肠细菌ompa蛋白在特异导向抗原呈递细胞中的应用的制作方法

专利名称：肠细菌ompa蛋白在特异导向抗原呈递细胞中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及肠细菌OmpA蛋白，优选肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)P40蛋白，在将与之相连的生物活性物质特异导向抗原呈递细胞、尤其是人树突细胞中的应用。本发明还涉及OmpA蛋白在制备用于预防和/或治疗疾病、尤其是与肿瘤抗原相关的癌症、自身免疫疾病或感染性疾病的药物组合物中的应用。
疫苗接种是一种预防或减弱病毒或细菌感染的有效方法。在该领域中接种运动的成功使疫苗的概念可以延伸到其它领域，例如癌症和自身免疫病的领域。例如，对于某些形式的癌症而言，常规治疗例如化疗或放疗的无效和/或其副作用促使了对其它治疗方法的寻找。因此，可使用肿瘤细胞表面表达的特异肿瘤抗原作为免疫治疗以清除这些细胞的靶点。通常在制备这些疫苗时面临的一个主要问题是，当单独给宿主施用这些疫苗时，疫苗抗原的免疫原性不足以诱导可有效地赋予所期望保护的免疫应答。因此通常这些抗原与载体分子共价偶联，这些载体分子为例如白喉毒素表位、破伤风类毒素(TT)、乙肝病毒表面抗原、脊髓灰质炎病毒的VP1抗原或任何其它毒素，或病毒或细菌的抗原如来源于肠细菌外膜的抗原蛋白，这些抗原蛋白具有加强对与之相连的抗原的(体液或细胞)免疫应答的特性，例如来源于肺炎克雷伯氏菌称作P40的OmpA蛋白(描述于国际专利申请WO95/27787和WO 96/14415)。然而，在大多数情况中，已证实为了增加疫苗的有效性另一种成分是必需的，而且目前批准使用于人的唯一佐剂是明矾。
通过免疫学研究，最近发现树突细胞在免疫系统中扮演着一个主要角色。来源于骨髓干细胞的这些细胞是专业性的抗原呈递细胞，参与抗原特异的初次免疫应答(Peters J.等，1996)。它们吞噬或内化抗原并将这些抗原的片段呈递给未刺激过的T细胞。该吞噬在树突细胞表面诱导共刺激分子如CD80和CD86的表达。这些分子使得可以和T细胞发生紧密相互作用(Girolomoni G.和Ricciardi-Castagnoli P.，1997，Immunol.Today，18，102-104)。树突细胞广泛分布在各种组织中。发现这些细胞存在于皮肤和淋巴结器官中(Hinrich J.等，1996，Immunol.Today，17，273-277)。
由于其在呈递抗原和刺激免疫系统方面的有效性，树突细胞已被用于产生抗病毒的(Ludewig B.等，1998，病毒学杂志(J.Virol.)，72，3812-3818；Brossard P.等，1997，免疫学杂志(J.Immunol.)，158，3270-3276)或抗癌的(Nestle F.O.等，1998，Nat.Med.，4，328-332)细胞毒性CTL应答。具体方法包括用目的抗原(肽或细胞裂解物)装载离体的树突细胞，并将这些细胞重新植入患者体内。其它方法包括用编码目的抗原的基因转染离体的树突细胞，并将这些转染细胞重新注入体内(Gilboa E.等，1998，癌症免疫学与免疫治疗(Cancer Immunol.Immunother.)，46，82-87)。这些方法已成功用于小鼠，并且最近已用于人(Hsu F.J.等，1996，Nat.Med.，2，52-58)。装载了抗原的树突细胞通过I类或II类分子呈递肽，并诱导CD4或CD8+T淋巴细胞的激活。因此，如果能使所选抗原如蛋白或多糖，或可转移编码这些抗原的基因的病毒载体指向树突细胞，则将可以改善免疫系统刺激的有效性。此外，抗原呈递细胞(APC)，尤其是树突细胞的特异导向将使得可以省去如下步骤含有肿瘤抗原或病毒载体的自体或异体APC的取出、纯化和体外处理，以及处理后APC的重新植入。
