专利名称：纤维素分解酶、木聚糖分解酶和β－葡聚糖分解酶的抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及纤维素分解酶、木聚糖分解酶和/或β-葡聚糖分解酶(有时也称为纤维素酶、戊聚糖酶和/或半纤维素酶)的抑制剂，尤其是戊聚糖降解酶如木聚糖内切酶(如EC3.2.1.8)、β-木糖苷酶(如EC3.2.1.37)和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(如EC3.2.1.55)的抑制剂，涉及纤维素酶(如EC3.2.1.4)、β-葡聚糖酶(如EC3.2.3.73或EC3.2.1.6)的抑制剂，并且涉及其它木聚糖、阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖降解酶的抑制剂，它们存在于微生物、植物、植物材料或其部份中(如谷物、谷粒、谷粉或其部份)。
本发明也涉及获得所述抑制剂的方法，以及该抑制剂在食品、饲料和/或饮料技术不同领域中的应用，如麦芽制造和酿造；如为了提高其转化的动物饲料的生产；烘制和/或压制的谷类制品如死面团、发面团和Chorleywood面包、早餐谷类食品、不同类型的饼干、意大利面食(pasta)和面条的生产；淀粉衍生的糖浆、山梨糖醇、木糖和/或木糖醇的生产；面筋-淀粉分离工业；玉米加工；植物病害抵抗力的提高；该抑制剂在营养药或药物应用如保持食用纤维材料的结构中的应用，以及在造纸及纸浆技术领域中的应用。
背景技术：
除大麦芽之外，未发芽的谷物如小麦通常用于啤酒生产(Pierce，J.S.，欧洲酿造厂例会论文集(Proceedings of the European BreweryConvention Congress)，马德里(Madrid)，1987，445)。未发芽的小麦(40-50％)例如可用于比利时白(小麦)啤酒的生产。
尽管大麦和小麦的胚乳细胞壁中分别含有20％和70％(w/w)的阿拉伯木聚糖(Ballance，G.M.和Manners，D.J.，碳水化合物研究(Carbohydrate Research)，1978，61，107；Fincher，G.B.和Stone，B.A.，于《谷类科学与技术进展》(Advances in Cereal Science andTechnology)，卷VIII，Y.Pomeranz(编)，美国谷类化学学会(Am.Assoc.Cereal Chem.)，St.Paul(MN)，1986，207)，但其总阿拉伯木聚糖含量是相当的，即对于大麦为2.8-7.1％(w/w)，对于小麦为3.6-7.1％(w/w)(Henry，J.，食品与农业科学杂志(Journal of the Science of Food andAgriculture)，1985，36，1243；Hashimoto，S.，Shogren，M.D.和Pomeranz，Y.，谷类化学(Cereal Chemistry)，1987，64，30)。
谷粒中也含有类似水平的水可提取的阿拉伯木聚糖，即对于大麦为0.24-0.80％(w/w)，对于小麦为0.25-1.18％(Henry，J.，食品与农业科学杂志，1985，36，1243；Hashimoto，S.，Shogren，M.D.和Pomeranz，Y.，谷物化学，1987，64，30；Aman，P.和Hesselman，K.，瑞典农业研究杂志(Swedish Journal of Agricultural Research)，1984，14，135；Girhammer，U.和Nair B.M.，食品水解胶体(Food Hydrocolloids)，1992，6，285)。此外，大麦和小麦的胚乳细胞壁中分别含有70％和20％的β-葡聚糖(Ballance，G.M.和Manners，D.J.，碳水化合物研究，1978，61，107；Fincher G.B.和Stone，B.A.，于《谷类科学与技术进展》，卷VIII，Y.Pomeranz(编)，美国谷类化学学会，St.Paul(MN)，1986，207)。
大麦谷粒中含有1.7-4.1％(w/w)的水可提取的β-葡聚糖和3.6-6.4％(w/w)的总β-葡聚糖(Anderson，M.A.，Cook，J.A.和Stone，B.A.，酿造研究所杂志(Journal of the Institute of Brewing)，1978，84，233-239；Henry，J.，食品与农业科学杂志，1985，36，1243)。小麦谷粒中含有0.1-0.8％(w/w)的水可提取的β-葡聚糖和0.6-1.4％(w/w)的总β-葡聚糖(Anderson，M.A.，Cook，J.A.和Stone，B.A.，酿造研究所杂志，1978，84，233-239；Henry，J.，食品与农业科学杂志，1985，36，1243)。由于在小麦中仅能检测到低水平的阿拉伯木聚糖降解酶(Cleemput，G.，Bleukx，W.，van Oort，M.，Hessing，M.和Delcour，J.A.，谷类科学杂志(Journal of Cereal Science)，1995，22，139)和β-葡聚糖降解酶活性，因此大麦芽肯定主要担负酿造过程中小麦和麦芽阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖的水解。
阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖的有效水解是重要的，因为这些化合物能涉及生产问题，如麦芽汁粘性(Ducroo，P.和Frelon，P.G.，欧洲酿造厂例会论文集，苏黎世(Zurich)，1989，445；Vietor，R.J.和Voragen，A.G.J.，酿造研究所杂志，1993，99，243)和过滤性和糊涂(haze)的形成(Coote，N.和Kirsop，B.H.1976，酿造研究所杂志，1976，82，34；Izawa，M.，Kano，Y.和Kanimura，M.1991.Aviemore麦芽制造、酿造和蒸馏会议论文集(Proceedings Aviemore Conference on Malting，Brewing andDistilling)，1990，427)。
在其它领域中木聚糖和/或阿拉伯木聚糖的有效水解也是非常希望的。实例包括黑麦和小麦面包制造方法、造纸及纸浆技术。随后由于上述应用对木聚糖和/或阿拉伯木聚糖水解酶的(潜在)应用进行了大量研究工作。
发明概述本发明涉及纤维素分解酶、木聚糖分解酶和/或β-葡聚糖分解酶的抑制剂，优选地木聚糖内切酶、β-葡聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶及其它木聚糖、阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖降解酶的抑制剂，它们优选地从微生物、植物、植物材料或其部份(如谷物、谷粒、谷胚或其部份、谷粉或其部份)中获得。
“酶的抑制剂”意思是能部分或完全抑制所述酶的活性的分子。在不可逆抑制中，抑制剂与酶共价连接，或者紧密结合使得它与酶的解离非常缓慢。在此情况下，抑制剂通常在交联反应中模拟该酶的正常底物。相反，可逆抑制的特征在于酶与抑制剂之间的快速平衡。竞争性抑制剂阻止底物与活性部位结合，并可通过减少与底物结合的酶分子的比例降低反应速率。在非竞争性抑制中，抑制剂可降低转换数。通过测定提高底物浓度能否克服抑制，可区分竞争性抑制与非竞争性抑制。从特定生物种分离的并且有蛋白质或糖蛋白性质的抑制剂能对相同种的酶(即内源酶)和/或不同种的酶(即外源酶)有活性。
便利地，本发明的抑制剂可由微生物产生，或者可存在于微生物或植物材料的多种提取介质中，如谷物或其部份、如谷粒或其部份、如谷胚或其部份、如谷粉或其部份，如来源于小麦、硬粒小麦、黑麦、黑小麦、大麦、高粱、燕麦、玉米和/或水稻，可通过本领域熟练的技术人员熟知的方法从中获得抑制剂。根据本发明的一种优选实施方案，抑制剂是一种木聚糖酶抑制剂，它一般是水溶性的碱性蛋白质种，pI(即等电点的-log)大于约7.0。经SDS-page测定，木聚糖酶抑制剂的分子量一般为40-43kDa。用β-巯基乙醇还原后，发现SDS-page分子量约40-43 kDa、约30 kDa和约10 kDa的三条SDS-page蛋白质带。40-43 kDa蛋白质或糖蛋白的N端序列至今才描述，一般如下SEQ ID No.1Lys-Gly-Leu-Pro-Val-Leu-Ala-Pro-Val-Thr-Lys-Xaa-Thr-Ala，其中Xaa优选地是Asp。30 kDa带具有上述典型的N端氨基酸SEQ ID No.1，而10 kDa带的N端氨基酸序列一般如下SEQ ID No.2Xaa-Ala-Pro-Val-Ala-Lys-Met-Val-Leu-Pro-Val-Ala-Met-Lys-Glu-Xaa-Val，其中第一个Xaa优选地是Ser、Phe或Gly，第二个Xaa未鉴定。该序列以前未描述过。
因此，本发明也涉及一种SDS-page分子量一般为40-43 kDa的抑制剂，它是一种蛋白质或糖蛋白，具有一种标志，该标志的氨基酸序列与SEQID No.1具有超过70％的同源性，优选地超过85％的同源性，更优选地与之相同。
本发明另外也涉及一种SDS-page分子量一般为30 kDa的抑制剂，它是一种蛋白质或糖蛋白，具有一种标志，该标志的氨基酸序列与SEQ IDNo.1具有超过70％的同源性，优选地超过85％的同源性，更优选地与之相同。
本发明另外也涉及一种SDS-page分子量一般为10 kDa的抑制剂，它是一种蛋白质或糖蛋白，具有一种标志，该标志的氨基酸序列与SEQ IDNo.2具有超过70％的同源性，优选地超过85％的同源性，更优选地与之相同。
有利地，该标志是蛋白质或糖蛋白的末端氨基酸序列。
根据本发明，蛋白质或糖蛋白的标志意思是一种特异的氨基酸序列(或其相应的核苷酸序列)，它能将一种蛋白质家族与另一种蛋白质家族区分开来。
对木聚糖和/或阿拉伯木聚糖水解酶的抑制作用能由例如应用AZCL阿拉伯木聚糖的木聚糖内切酶法证明(参见下文)。同样，对β-葡聚糖水解酶的抑制作用能由例如应用AZCL β-葡聚糖的β-葡聚糖酶法证明(参见下文)。
