专利名称：楝树精的提取方法
技术领域：
本发明涉及从楝树种子中回收楝树精(azadirachtin)和/或相似的杀虫化合物的方法。
背景技术：
已知楝树(Azaderachta indicia和亲缘树种)的种子和其它部分含有天然杀虫成分，主要杀虫活性成分是楝树精(azadirachtin)，它是一种四正三萜化合物(tetranortriterpenoid)，能对包括昆虫、螨虫和线虫在内的各种不同生物产生进食抑制和生长抑制。可能有若干相似的杀虫化合物存在于含有楝树精的楝树提取物中。在本说明书所用的术语“楝树精”包括存在于含有所述的楝树精的楝树提取物中的所有萜类杀虫化合物。
要从楝树种子中提取楝树精，必须将活性成分与其它物质分离，这些物质包括其它三萜烯、油、纤维和其它不溶物，以及水溶性成分如糖、和水溶性蛋白。事实上由于楝树精容易在水中水解和热降解，使得这些分离过程复杂化。
一种从楝树种子中提取楝树精的传统方法涉及使用三种有机溶剂和两个液/液分配步骤。首先压榨种子以除去大部分楝树油，所得榨饼用甲醇萃取，甲醇萃取出一系列物质，包括楝树精、其它三萜烯、二萜烯、残余油和一些多糖以及蛋白，要从甲醇上清液中制得粉末，必须对萃取液进行若干提纯步骤。
在第一个提纯步骤，将上清液浓缩，并对环己烷或其它非极性溶剂进行分配，以除去油和二萜烯，在蒸馏室蒸去环己烷，收集所得的油。在第二个提纯步骤包括，取下脱油的上清液除去甲醇，所得焦油溶于乙酸乙酯或类似溶剂，并对水分配以除去多糖和水溶性蛋白；将含有楝树精和其它三萜烯的乙酸乙酯蒸发，制得富楝树精粉末。
该传统方法存在若干与其本身相关的问题，主要问题是该方法所用溶剂的交叉污染并导致产品质量的差异。使用新鲜溶剂的最初过程，可生产出质量好的楝树精粉末，几个循环之后交叉污染带来的问题就会出现。虽然通常认为环己烷和甲醇基本上互不混溶，但是，在如上述萃取楝树精所生成的多组分体系中，环己烷和甲醇表现出某些混溶性。溶剂极性的改变使得油在环己烷分配后延续存在，对制备无油粉末或流动性的粉末造成困难。更严重的问题是甲醇和乙酸乙酯之间发生交叉污染，如果进行环己烷分配后的干燥步骤中没有除去甲醇，就会发生与乙酸乙酯的交叉污染。甲醇对乙酸乙酯的这种污染在乙酸乙酯/水分配过程会导致楝树精被带入水中，更糟的情况是根本不能形成分配。
以传统方法萃取楝树精的另一个问题是生产的废水具有高的生化需氧量(BOD)。在许多国家，排放高BOD值的废水是不允许的，需要安装相当昂贵的水处理设备。
另一个楝树精提取方法描述在授权于Trifolio-M GmbH.Herstellung Und Vertrieb Hochreiner Biosubstanzen的澳大利亚专利No.661482中。在这一可供选择的方法中，楝树种子被压榨以除去大部分油，榨饼用温水萃取，温水萃取出楝树精、一些较强极性的三萜烯、大部分多糖和水溶性蛋白、以及少量较强极性的油性化合物。将水上清液对中等极性的溶剂(如乙酸乙酯和二氯甲烷)进行分配，楝树精分配到有机层，有机层可进行真空浓缩，加入非极性溶剂如环己烷或石油醚，沉淀出楝树精。采用这一可供选择的方法虽然可以高产率获得楝树精粉末，但该方法同样要排放含有多糖和蛋白的水溶液，在一些国家，需要进行处理以符合环保标准。此外，在沉淀步骤，将非极性溶剂加入到浓缩的上清液中，会导致交叉污染所伴随的问题以及萃取过程中溶剂再使用前需进行纯化的费用问题。