为了特异地导向含有目的活性物质如蛋白或可转移这些目的蛋白编码基因的病毒载体的树突细胞，进行了许多研究，包括鉴定优先与树突细胞结合的分子，或在树突细胞上特异性表达的受体。已在鼠(Jiang W.等，1995，自然(Nature)，375，151-155)和人(Kato M.等，1998，免疫遗传学(Immunogenetics)，47，442-450)的树突细胞上鉴定了抗原装载中涉及的受体DEC 205。该受体的结构分析揭示了被认为参与了携带糖残基的抗原的捕获、内化和/或呈递的糖识别结构域。然而，作者未给出该受体可结合的配体的任何信息。另一方面，作者提及，受体DEC-205的这些被认为参与抗原捕获、内化和/或呈递的糖识别结构域(富含半胱氨酸的结构域)也存在于50多种蛋白包括一些细胞受体中。
因此，目前需要一种能特异导向抗原呈递细胞(APC)，尤其是树突细胞，并能被所述细胞内化的化合物。能特异结合这些细胞，之后被其内化的化合物具有能用作运输和导向生物活性物质的化合物的优点，生物活性物质的有效性通过这些细胞对该物质的结合和/或内化来调整和/或与这些细胞对该物质的结合和/或内化相关。此外，如果寻找的该化合物可容易地通过化学偶联或通过遗传融合导致的偶联与活性物质相连，或如果其可表达在宿主细胞表面或表达在将目的基因转移入这些APC细胞的病毒颗粒的表面，则是有利的。
本发明的作者令人惊奇地证明，肠细菌OmpA型外膜蛋白，尤其是肺炎克雷伯氏菌P40蛋白，不仅能特异结合APC，而且能被所述APC尤其是树突细胞内化。
因此，本发明涉及肠细菌OmpA蛋白或其片段在将与其相连的生物活性物质特异导向抗原呈递细胞中的应用。
在本发明中，“抗原呈递细胞”是指构成免疫系统整体一部分的专业性APC，例如树突细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞或单核细胞。在本发明中，术语“蛋白”也指肽和多肽，术语“OmpA”(“外膜蛋白”)是指A型外膜蛋白。
“OmpA蛋白片段”是指能特异结合APC尤其是树突细胞的OmpA蛋白的氨基酸序列中包括的任何氨基酸序列片段，该片段包括至少5个氨基酸，优选10个氨基酸，或更优选15个氨基酸，而且所述片段可内化进入所述APC。
“生物活性物质”是指任何可发挥治疗活性，而且其活性可通过APC调整的化合物。作为该生物活性物质的例子，可以提及但又不限于免疫原性化合物如抗原或半抗原，它们本质上是蛋白、多糖或寡糖、糖蛋白或脂蛋白，或一般是生物体来源的，而且这些免疫原性化合物可由复杂结构如细菌或病毒颗粒所携带。
“生物活性物质”还指任何可改变APC功能性活动，尤其是其生长、分化或表达系统的化合物。作为该生物活性物质的例子，可提及但又不限于细胞生长因子包括细胞因子(IL-4，IL-3，GM-CSF，TNF-α)，和编码同源或异源目的蛋白并能被APC表达的核酸。
本发明的一个主题还在于本发明肠细菌OmpA蛋白或其片段的应用，其特征在于所述肠细菌OmpA蛋白或其片段特异地与抗原呈递细胞结合，并且所述肠细菌OmpA蛋白或其片段被内化进入抗原呈递细胞中。
优选地，本发明包括本发明肠细菌OmpA蛋白或其片段的应用，其特征在于所述抗原呈递细胞选自树突细胞、单核细胞和B淋巴细胞，更优选树突细胞。
在一个具体的实施方案中，本发明包括本发明肠细菌OmpA蛋白或其片段的应用，其特征在于所述肠细菌OmpA蛋白或其片段采用提取方法从所述肠细菌的培养物获得。
提取细菌膜蛋白的方法是本领域技术人员已知的，在本说明书中不作进一步阐述。可以提及的是，但又不限于，例如Haeuw J.H.等描述的提取方法(Eur.J.Biochem.，255，446-454，1998)。