本发明也涉及一种方法，用于从微生物，如表达所述抑制剂的遗传修饰微生物中、从植物中、或从植物材料如谷物、谷粒、谷粉或其部份中获得该抑制剂，方法是对该植物、该植物材料和/或该微生物进行一次或多次提取和域分级分离步骤。
本发明的另一方面涉及一种方法，用于基因转化微生物、植物或植物材料，以获得根据本发明的抑制剂的表达，其中通过将编码该抑制剂的遗传物质引入该微生物、植物或植物材料中遗传修饰该微生物、植物或植物材料，并通过本领域熟练技术人员所熟知的遗传工程方法获得其翻译和表达。
本发明另外涉及这样的方法，其目的在于改变、优选地降低或提高微生物、植物或植物材料中所述抑制剂的水平，方法是通过本领域熟练技术人员所熟知的方法，和/或使用能阻断该抑制剂活性或激活该抑制剂的分子，降低或提高该抑制剂的表达。
本发明另外还涉及获得的抑制剂、微生物、植物、植物材料和/或其部份，并涉及它们在食品、饲料和/或饮料技术不同领域中的应用，如改进麦芽制造和酿造、提高动物饲料的效能、烘制和/或压制的谷类制品(如死面团、发面团和Chorleywood面包、早餐谷类食品、不同类型的饼干、意大利面食和面条)、改进淀粉衍生的糖浆、山梨糖醇、木糖和/或木糖醇的生产、改进面筋-淀粉分离和生产、玉米加工、提高植物病害抵抗力，改进营养药或药物应用(如保持食用纤维材料的结构)以及改进造纸及纸浆技术。
在以下一种优选实施方案的描述中将详细描述本发明，它并不限制本发明的范围。发明详述在研究比利时白啤酒和生产过程之中间产物中的阿拉伯木聚糖结构的工作过程中，发明者意外地发现小麦的水可提取物对大麦芽木聚糖分解系统的抑制迹象。这在以前未报道过，尽管清楚地确定在谷粒中存在内源和外源α-淀粉酶抑制剂(Deponte，R.，Parlamenti，T.，Petrucci，V.，Silano，V.和Tomasi，M.，谷类化学，1976，53，805；Buonocore，V.，Petrucci，T.和Silano，V.，植物化学(Phytochemistry)，1977，16，811；Mundy，J.，Hejgaard，J.和Svendsen，I.，学会联合会(Federation of Societies)，1984，167，210；Silano，V.，α-淀粉酶抑制剂，于《酶及其在谷类技术中的作用》，J.E.Kruger，D.Lineback和C.E.Stauffer(编)，美国谷类化学学会，St.Paul(MN)，1987，141)和蛋白酶(Birk，Y.，酶学方法(MethodsEnzymology)，1976，45，723；Lawszkowski，M.和Kato，I.，生物化学年述(Annual Review of Biochemistry)，1980，49，593)。
实际上，当目的为(1)将原材料的酶活性与相应麦芽汁的阿拉伯木聚糖含量相联系，以及(2)研究酿造中小麦以何种方式干扰阿拉伯木聚糖的溶解，测定在应用大麦芽和未发芽之小麦的酿造中阿拉伯木聚糖的溶解时，有证据表明小麦中木聚糖酶抑制剂的存在。将用60％麦芽和40％小麦制备的麦芽汁中阿拉伯木聚糖的溶解和游离木糖(Xyl)的释放与100％麦芽汁中的情况相比较时，确实地观察到这一点。
在一定实验条件下，在麦芽汁制备过程中向麦芽汁中加入微生物来源的木聚糖酶明显地提高了阿拉伯木聚糖的溶解。
实施例材料β-D-阿洛糖、β-巯基乙醇、对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷和Trizma碱(试剂级，三[羟甲基]氨基甲烷)从美国MO St-Louis的Sigma获得。天青染料交联的(AZCL)小麦阿拉伯木聚糖(Xylazyme阿拉伯木聚糖片)、AZCL和来自黑曲霉(Aspergillus niger)的木聚糖酶M4从爱尔兰Bray的Megazyme获得。来源于微生物枯草芽孢杆菌(Bacillussubstilis)、绿色木霉(Trichoderma viride)和黑曲霉的微生物木聚糖酶从比利时Groot-Bijgaarden的NV Puratos获得。缓冲液A是0.025M乙酸钠，pH4.7；缓冲液B是0.025M马来酸钠，pH6.0；缓冲液C是0.025M磷酸钠，pH6.0；缓冲液D是0.250mM乙酸钠，pH5.0；缓冲液E是；0.025M乙酸钠，pH5.0。