发明概要第一方面，本发明提供一种制备富楝树精水溶液的方法，包括步骤(i)将磨碎或以其它方式粉碎的楝树种子脱油，除去其中的大部分油成分；(ii)用极性有机溶剂萃取脱油楝树种子，形成楝树精和残余油的有机溶液，在该极性溶剂中楝树精是可溶的，但多糖和蛋白是基本不溶解的；(iii)将上述有机溶液对水分配，形成楝树精和残余油的水溶液；和(iv)将残余油从所述水溶液中分离，得到富楝树精水溶液。
在一个实施方案中，该方法还进一步包括步骤(v)以极性有机溶剂萃取所述的水溶液，形成楝树精的有机溶液，在该溶剂中楝树精是可溶的，但多糖和蛋白是基本不溶解的；(vi)蒸发有机溶剂，生成富楝树精粉末。
楝树种子优选先干燥至含有1-10重量％的水分，更优选含有2-4重量％的水分，然后进行压榨制得种子榨饼，由此除去种子的大部分油分。优选以慢速度进行压榨，以减少在压榨过程中楝树种子温度的升高，从而使楝树精的热降解程度减到最小。进行压榨的结果是，在压榨过程优选至少除去种子中70重量％的油，更优选至少80重量％的油，最优选至少90重量％的油。
在步骤(ii)中，用于萃取基本上脱油的榨饼的极性有机溶剂优选选自乙酸乙酯、丙烯酸甲酯、丁醇、2-丁酮、二甘醇一丁醚、乙二醇一丁醚、甲酸乙酯、甲酸丙酯、呋喃、四氢呋喃、异佛尔酮、2，4-二羟基-4-甲基戊酮、2，4-二甲基戊酮、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二戊酯、1，2-环氧丙烷、癸二酸二丁酯、氯仿、甲苯、苯、二甲硫、乙硫醇、氯乙烷、五氯乙烷、三氯乙烯、1-溴戊烷或其它具有类似介电常数的溶剂以及它们的混合物。
乙酸乙酯优选用于本方法中，由于它的极性强度不足以从榨饼中萃取多糖和蛋白，但又足以从中萃取楝树精、其它三萜烯和残余油。萃取中榨饼对乙酸乙酯的比例可以是1∶1，萃取得到楝树精和油的乙酸乙酯上清液，而不溶于乙酸乙酯的多糖和蛋白大部分保留在榨饼中，本方法的这一步骤是非常有益的，因为它显著降低了后续程序所产废液的生化需氧量(BOD)，从而免除了在传统楝树精萃取方法中所需的费用昂贵的废水处理过程。尽管其它溶剂也可以用于上述萃取步骤中，本说明书的余下部分将集中描述一种方法，其步骤(ii)使用乙酸乙酯。在下述方法中使用不同溶剂所作的改进是溶剂萃取领域技术人员或一般熟练工人显而易见的。
在进行步骤(iii)之前，乙酸乙酯上清液可通过真空蒸馏浓缩，例如进行蒸馏将大约一半的乙酸乙酯从上清液中除去。如果需要，本次的上清液可通过压滤器和滤袋进行过滤，这将有助于防止在后面的分配中形成胶质层。然后浓缩的上清液进行上述步骤(iii)，水优选是温度约为20℃-40℃的温水。在该分配中，楝树精、存在于上清液中的其它强极性三萜烯的大部分和残余油的极性组分与一部分乙酸乙酯一起转移到水层，分配所产生的有机层优选含有很少量的楝树精，但富含弱极性的三萜烯和二萜烯或者如本领域所称的“苦质(bitters)”，该有机层可进行真空蒸馏，回收乙酸乙酯，余下的“苦质”油同样含有许多生物活性物质。
与水分配所形成的水溶液，在油分离步骤(步骤(iv))之前可先行冷却，优选根据油和水的不同比重将油与水分离。实施分离可将溶液通过一个分离器，溶液在其中旋转经过一系列锥形漏斗，将油和水根据它们的比重实现物理分离，流出油优选不含有楝树精，但含有较弱极性的三萜烯和二萜烯，可将其与水分配所得的有机层合并并进行上述蒸馏。