在另一个优选实施方案中，本发明还包括本发明的肠细菌OmpA蛋白或其片段的应用，其特征在于所述肠细菌OmpA蛋白或其片段通过重组方法获得。
制备重组蛋白的方法目前是本领域技术人员所熟知的，在本说明书中不作进一步阐述；然而，可参考实施例中所描述的方法。在可用于制备这些重组蛋白的细胞中，当然必须提及细菌细胞(Olins P.O.和Lee S.C.，1993，大肠杆菌中外源基因表达的最新进展，Curr.Op.Biotechnology 4520-525)，以及酵母细胞(BuckholzR.G.，1993，用于表达异源基因产物的酵母系统，Curr.Op.Biotechnology 4538-542)，和动物细胞，尤其是哺乳动物细胞的培养物(Edwards C.P.和Aruffo A.，1993，基于COS细胞的瞬时表达系统的目前应用，Curr.Op.Biotechnology 4558-563)，还有可在其中使用例如利用杆状病毒方法的昆虫细胞(Luckow V.A.，1993，表达人基因产物的杆状病毒系统，Curr.Op.Biotechnology4564-572)。
最优选地，本发明应用的特征在于所述肠细菌是肺炎克雷伯氏菌。
具体地，本发明涉及本发明的应用，其特征在于所述肺炎克雷伯氏菌OmpA蛋白或其片段的氨基酸序列包含a)序列SEQ ID No2的氨基酸序列；b)与序列SEQ ID No2具有至少80％，优选至少85％，90％或95％同源性的氨基酸序列；或c)a)或b)中所定义序列的片段的氨基酸序列，其至少有5个氨基酸。
“与参考序列SEQ ID No2具有至少80％，优选至少85％，90％或95％同源性的序列”是指在最佳对齐后，分别与参考序列SEQ ID No2具有至少80％，85％，90％或95％一致程度的氨基酸序列，所述同源序列，或其上述c)中定义的至少5个氨基酸的所述片段的特征在于，其与抗原呈递细胞特异结合，并视情况可内化进入抗原呈递细胞中。
对于本发明，两个核酸或氨基酸序列之间的“一致性百分数”是指在最佳对齐后获得的两个待比较序列间一致的核苷酸或氨基酸残基的百分数，该百分数是纯粹统计学的，这两个序列间的差异是随机分布的，并贯穿它们的整个长度。最佳对齐是指按下文计算的待比较两个序列间一致性百分数最高的对齐方式。两个核酸或氨基酸序列的序列比较常规是通过将它们最佳对齐后，比较这些序列来进行的，所述比较通过片段或通过“比较窗”来实现，以便鉴定和比较局部区域的序列相似性。对于比较，序列的最佳对齐除了手工方法外，可通过如下方式产生Smith和Waterman(1981)的局部同源性算法[Ad.App.Math.2482]，Neddleman和Wunsch(1970)的局部同源性算法[分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48443]，Pearson和Lipman(1988)的相似性搜索方法[美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)852444]，采用这些算法的计算机软件(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI，或BLASTN或BLASTX，Altschul等，分子生物学杂志，215,403，1990)。
两个核酸或氨基酸序列的一致性百分数通过在比较窗中比较这两个最佳对齐的序列来决定，在比较窗中对于这两个序列间的最佳对齐，待比较的核酸或氨基酸序列区域相对于参考序列可含有添加或缺失。一致性百分数通过如下方式计算确定两个序列间核苷酸或氨基酸残基一致的一致性位置的数目，用比较窗中的总位置数除该一致性位置数，并将所获结果乘以100以获得这两个序列的一致性百分数。