大麦芽样品由Herent(比利时)的Cargill Malt Division提供。发明者使用两行的(two-rowed)冬大麦品种(Clarine)，其具有低活性的木聚糖内切酶和低含量的水可提取的Xyl，并使用六行的冬大麦品种Plaisant的两种麦芽，该品种具有水可提取的高含量的Xyl。Plaisant麦芽样品1和样品2分别具有高的和低的木聚糖内切酶活性。小麦样品来自于Amylum，Aalst(比利时)和SAPSA SES SA，Jodoigne(比利时)。发明者使用Skirlou和Soissons，它们分别具有高的和低的水可提取的Xyl含量。小麦胚芽由Vilvoorde(比利时)的Ceres提供。黑麦粉来自于由荷兰鹿特丹(Rotterdam)的Meneba提供的荷兰黑麦品种的混合物。大麦来自于由Herent(比利时)的Cargill Malt Division提供的品种Clarine。Clarine大麦、Plaisant 1和Plaisant 2大麦芽、Skirlou和Soissons小麦粗粉用Tecator样品磨粉机(Hoganas，瑞典)制备，或者对于酿造实验用EBC认可的实验室型磨粉机(Analytica-EBC，第四版，Brauerei-undGetranke-Rundschau，苏黎世，1987)制备。Soissons小麦粉用BuhlerMLU-202实验型磨粉机(Buhler，Uzwil，瑞士，提取率70％)产生。提取液BMWM1、WWM和WG将磨碎的大麦芽和小麦样品(3.00g)或小麦胚芽(1.00g)悬浮于缓冲液A(10.0mL)中。于室温剧烈摇动15分钟后，离心该悬液(3000g，15分钟，20℃)。产生的提取液称为BMWM1(大麦芽粗粉提取液1)、WWM(小麦粗粉提取液)和WG(小麦胚芽提取液)。WF、RF和BWM
将适量的面粉或粗粉样品(2.50g)悬浮于缓冲液B(10.0mL)中。于室温剧烈摇动15分钟后，离心该悬液(10000g，15分钟，20℃)并过滤(0.45μ)上清液。产生的粗粉提取液称为WF(小麦粉提取液)、RF(黑麦粉提取液)和BWM(大麦粗粉提取液)。BMWM2将磨碎的大麦芽样品(5.00g)悬浮于缓冲液B(10.0mL)中。于室温剧烈摇动15分钟后，离心该悬液(10000g，15分钟，20℃)并过滤(0.45μ)上清液。产生的粗粉提取液称为BMWM2(大麦芽粗粉提取液2)。方法Xyl含量的测定提取和水解方法如Cleemput等人(Cleemput，G.，Roels，S.P.，vanOort，M.，Grobet，P.J.和Delcour，J.A.，谷类化学，1993，70，324)所述，在提取之前加热(130℃)粗粉样品(小麦和大麦芽)5小时以去除酶活性。用与粗粉的水提取物相同的方法分析麦芽汁。通过在乙酸糖醇制备之前省略水解步骤测定游离的Xyl。在Supelco SP-2380柱(30m，0.32mmID，0.2μm膜厚度)上于225℃分离乙酸糖醇样品(1μL)(Englyst，H.N.和Cummings，J.H.，分析者(Analyst)，1984，109，937)，并用Chrompack9011层析仪(Middelburg，荷兰)中的火焰电离检测仪进行检测。注入和检测温度为275℃。β-D-阿洛糖用作内标准。测到的阿拉伯糖(Ara)来源于阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖两者，使之不可能以0.88×(Ara+Xyl)计算阿拉伯木聚糖的水平(Cleemput，G.，van Oort，M.，Hessing，M.，Bergmans，M.E.F.，Gruppen，H.，Grobet，P.J.，Delcour，J.A.，谷类科学杂志，1995，22，73-84)。此外，由于在小麦粗粉的水提取物中相当部分的半乳糖(Gal)不是来源于阿拉伯半乳聚糖，所以通过假定阿拉伯半乳聚糖中的Gal/Ara比例与小麦一样为1.5(Izydorczyk，M.，Biliaderis，C.G.和Bushuk，W.，谷类化学，1991，68，139-144)，对阿拉伯半乳聚糖的Ara数值的校正同样是不可能的。因此以后将Xyl数值用作阿拉伯木聚糖水平的相对量度。类似地，酿造中Xyl水平的升高表明酿造中阿拉伯木聚糖的溶解。木聚糖内切酶(EC3.2.1.8)活性及其抑制的测定将提取液(1.0mL)BMWM1和WWM(参见上文)于50℃温育5分钟，之后加入AZCL-木聚糖片(Megazyme)。然后于50℃继续温育60分钟。通过加入1％(w/v)Trizma碱(10.0mL)并剧烈旋转搅拌终止反应。室温放置5分钟后，剧烈振摇试管，将内容物通过Whatman N°1滤纸过滤。测定590nm处相对于对照的吸光度，对照是通过将不含底物片的提取液在50℃温育60分钟而制备的。向提取液中加入1％(w/v)Trizma碱后加入底物片。活性表示为样品与对照间590nm处吸光度的差异，以每克干麦芽表示(ΔA590/g)。
将0.6mL BMWM1(参见上文)和0.4mL缓冲液A中的木聚糖内切酶活性与加入了0.4mL WWM的0.6mL BMWM1中的活性相比较。有时，在加入之前将WWM煮沸30分钟并离心(3000g，15分钟，20℃)。