在步骤(v)，富楝树精的水溶液仍然含有大部分的其它强极性三萜烯及乙酸乙酯萃取过程未余留在榨饼中的剩余的多糖和蛋白，该水溶液优选用乙酸乙酯萃取。尽管乙酸乙酯是优选的，但实施萃取也可以使用丙烯酸甲酯、丁醇、2-丁酮、二甘醇一丁醚、乙二醇一丁醚、甲酸乙酯、甲酸丙酯、呋喃、四氢呋喃、异佛尔酮、2，4-二羟基-4-甲基戊酮、2，4-二甲基戊酮、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二戊酯、1，2-环氧丙烷、癸二酸二丁酯、氯仿、甲苯、苯、二甲硫、乙硫醇、氯乙烷、五氯乙烷、三氯乙烯、1-溴戊烷或其它具有相似介电常数的溶剂以及它们的混合物。尽管在步骤(v)也可以用其它溶剂，本说明书的余下部分将集中描述一种方法，它的上述步骤(v)使用乙酸乙酯。对所述方法所需的改进，只要是在步骤(v)采用所列出的其它溶剂，对本领域技术人员或一般熟练工人是显而易见的。
在乙酸乙酯萃取中，楝树精和其它强极性三萜烯全部分配到乙酸乙酯层，所得水层含有不溶于乙酸乙酯的残余多糖和蛋白，可以废弃或作为他用。优选水层的多糖和蛋白的浓度足够低，允许作为废水排放而不需进行太耗资的处理。
在具体实施方案中，水溶液在步骤(v)之前可加入盐，以保证楝树精全部从水相迁移。在另一个实施方案中，可以通过降低水溶液的温度，减小楝树精在其中的溶解度。本发明人发现在10℃或更低温度，楝树精在水中的溶解度下降；适当地降低水相的温度，可以增加楝树精在有机层的含量。
在步骤(vi)，有机层优选使用刮壁旋转汽化器(scrape side rotaryevaperator)，蒸去乙酸乙酯，余下富楝树精粉末。此过程蒸出的乙酸乙酯没有被其它有机溶剂污染，可进行冷凝，并直接循环应用到步骤(ii)的萃取过程。
在另一个实施方案中，本方法还进一步包括在容器内将楝树精粉末溶解于甲醇，在甲醇中只有三萜烯是可溶的，而步骤(iv)后的残余油附着在容器壁上，从而与富楝树精甲醇溶液分离。然后可将甲醇蒸发获得含油更低的富楝树精粉末。
在更进一步的实施方案中，本方法在步骤(vi)之前包括一个过滤步骤，该过滤步骤优选包括，将富楝树精上清液经过疏水过滤介质，残余在上清液中的油质优选与疏水过滤介质结合。
第二方面，本发明提供一种制备富楝树精水溶液的方法，包括步骤(a)将楝树精有机溶液对水分配，形成楝树精水溶液，该有机溶液是用极性有机溶剂萃取基本上脱油的楝树种子而形成的，在该极性溶剂中楝树精是可溶的，但多糖和蛋白是基本不溶解的；和(b)将残余油从水溶液中分离，得到富楝树精水溶液。
在这一方面，用极性有机溶剂对基本上脱油的楝树种子的萃取，可以在楝树种子的收获场地或其附近实施，含油的乙酸乙酯溶液(也可以在现场蒸馏)然后被运送到加工设备处所，在那里实施步骤(a)和(b)，将加工过程分开有若干好处，包括—采摘后新鲜的楝树种子，压榨出的楝树精和楝树油的质量最好；和—可降低运输费用，因为楝树精在种子中的浓度是约0.35-0.40％，而在浓缩的有机溶液中的浓度约2-3％。
本发明第一方面的所述实施方案同样适用于第二方面，步骤(a)和(b)等于本发明第一方面所定义方法的步骤(iii)和(iv)。
另一方面，本发明还包括按照所定义方法制备的富楝树精溶液。
另一方面，本发明还进一步包括按照所定义方法制备的富楝树精粉末。
所述粉末优选至少含有45重量％的楝树精。