本发明还包括本发明的应用，其特征在于所述生物活性物质选自蛋白或多肽、脂肽、多糖、寡糖、核酸、脂和化学物质。
本发明的一个主题还在于本发明肠细菌OmpA蛋白或其片段的应用，其特征在于所述生物活性物质通过共价连接，尤其是通过化学偶联，与所述OmpA蛋白或其片段偶联。
在一个具体的实施方案中，本发明的应用的特征在于，为了便于化学偶联，将一或多个连接元件引入所述OmpA蛋白或其片段中，和/或所述生物活性物质中；优选地引入的所述连接元件是氨基酸。
根据本发明，为了便于OmpA蛋白或其片段和生物活性物质例如抗原或半抗原间的偶联反应，可以引入一或多个连接元件，尤其是氨基酸。根据本发明，OmpA蛋白或其片段和生物活性物质例如抗原或半抗原间的共价偶联可在OmpA蛋白或其片段的N-或C-末端进行。进行该偶联的双功能试剂将根据选择进行该偶联的OmpA蛋白或其片段的末端和待偶联的生物活性物质的性质来决定。
在另一个具体实施方案中，本发明的应用的特征在于，通过共价连接偶联有所述OmpA蛋白的所述生物活性物质是编码所述生物活性物质和所述OmpA蛋白或其片段的核酸结构表达产生的重组嵌合蛋白。
与所述OmpA蛋白或其片段偶联产生的连接物可通过遗传重组来制备。该嵌合或杂合蛋白(连接物)可使用重组DNA技术，通过向编码所述OmpA蛋白或其片段的DNA序列插入或添加编码本质是蛋白的所述生物活性物质的序列来产生。
合成杂合分子的方法包括遗传工程中用于构建编码所需多肽序列的杂合多核苷酸的方法。可方便地参考例如D.V.Goeddel描述的获得编码融合蛋白基因的技术(基因表达技术，酶学方法(Methodsin Enzymology)，第185卷，3-187，1990)。
最特别地，本发明涉及本发明肠细菌OmpA蛋白或其片段的应用，其特征在于所述生物活性物质是抗原或半抗原。
在另一方面，本发明涉及本发明肠细菌OmpA蛋白或其片段调整针对抗原或半抗原的免疫应答，优选改善针对抗原或半抗原的免疫应答的应用。
本发明还包括本发明的肠细菌OmpA或其片段在制备通过活性物质用于预防或治疗疾病的药物组合物中的应用，该活性物质的有效性通过抗原呈递细胞，尤其是树突细胞对其的内化来调整和/或与该内化相关。
优选地，根据本发明的应用涉及一种药物组合物的制备，其中所述药物组合物旨在预防或治疗癌症、优选与肿瘤抗原相关的癌症、自身免疫疾病、变态反应、移植物排斥、心血管疾病、中枢神经系统疾病、炎症、感染性疾病或与免疫缺陷相关的疾病。
本发明的一个主题尤其是本发明的肠细菌OmpA蛋白或其片段在制备旨在预防或治疗感染性疾病或与肿瘤抗原相关的癌症的疫苗药物组合物中的应用。
本发明还包括本发明的应用，其特征在于所述药物组合物还包含促进免疫应答的佐剂例如明矾。
本发明还包括本发明的应用，其特征在于所述药物组合物以可改善其稳定性和/或免疫原性的形式运载，尤其是可表达重组嵌合蛋白的脂质体、病毒载体或转化宿主细胞形式，其中该重组嵌合蛋白是由编码所述生物活性物质和所述OmpA蛋白或其片段的核酸结构的表达产生的。
以下的


和实施例旨在阐述本发明，而不是以任何方式限制其范围。

图1rP40-Alexa与各种细胞类型的结合。在rP40-Alexa与各种细胞类型孵育后，rP40-Alexa的特异结合(粗线)通过流式细胞计测量。非相关蛋白(血型糖蛋白)的结合表示为细线。
图2rP40浓度对树突细胞结合的影响。
图3未标记的rP40对rP40-Alexa与树突细胞结合的抑制。
在树突细胞与各种浓度的未标记rP40共同孵育之后，加入rP40-Alexa。rP40-Alexa的结合通过流式细胞计定量。
图4对各种标记蛋白与树突细胞结合的评价。
Alexa标记的P40、TT(破伤风类毒素)和BB(来源于链球菌G蛋白)载体蛋白与树突细胞一起孵育(粗线)。非相关蛋白用作阴性对照(细线)。结合通过流式细胞计测量。