在不同谷物的提取液对微生物酶的抑制的评估中，使用下列方法。将提取液(WF、WG、RF和BWM)或煮沸(30分钟，100℃)并离心(10000g，15分钟，20℃)的提取液(25μL)与250μL适当稀释的微生物木聚糖酶溶液在室温下预温育30分钟，加入xylazyme片，混合物于50℃温育60分钟。除了用5.0mL 2％(w/v)Trizma碱代替10.0mL 1％(w/v)Trizma碱终止反应外，剩余步骤如上所述。β-葡聚糖酶(EC 3.2.3.73)活性及其抑制的测定将提取液(WF、RF和BWM)或煮沸(30分钟，100℃)并离心(10000g，15分钟，20℃)的提取液(450μL)与50μL BMWM2在室温下预温育30分钟，加入β-Glucazyme片，混合液于40℃温育60分钟。除了用5.0mL 2％(w/v)Trizma碱代替10.0mL 1％(w/v)Trizma碱终止反应外，剩余步骤如上所述。酿造根据EBC法(Analytica-EBC，第四版，Brauerei-und Getranke-Rundschau，苏黎世，1987)以双份制备麦芽汁。对于100％大麦麦芽汁，使用50.0g大麦芽，对于含40％小麦的麦芽汁，使用30.0g大麦芽和20.0g小麦。将麦芽汁以2000×g(室温)离心15分钟。洗涤用过的谷粒(150mL)，将洗涤物加入麦芽汁中。
在与60％Clarine麦芽和40％Soissons或Skirlou小麦混合之前，将枯草芽孢杆菌木聚糖内切酶加入水(46℃)中。加入麦芽汁中的木聚糖内切酶的水平(0.867ΔA599/g)等于将Clarine麦芽的木聚糖内切酶活性(0.750 ΔA590/g)提高到Plaisant1麦芽中的水平(1.617 ΔA590/g)所需的水平。
上述所有分析都至少以双份进行，并表示为平均值。由个体与平均值之间的差异(％)计算实验误差(E.E.)。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦根据Laemmli，U.K.的方法(自然(Nature)，1970，227，680-685)，用PhastSystem单位(Pharmacia，Uppsala，瑞典)在还原(β-巯基乙醇，1％)或非还原条件下，于20％聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-page)，测定纯化的抑制剂的分子量。根据产品说明书(Pharmacia，开发技术文件N°210)将凝胶银染色。低分子量标准参照物是α-乳清蛋白(14400 Da)；胰蛋白酶抑制剂(20100 Da)；碳酸酐酶(30000 Da)；卵清蛋白(43000 Da)；清蛋白(67000 Da)；磷酸化酶b(94000 Da)。用使用含有两性电解质(pH 3-9)的聚丙烯酰胺凝胶的PhastSystem单位并应用适当的标准(Pharmacia校准试剂盒，pI3.5-9.3)测定抑制剂的等电点。银染色蛋白质(参见上文)。蛋白质的N端氨基酸序列测定应用与120A PTH分析仪(Perkin Elmer，比利时)联机的AppliedBiosystems 477A型气相序列测定仪测定N端氨基酸序列。小麦中存在木聚糖内切酶抑制剂的证明大麦芽和小麦Xyl水平及阿拉伯木聚糖水解活性列于表I中。100％麦芽汁中的Xyl水平(表II)为0.41-0.62％(所有分析数据表示为干物质的百分数)。含40％小麦的麦芽汁中的Xyl水平为0.35-0.61％(表III)。
在含40％小麦的麦芽汁中，发明者使用60％的大麦芽。将使用60％麦芽的酿造中Xyl的增加与使用100％大麦芽的Xyl增加的60％相比较，显示12-58％的的降低(表II和表IH)。这提示，在小麦的存在下大麦芽的木聚糖内切酶被抑制，或者小麦阿拉伯木聚糖是麦芽木聚糖内切酶的较不适宜的底物。发芽破坏大麦细胞壁，使其更易被酶接近(Selvig，A.和Aarnes，H.，酿造研究所杂志，1986，92，185)。麦芽汁中的游离Xyl水平100％麦芽汁中的游离Xyl水平为0.046-0.076％，在含40％小麦的麦芽汁中为0.025-0.040％(表IV)。释放的游离Xyl水平之间的差异，对于100％麦芽汁为0.032-0.044％，对于含40％小麦的麦芽汁为0.015-0.020％。与应用100％大麦麦芽汁的游离Xyl释放的60％相比，游离Xyl释放的降低为1-32％(表II和表IV)。枯草芽孢杆菌木聚糖内切酶的应用不引起游离Xyl的增加。游离Ara水平也不升高。因此，木聚糖内切酶没有β-D-木糖苷酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的额外活性。
由一起使用小麦和大麦芽引起的、木聚糖内切酶诱导的Xyl增加或阿拉伯木聚糖溶解的降低，比游离Xyl的释放的降低更明显。由于这个原因，大家关注于小麦成分对大麦芽木聚糖内切酶的抑制。小麦提取液对麦芽木聚糖分解系统的抑制
图1显示加入WWM代替缓冲液A时BMWM1中木聚糖内切酶活性的降低。木聚糖内切酶活性的降低为26-58％。通过加入小麦粗粉提取液(WWM)代替缓冲液，获得大麦芽粗粉提取液(BMWM1)中木聚糖内切酶活性的降低。图1表示使用未煮沸(□)和煮沸的提取液(■)所获得的结果。(a)Clarine麦芽+Soissons小麦，(b)Clarine麦芽+Skirlou小麦，(c)Plaisant1麦芽+Soissons小麦，(d)Plaisant1麦芽+Skirlou小麦，(e)Plaisant2麦芽+Soissons小麦，(f)Plaisant2麦芽+Skirlou小麦。