附图的简要说明现以举例的方式，将本发明的优选实施方案参照相应附图予以说明，其中
图1是本发明的楝树精萃取方法一实施方案的简图；图2是按照现有技术从楝树种子萃取楝树精的方法所制备的甲醇萃取物色谱图；图3是按照图1所描述的方法制备的楝树种子乙酸乙酯萃取物色谱图；图4是按照图1所描述的方法，将乙酸乙酯上清液用水分配后的水中组分色谱图；图5是按照图1所描述的方法，将乙酸乙酯上清液用水分配后，含油的乙酸乙酯中的组分色谱图；图6是按照图1所描述的方法所制备的富楝树精粉末的色谱图。
本发明的优选实施方式从楝树种子制备楝树精粉末的方法一般描述如图1中10所示。
由楝树上收获种子11，干燥至含有约2-3重量％的水分，磨碎并经过压榨机12除去其油成分的约90重量％；然后将油通过压滤器，经过滤脱蜡或者冷却得到清洁的楝树油13；楝树种子11的压榨可以在楝树种子11的收获场地或其附近进行。
由压榨机12制得的榨饼14在逆流萃取单元用乙酸乙酯以约1∶1的比例进行萃取，同样，如果需要，这一萃取步骤也可以在楝树种子11的收获场地或其附近进行。萃取后，不溶于乙酸乙酯的多糖和蛋白大部分留在榨饼中，楝树精和其它三萜烯、二萜烯和残余油分配到乙酸乙酯溶液中，乙酸乙酯萃取物的色谱图如附图3。为了比较，附图2是按照传统方法所制备的楝树种子甲醇萃取物的色谱图，按照传统方法，甲醇萃取物含有多糖和蛋白(色谱图第一大峰)、楝树精(保留时间≈10min.)、其它三萜烯(保留时间20-30min.)和少量油性化合物(保留时间＞30min.)。附图3表明，乙酸乙酯萃取物含有楝树精以及其它三萜烯和油性化合物，与甲醇萃取物相比，含多糖和蛋白的量极少。
然后乙酸乙酯上清液在蒸馏室15进行真空浓缩，将一定比例(如约一半)的乙酸乙酯从上清液中除去。上清液的浓度通过测定其粘度检测，该步骤也可以在楝树种子11的收获场地或其附近进行。浓缩的上清液再对温水(约20-40℃)分配。在该分配中，楝树精、其它三萜烯的大部分和残余油的较强极性组分，与一定量的乙酸乙酯一起转移到水层；附图4所示水中组分的色谱图证实，楝树精几乎全部转移为分配的水组分(图4中色谱图前面的大峰是乙酸乙酯峰)；附图5所示的乙酸乙酯中的组分色谱图证实，极少量的楝树精保留在含油的乙酸乙酯中，但绝大部分其它三萜烯仍基本保持为这一组分。这一分配的动力学非常复杂，因为楝树精在乙酸乙酯的存在下比没有乙酸乙酯存在表现出更高的水溶解性。分配形成一个复杂的多组分体系，甚至一些几乎不溶于水的化合物通过乙酸乙酯被携带到水层，有机层含有极少量的楝树精，但富含较弱极性的三萜烯和二萜烯(“苦质”)，有机层经过蒸馏室17可以回收乙酸乙酯，余下含有许多生物活性化合物的“苦质”油18，回收的乙酸乙酯可以循环再用于萃取榨饼14。
由温水中分配得到的水层含有足量的油性化合物，有碍于直接制备流动性的粉末，在冷却时，发生了可观察到的变化，看到上清液中形成小油滴，据此可以将油和水进行物理分离；将水清液经过油分离器21，在那里溶液旋转经过一系列锥形漏斗(转速优选为约或超过3500rpm)，将油和水根据它们的比重实现物理分离。从分离器21流出的水流22含有楝树精和较强极性的三萜烯，流出油23基本不含有楝树精，但含有较弱极性的三萜烯和二萜烯和油性化合物；如附图1所述，流出油可以和温水分配所得的有机层合并，以及在蒸馏室17进行上述真空蒸馏。
