变肠的蠕动性。透明质酸锌的这种性质同在酸化乙醇诱导的胃溃疡模型中发现的增加预处理时间导致ED50值增加这一事实一起表明，透明质酸锌不与胃粘膜不可逆粘着，另一方面，透明质酸锌不刺激肠导致其活动过强。概括基于上述讨论和解释的结果，可证明透明质酸锌是强有力的胃保护剂，并且其效果超过了在消化性溃疡的治疗中通常使用的硫糖铝。
从体外试验可看出，透明质酸锌能抑制幽门螺旋杆菌的生长。可推断透明质酸锌也可用于治疗由幽门螺旋杆菌诱导的溃疡。
由于具有胃保护作用以及抗幽门螺旋杆菌的活性，透明质酸锌可在幽门螺旋杆菌诱导的溃疡的治疗中或在抗再感染的预防治疗中用作补充治疗。通过使用透明质酸锌，用来治疗幽门螺旋杆菌的抗菌素的用量可减少一些；目前使用的、会引起一些副作用的抗幽门螺旋杆菌剂也可能被替代。
通过将透明质酸锌与无毒的惰性固体或液体载体和/或其它在肠内给药制剂中常用的辅料混合，可把透明质酸锌制成药物组合物。适用的载体有，例如水，明胶，乳糖，淀粉，果胶，硬脂酸镁，硬脂酸，滑石粉，植物油如花生油、橄榄油等。活性组分可配制成任意的常用口服药物组合物，其中组合物是由粉末以已知方法制成的，组合物的剂型有，例如片剂、丸剂、胶囊、溶液剂等。活性化合物优选以浓缩水溶液剂型给药，所述浓缩水溶液可以如实施例1和4所述方式制备。水溶液制剂的优点是，将活性成分溶解在胃液中不需要任何时间；组合物可以不用添加剂就能制成；能随意地、准确地选择日给药剂量。
组合物可按照通常的制药工艺以已知的方式制备，如果需要，组合物可接受其它通常的操作，如灭菌。
下述实施例举例说明了本发明的组合物及其制备，这并非是将本发明的保护范围限制在这些实施例中。实施例2含有10mg活性成分、重200mg的片剂透明质酸锌10mg无水乳糖 106mg预凝胶化的淀粉(Lycatos PGS) 6mg玉米淀粉(Amylum maydis) 40mg微晶纤维素(Avicel PH102) 30mg二氧化硅气凝胶200 1mg
滑石粉6mg硬脂酸镁 1mg将活性成分和添加剂进行常规的湿法制粒后，把混合物压成重200mg的片剂。实施例3含有10mg活性成分、重200mg的药物组合物，其中组合物被制成在小药囊、小瓶或胶囊中使用的小丸。
透明质酸锌10mg乳糖 95mg微晶纤维素(Avicel PH101) 95mg用已知方法，例如在涡动制粒器中，将活性成分和添加剂制成小丸。把小丸装在小药囊、小瓶或胶囊中。实施例4含有1.0g活性组分、100ml水溶液形式的药物组合物透明质酸锌 1.0g蒸馏水适量加至100ml
权利要求
1.抗消化性溃疡的药物组合物，其中含有作为活性成分的与载体和/或在药物组合物中常用的其它添加剂相混合的透明质酸锌复合物(络合物)。
2.根据权利要求1的药物组合物，其中含有分子量为500,000道尔顿-1,200,000道尔顿的透明质酸锌。
3.根据权利要求1或2的药物组合物，其中含有分子量为900,000道尔顿的透明质酸锌。
4.制备抗消化性溃疡的药物组合物的方法，包括将作为活性成分的透明质酸锌复合物(络合物)与载体和/或在制药工业中常用的其它添加剂混合，并将混合物转化成药物组合物。
5.透明质酸锌复合物(络合物)在制备抗消化性溃疡的药物组合物中的用途。
6.透明质酸锌复合物(络合物)在治疗消化性溃疡以及预防溃疡形成中的用途。
7.透明质酸锌复合物(络合物)在防止消化性溃疡愈合后再感染中的用途，包括将治疗有效量的透明质酸锌复合物(络合物)以其自身形式或药物组合物的形式对需要治疗的人给药。
8.治疗消化性溃疡以及预防溃疡形成的方法，包括将治疗有效量的透明质酸锌复合物(络合物)以其自身形式或药物组合物的形式对需要治疗的人给药。
全文摘要
本发明涉及抗消化性溃疡的药物组合物以及制备所述组合物的方法。本发明的药物组合物含有与载体和/或制药工业中常用的其它添加剂混合的透明质酸的锌复合物(络合物)作为活性成分。
文档编号A61K31/715GK1254285SQ9880467
公开日2000年5月24日 申请日期1998年4月28日 优先权日1997年4月29日
发明者拉斯洛·苏波尼, 亚诺什·伊利斯, 朱迪特·马图兹, 伊丽莎白·内斯梅尔伊, 加博尔妮·福雷, 贝洛·斯特夫科, 卡塔林·沙吉 申请人:里克特格登化工有限公司