在栽培品种Skirlou中比栽培品种Soissons中观察到更强的降低。这与应用栽培品种Skirlou的酿造中比应用栽培品种Soissons的酿造中Xyl更强的降低相一致(见表III)。栽培品种Skirlou的水可提取的Xyl含量高于栽培品种Soissons意味着，酿造中小麦底物的较低敏感性可引起溶解性降低。当煮沸WWM时，几乎所有抑制都消失。该抑制剂似乎是不耐热的，因此发明者推断它可能有蛋白质的性质。然而，认为专注于一种蛋白酶是不可能的，因为麦芽中的蛋白酶活性数倍高于小麦的蛋白酶活性。活性降低的主要部分显然不是由小麦阿拉伯木聚糖所引起的，因为热处理不改变小麦提取液的阿拉伯木聚糖浓度。小麦抑制剂对内源大麦芽木聚糖内切酶或外源木聚糖内切酶是否有活性尚不清楚。应用枯草芽孢杆菌木聚糖酶的酿造用于大麦芽-小麦粗粉酿造中阿拉伯木聚糖溶解较差的一种溶液枯草芽孢杆菌木聚糖内切酶是在图2的实验条件下相对较少被抑制的一种微生物酶，其提高麦芽汁中存在的Xyl水平。与不加入木聚糖内切酶而制备的相同麦芽汁相比，使用栽培品种Soissons作为小麦添加物获得多出94％的Xyl溶解，使用栽培品种Skirlou作为小麦添加物获得多出179％的Xyl溶解。枯草芽孢杆菌木聚糖内切酶显然溶解来源于小麦品种Skirlou的阿拉伯木聚糖多于来源于小麦品种Soissons的阿拉伯木聚糖(表IV)。木聚糖酶抑制剂从小麦粉中的纯化将Soissons小麦粉(2.0kg)悬浮于10.0L 0.1％(w/v)抗坏血酸中。悬液于7℃混合过夜并离心(7℃，10000g，30分钟)。向上清液中加入2.0g/LCaCl2，加入2.0M NaOH使pH升高至9.0。将提取液置于7℃过夜并离心(7℃，10000g，30分钟)。用2.0M HCl调节提取液的pH至5.0，并将该提取液泵送至阳离子交换柱(SP Sepharose Fast Flow，50×50mm，Pharmacia)。该柱用缓冲液C(200mL)平衡，用200mL 0.5M NaCl洗脱蛋白质级分。洗脱物稀释5倍，如上将pH调节至5.0，交换阳离子(SPSepharose Fast Flow，26×100mm，Pharmacia)。用缓冲液C(200mL)平衡该柱，0-0.5M NaCl(800mL)的线性盐梯度后，用所述Xylazyme法测定脱盐(PD 10柱，Pharmacia)后的10mL级分的木聚糖内切酶抑制，该方法中以洗脱物代替谷物提取液和适当稀释的黑曲霉木聚糖酶M4。收集具有抑制活性的级分，对去离子水透析(7℃，过夜)并冻干。用缓冲液D(6.0mL)溶解冻干物质，在Sephacryl S100柱(26×670mm，Pharmacia)上分离，用相同缓冲液洗脱。收集2.5mL级分，测定其抑制活性。收集活性级分，如上透析并冻干。用缓冲液E(6mL)溶解冻干物质，用相同缓冲液交换阳离子(Mono S HR 5/5，Pharmacia)。收集以盐梯度(0-0.5M NaCl)洗脱的级分，如上测定其木聚糖酶抑制。这样，我们获得该抑制剂的一种级分(1mL)，它在SDS-PAGE上以单一蛋白质条带迁移。它具有约40-43kDa的表现分子量。用β-巯基乙醇还原后，检测到另外两条分子量一般为30 kDa和10 kDa的SDS-PAGE带。木聚糖内切酶抑制剂的N端氨基酸序列测定对β-巯基乙醇还原的抑制剂蛋白质和/或糖蛋白级分进行SDS-page、印迹和N端氨基酸序列测定。
约40-43 kDa带的N端氨基酸序列(SEQ ID No.01)是Lys-Gly-Leu-Pro-Val-Leu-Ala-Pro-Val-Thr-Lys-Xaa-Thr-Ala，其中Xaa优选地是Asp。该序列以前未报道过。上述约30 kDa带也具有上述典型的N端氨基酸SEQ ID No.1，而约10 kDa带的N端氨基酸序列一般如下SEQ IDNo.2Xaa-Ala-Pro-Val-Ala-Lys-Met-Val-Leu-Pro-Val-Ala-Met-Lys-Glu-Xaa-Val，其中第一个Xaa优选地是Ser、Phe或Gly，第二个Xaa未鉴定。该序列以前未描述过。来源于小麦和其它谷类的木聚糖内切酶抑制剂对不同微生物木聚糖内切酶的抑制图2显示在WF、RF和BWM存在下不同微生物木聚糖酶的抑制。列出了当加入谷物提取液代替煮沸30分钟的相同提取液时木聚糖酶活性的降低(％)。在此实验条件下，对于源自Trichoderma reesei的三种木聚糖酶的混合物发现了最大降低(82-94％)，对于源自枯草芽孢杆菌的木聚糖酶发现最小降低(24-39％)。
通过加入谷物提取液(WF、RF和BWM)代替煮沸的谷物提取液获得微生物木聚糖内切酶活性的降低。图2表示应用小麦粉(
)、黑麦粉(□)和大麦粗粉(■)获得的结果。微生物木聚糖酶(a)来源于Trichoderma reesei的三种木聚糖酶的混合物，(b)来源于黑曲霉的木聚糖酶M4，(c)来源于枯草芽孢杆菌的木聚糖酶，(d)来源于枯草芽孢杆菌的三种木聚糖酶的混合物，(e)来源于黑曲霉的木聚糖酶，(f)来源于黑曲霉的五种木聚糖酶的混合物，(g)来源于黑曲霉的五种木聚糖酶的混合物。在此实验条件下，WG使黑曲霉木聚糖酶M4的活性降低约80％。夹源于小麦和其它谷类的抑制剂对大麦芽β-葡聚糖酶的抑制图3显示在WF、RF和BWM存在下麦芽β-葡聚糖酶的抑制。列出了当加入谷物提取液代替煮沸30分钟的相同提取液时β-葡聚糖酶活性的降低(％)。降低为7-12％。