水流22在蒸馏室24进行真空浓缩，直到一定比例(如约75％)的水从中除去，蒸出的水25冷凝并循环再用于上述的温水分配16。
在蒸馏室24浓缩后，水清液含有固体楝树精的细小悬浮物和其它三萜烯以及少量乙酸乙酯萃取延续下来的多糖和蛋白，为了便于形成楝树精粉末，将水悬浮液再进行乙酸乙酯萃取(步骤26)，楝树精和其它三萜烯全部分配到乙酸乙酯层，所得水层由于少量多糖和蛋白的存在而略有变色，可以直接废弃。然后将有机层中的乙酸乙酯于刮壁旋转汽化器27中蒸发，余下楝树精粉末28。附图6的色谱图证实，该粉末富含楝树精，其中的楝树精含量约为48％。蒸出的乙酸乙酯29可以冷凝、与回收的乙酸乙酯19合并，再用于榨饼14的初始萃取。
上清液的其它干燥技术包括微波干燥是显而易见的。
本领域技术人员可以理解，如具体实施方案所示，对本发明所作的诸多变化和/或改进均不背离所概述的本发明的精神和范围，因此，现有实施方案的各个方面均应视为说明性的而不是限定性的。
权利要求
1.制备富楝树精水溶液的方法，包括步骤(i)将磨碎或以其它方式粉碎的楝树种子脱油，除去其中的大部分油成分；(ii)用极性有机溶剂萃取上述的脱油楝树种子，形成楝树精和残余油的有机溶液，在所述极性溶剂中楝树精是可溶的，但多糖和蛋白是基本不溶解的；(iii)将上述有机溶液对水分配，形成楝树精和残余油的水溶液；和(iv)将残余油从所述水溶液中分离，得到富楝树精水溶液。
2.如权利要求1的制备楝树精的方法，该方法进一步包括步骤(v)以极性有机溶剂萃取上述的水溶液，形成楝树精的有机溶液，在该极性有机溶剂中楝树精是可溶的，但多糖和蛋白是基本不溶解的；(vi)蒸发有机溶剂，生成富楝树精粉末。
3.如权利要求1的制备富楝树精水溶液的方法，其中先将楝树种子干燥至含有1-10重量％的水分，优选含有2-4重量％的水分，然后进行压榨制得种子榨饼，由此除去种子的大部分油分。
4.如权利要求1的制备富楝树精水溶液的方法，其中实施压榨的结果是，在压榨过程将至少70重量％，更优选至少80重量％，最优选至少90重量％的油从种子中除去。
5.制备富楝树精水溶液的方法，其中，在步骤(ii)中，用于萃取基本上脱油的榨饼的极性有机溶剂选自乙酸乙酯、丙烯酸甲酯、丁醇、2-丁酮、二甘醇一丁醚、乙二醇一丁醚、甲酸乙酯、甲酸丙酯、呋喃、四氢呋喃、异佛尔酮、2，4-二羟基-4-甲基戊酮、2，4-二甲基戊酮、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二戊酯、1，2-环氧丙烷、癸二酸二丁酯、氯仿、甲苯、苯、二甲硫、乙硫醇、氯乙烷、五氯乙烷、三氯乙烯、1-溴戊烷或其它具有类似介电常数的溶剂以及它们的混合物。
6.如权利要求5的制备富楝树精水溶液的方法，其中在步骤(ii)中，用于萃取基本上脱油的榨饼的极性有机溶剂是乙酸乙酯。
7.如权利要求1的制备富楝树精水溶液的方法，其中在步骤(iii)之前，将步骤(ii)中用于萃取基本上脱油的榨饼的极性有机溶剂通过真空蒸馏进行浓缩。
8.如权利要求7的制备富楝树精水溶液的方法，其中在步骤(iii)之前，将步骤(ii)中用于萃取基本上脱油的榨饼的极性有机溶剂的多至50％的量通过真空蒸馏浓缩除去。
9.如权利要求1的制备富楝树精水溶液的方法，其中步骤(iii)所用水的温度为约20℃-40℃。
10.如权利要求1的制备富楝树精水溶液的方法，其中在油分离步骤(iv)之前，用水分配所形成的水溶液先行冷却。