通过加入谷物提取液(WF、RF和BWM)代替煮沸的谷物提取液获得大麦芽提取液(BMWM2)中β-葡聚糖酶活性的降低。图3表示应用小麦粉(a)、黑麦粉(b)和大麦粗粉(c)获得的结果。
表I.3种大麦芽和2种小麦的水可提取的和游离的木糖含量(％干物质)以及阿拉伯木聚糖降解酶活性*水可提取的Xyl 游离Xyl 木聚糖内切酶 β-D-木糖苷酶(ΔA590/g)(U/g)大麦芽Clarine 0.29 0.0140.750 0.286Plaisant1 0.41 0.0311.617 0.331Plaisant2 0.40 0.0130.607 0.299小麦Soissons0.27 0.0050.115 0.054Skirlou 0.52 0.0030.205 0.053E.E.＜7％E.E.＜4％E.E.＜9％ E.E.＜6％*Xyl＝木糖；水可提取的Xyl=总数-游离的木糖水提取物；E.E.＝实验误差。
表II.麦芽汁中的木糖和游离木糖水平(％干物质)以及应用100％大麦芽的酿造中木糖和游离木糖增加的水平(％干物质)*大麦芽 Xyl麦芽汁 Xyl增加 游离Xyl麦芽汁 游离Xyl增加Clarine 0.41 0.15 0.046 0.032Plaisant1 0.62 0.26 0.075 0.044Plaisant2 0.51 0.09 0.049 0.035E.E.＜6％ E.E.＜7％*Xyl＝木糖；Xyl麦芽汁＝总数-游离木糖麦芽汁；Xyl增加＝总木糖麦芽汁-总木糖水提取物大麦芽；Ara＝阿拉伯糖；E.E.＝实验误差。
表III谷粒及用60％大麦芽和40％小麦制备的相应麦芽汁中的木糖水平(％干物质)。酿造中木糖水平的提高(％干物质)以及加入枯草芽孢杆菌木聚糖内切酶的影响。与100％麦芽汁情况中木糖水平提高的60％的差异(％)*大麦芽(60％)+Xyl谷粒Xyl麦芽汁Xyl提高 100％麦芽小麦(40％) 汁差异Clarine+Soissons 0.290.35 0.08 -12Clarine+Skirlou 0.410.46 0.07 -27Plaisant1+Soissons0.350.44 0.10 -36Plaisant1+Skirlou 0.480.53 0.06 -58Plaisant2+Soissons0.350.39 0.06 -28Plaisant2+Skirlou 0.480.51 0.05 -40Clarine+Soissons+BSX 0.310.45 0.16 93Clarine+Skirlou+BSX 0.440.61 0.19 130E.E.＜8％ E.E.＜7％*Xyl＝木糖；Xyl谷粒＝0.6×(总数-游离木糖水提取物大麦芽)+0.4×(总数-游离木糖水提取物小麦)；Xyl麦芽汁＝总数-游离木糖麦芽汁；Xyl提高＝总木糖麦芽汁-
；100％麦芽汁差异＝[100×(60％麦芽和40％小麦的麦芽汁中的木糖增加)/(100％麦芽的麦芽汁中的木糖增加)]-100；BSX＝枯草芽孢杆菌木聚糖内切酶；E.E.＝实验误差。
表IV应用60％大麦芽和40％小麦的酿造中游离木糖的释放。加入枯草芽孢杆菌木聚糖内切酶的影响。与100％麦芽汁情况中木糖释放的60％的差异(％)*。大麦芽(60％)+游离Xyl小麦(40％) 谷粒 麦芽汁释 100％麦芽汁差异Clarine+Soissons 0.010 0.025 0.015-20Clarine+Skirlou 0.010 0.029 0.019-1Plaisant1+Soissons 0.021 0.039 0.018-32Plaisant1+Skirlou0.020 0.040 0.020-24Plaisant2+Soissons 0.010 0.029 0.019-9Plaisant2+Skirlou0.009 0.029 0.020-5Clarine+Soissons+BSX 0.010 0.026 0.015-19Clarine+Skirlou+BSX 0.010 0.029 0.019-2E.E.＜8％ E.E.＜7％*Xyl＝木糖；100％麦芽汁差异＝[100×(60％麦芽和40％小麦的麦芽汁的木糖释放)/(100％麦芽的麦芽汁的木糖释放)]-100；BSX＝枯草芽孢杆菌木聚糖内切酶；E.E.＝实验误差。
权利要求
1.一种纤维素分解酶、木聚糖分解酶和/或β-葡聚糖分解酶的蛋白质或糖蛋白抑制剂。
2.权利要求1的抑制剂，其特征在于该抑制剂抑制纤维素酶、木聚糖内切酶、β-葡聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和/或其它纤维素、木聚糖、阿拉伯木聚糖或β-葡聚糖降解酶。
3.权利要求1或2的抑制剂，其特征在于该抑制剂可从植物材料或其部份中获得。