11.如权利要求1的制备富楝树精水溶液的方法，其中实施分离是将水溶液通过一个分离器，在其中溶液旋转经过一系列锥形漏斗，将油和水根据它们的比重实现物理分离。
12.如权利要求1的制备富楝树精水溶液的方法，其中在步骤(v)，富楝树精的水溶液用一种溶剂萃取，该溶剂选自丙烯酸甲酯、丁醇、2-丁酮、二甘醇一丁醚、乙二醇一丁醚、甲酸乙酯、甲酸丙酯、呋喃、四氢呋喃、异佛尔酮、2，4-二羟基-4-甲基戊酮、2，4-二甲基戊酮、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二戊酯、1，2-环氧丙烷、癸二酸二丁酯、氯仿、甲苯、苯、二甲硫、乙硫醇、氯乙烷、五氯乙烷、三氯乙烯、1-溴戊烷或其它具有相似介电常数的溶剂以及它们的混合物。
13.如权利要求12的制备富楝树精水溶液的方法，其中在步骤(v)中，富楝树精的水溶液用乙酸乙酯萃取。
14.如权利要求12的制备富楝树精水溶液的方法，其中在步骤(v)之前向水溶液中加入盐，以保证楝树精在这一步骤全部从水相迁移。
15.如权利要求1的制备富楝树精水溶液的方法，其中在步骤(v)之前降低水溶液的温度，以减小楝树精在水溶液中的溶解度。
16.如权利要求15的制备富楝树精水溶液的方法，其中水的温度降至10℃或更低。
17.如权利要求17的制备富楝树精水溶液的方法，其中在步骤(vi)，将有机层通过刮壁旋转汽化器，蒸去乙酸乙酯，余下富楝树精粉末。
18.如权利要求1的制备富楝树精水溶液的方法，其中在步骤(vi)蒸出的乙酸乙酯在该方法中没有被其它有机溶剂污染，可进行冷凝并直接循环应用到步骤(ii)的萃取过程。
19.如权利要求2的制备楝树精的方法，其中该方法包括一附加步骤，即，将楝树精粉末溶解于甲醇，再将甲醇蒸发制得含油更低的富楝树精粉末。
20.如权利要求的制备富楝树精水溶液的方法，其中该方法在步骤(vi)之前包括一个过滤步骤。
21.如权利要求20的制备富楝树精水溶液的方法，其中过滤步骤包括将富楝树精上清液通过疏水过滤介质。
22.制备富楝树精水溶液的方法，包括步骤(a)将楝树精有机溶液对水分配，形成楝树精水溶液，该有机溶液是用极性有机溶剂萃取基本上脱油的楝树种子而形成的，在该极性溶剂中楝树精是可溶的，但多糖和蛋白是基本不溶解的；和(b)将残余油从水溶液中分离，得到富楝树精水溶液。
全文摘要
制备富楝树精水溶液或楝树精粉末的方法,包括步骤:(i)将磨碎或以其它方式粉碎的楝树种子(11)脱油,在压榨机(12)中除去其中的大部分油成分;(ii)用极性有机溶剂(如乙酸乙酯)萃取脱油楝树种子(14),形成楝树精和残余油的有机溶液,在该极性溶剂中楝树精是可溶的,但多糖和蛋白是基本不溶解的;(iii)将有机溶液对水分配,形成楝树精和残余油的水溶液;和(iv)将残余油从水溶液中分离,得到富楝树精水溶液。如果需要制备富楝树精粉末,该方法可以进一步包括步骤:(v)以极性有机溶剂萃取所述的水溶液,形成楝树精的有机溶液,在该极性溶剂中楝树精是可溶的,但多糖和蛋白是基本不溶解的;(vi)蒸发有机溶剂,生成富楝树精粉末。
文档编号A61K36/58GK1263531SQ98807109
公开日2000年8月16日 申请日期1998年7月13日 优先权日1997年7月11日
发明者迈克尔·约瑟夫·奥谢, 唐纳德·詹姆斯·布鲁什特, 戴维·约翰·波拉德 申请人:楝树提取物有限公司