4.权利要求3的抑制剂，其特征在于所述植物材料选自谷物、小麦的谷粒或谷粉、硬粒小麦、黑麦、黑小麦、大麦、高粱、燕麦、玉米或水稻。
5.权利要求1或2的抑制剂，其特征在于该抑制剂可从微生物或其部份中获得。
6.权利要求1-5中任一个的抑制剂，其特征在于它是一种木聚糖酶抑制剂。
7.权利要求6的抑制剂，其特征在于它是一种水溶性的种类。
8.权利要求7的抑制剂，它具有一种标志，该标志的氨基酸序列与SEQ IDNo.1和/或SEQ ID No.2具有超过70％的同源性。
9.权利要求8的抑制剂，其特征在于该标志是蛋白质或糖蛋白的N端氨基酸序列。
10.权利要求8或9的抑制剂，它具有一种标志，该标志的氨基酸序列与SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2具有超过85％的同源性。
11.权利要求10的抑制剂，其特征在于该标志是蛋白质或糖蛋白的N端氨基酸序列。
12.权利要求7的抑制剂，它具有一种标志，该标志的氨基酸序列与SEQID No.1和/或SEQ ID No.2相同。
13.权利要求12的抑制剂，其特征在于该标志是蛋白质或糖蛋白的N端氨基酸序列。
14.权利要求7-13中任一个的抑制剂，其特征在于所述蛋白质或糖蛋白选自分子量一般为40kDa-43kDa的蛋白质或糖蛋白、分子量一般为30kDa的蛋白质或糖蛋白以及分子量一般为10kDa的蛋白质或糖蛋白。
15.权利要求7-14中任一个的抑制剂，其特征在于所述蛋白质或糖蛋白分子量一般为40kDa-43kDa，并且pI大于约7。
16.从可能遗传修饰的微生物、植物或植物材料中获得权利要求1-15中任一个的抑制剂的方法，其中对该微生物、植物或植物材料进行一次或多次提取和/或分级分离步骤。
17.获得根据权利要求1-15中任一个的抑制剂的方法，其中通过将编码该抑制剂的遗传物质引入微生物、植物或植物材料中遗传修饰该微生物、植物或植物材料。
18.转化微生物、植物或植物材料的方法，其中根据权利要求1-15中任一个的抑制剂的活性降低。
19.根据权利要求18的方法，其特征在于通过根据本发明的抑制剂表达的降低获得其活性降低。
20.根据权利要求18或19的方法，其特征在于通过阻断抑制剂的功能降低该抑制剂的活性。
21.转化微生物、植物或植物材料的方法，其中根据权利要求1-15中任一个的抑制剂的活性提高。
22.根据权利要求21的方法，其特征在于通过根据本发明的抑制剂表达的提高获得其活性的提高。
23.根据权利要求21或22的方法，其特征在于通过激活抑制剂的功能提高该抑制剂的活性。
24.根据前述权利要求17-23中任一个的方法所获得的微生物、植物或植物材料。
25.根据前述权利要求1-15中任一个的抑制剂或由权利要求16的方法、根据权利要求24的微生物、植物和/或植物材料所获得的抑制剂的应用，用于改进谷类如大麦、高粱和小麦的麦芽制造和/或啤酒的生产。
26.根据前述权利要求1-15中任一个的抑制剂或由权利要求16的方法、根据权利要求24的微生物、植物或植物材料所获得的抑制剂的应用，用于改进烘制或压制的谷类制品的生产和/或质量，该谷类制品选自死面团、发面团、Chorleywood面包、早餐谷类食品、饼干、意大利面食和面条。
27.根据前述权利要求1-15中任一个的抑制剂或由权利要求16的方法、根据权利要求24的微生物、植物或植物材料所获得的抑制剂的应用，用于提高动物饲料的效能。
28.根据前述权利要求1-15中任一个的抑制剂或由权利要求16的方法、根据权利要求24的微生物、植物或植物材料所获得的抑制剂的应用，用于改进淀粉衍生的糖浆、山梨糖醇、木糖和/或木糖醇的生产。
29.根据前述权利要求1-15中任一个的抑制剂或由权利要求16的方法、根据权利要求24的微生物、植物或植物材料所获得的抑制剂的应用，用于小麦面筋-淀粉的分离和生产。
30.根据前述权利要求1-15中任一个的抑制剂或由权利要求16的方法、根据权利要求24的微生物、植物或植物材料所获得的抑制剂的应用，用于改进玉米的加工。
31.根据前述权利要求1-15中任一个的抑制剂或由权利要求16的方法、根据权利要求24的微生物、植物或植物材料所获得的抑制剂的应用，用于提高植物病害的抵抗力。
32.根据前述权利要求1-15中任一个的抑制剂或由权利要求16的方法、根据权利要求24的微生物、植物或植物材料所获得的抑制剂的应用，用于改进营养药和/或药物的应用。
33.根据前述权利要求1-15中任一个的抑制剂或由权利要求16的方法、根据权利要求24的微生物、植物或植物材料所获得的抑制剂的应用，用于改进造纸及纸浆技术。
全文摘要
本发明涉及木聚糖分解酶和/或β－葡聚糖分解酶的抑制剂、获得该抑制剂的方法、用于获得微生物、植物或植物材料的所述抑制剂和方法,其中根据本发明的抑制剂的活性升高或降低,并且涉及该抑制剂、所述微生物、植物或植物材料在多种方法和应用中的用途。
文档编号A61P43/00GK1254374SQ98804680
公开日2000年5月24日 申请日期1998年5月4日 优先权日1997年4月30日
发明者W·德比瑟, J·德勒库尔 申请人:K·U·洛文研究和发展公司