图5A和5BrP40-Alexa内化进入树突细胞。
在4℃(左侧画面，图5A)或37℃(右侧画面，图5B)将树突细胞和rP40-Alexa一起孵育后，通过聚焦显微镜观察细胞(×220放大倍数)。
实施例1rP40基因的克隆使用肺炎克雷伯氏菌IP I145的基因组DNA，通过PCR扩增获得称作rP40的重组P40蛋白的编码基因(Nguyen等，基因(Gene)，1998)。将rP40的编码基因片段插入各种表达载体中，尤其是处于Trp操纵子启动子控制下的载体中。rP40蛋白的氨基酸序列和编码P40蛋白的核苷酸序列分别是下文序列表中的序列SEQ ID No2和SEQID No1。
用表达载体pvaLP40转化大肠杆菌K12生产菌株。rP40蛋白以包涵体的形式大量产生(＞10％，蛋白g/生物干重g)。该实施例仅是rP40表达的说明，但其可扩展到其它菌株，以及其它表达载体。实施例2发酵产生rP40融合蛋白的方法在含有250ml具有氨苄青霉素(100ug/ml，Sigma)和四环素(8ug/ml，Sigma)的TSB(胰胨豆胨培养液，Difco)培养基的三角瓶中接种上述重组大肠杆菌株。37℃孵育过夜，然后在发酵罐(Biolafitte，法国)中用200ml该培养物接种2升培养基。极为常规地，该培养基可由已知使细菌细胞生长的、补充有维生素和/或酵母提取物的化学试剂组成。
发酵过程中控制的参数有pH、搅动、温度、氧气供给水平和联合能源(甘油或葡萄糖)的供给。一般地，pH调节至7.0，温度固定在37℃。通过以恒定流速(12ml/h)供给甘油(87％)控制生长，以便维持30％的溶解氧张力信号。当培养物的浊度(580nm处测量)达到80(大约培养24小时之后)，通过加入吲哚丙烯酸(IAA)至25mg/l终浓度，引发蛋白的产生。孵育大约4小时后，通过离心收获细胞。获得的生物量温重大约是200g。实施例3提取和纯化rP40蛋白的方法rP40的提取培养液离心(4000rpm，10min，4℃)后，将细胞重悬在25mMTris-HCl缓冲液(pH 8.5)中。溶菌酶(0.5g/升，室温1小时/轻柔搅动)处理后获得不溶性物质或包涵体。将通过离心(10000g，15min，4℃)获得的包涵体沉淀置于含有5mM MgCl2的25mMTris-HCl缓冲液(pH 8.5)中，然后离心(10000g，15min)。
在含有7M尿素(变性剂)和10mM二硫苏糖醇(二硫键的还原)的25mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)中，37℃溶解包涵体2小时。离心(10 000g，15min)除去不溶性颗粒。
然后用13倍体积含有NaCl(8.76g/l)和Zwittergent 3-14(0.1％，w/v)的25mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)进行重悬。溶液在室温轻柔搅拌下过夜，并保持与空气的接触(通过稀释和二硫键的再氧化促进蛋白的复性)。rP40蛋白的纯化阴离子交换层析步骤再一次离心后，溶液对含有0.1％Zwittergent 3-14的25mMTris-HCl缓冲液(pH 8.5)(100×缓冲液体积)于4℃透析过夜。
将该透析液装载在经上述缓冲液以15cm/h的线性流速平衡过的含有强阴离子交换型支持物的柱子上。在280nm处检测蛋白。用含有0.2M NaCl的25 mM Tris-HCl(pH 8.5)，0.1％Zwittergent 3-14缓冲液，以60cm/h的线性流速洗脱rP40蛋白。阳离子交换层析步骤将含有rP40蛋白的部分合并，并通过超滤进行浓缩，对于大约100ml体积借助于使用YM10型Diaflo膜(分离阈值10kDa)的Amicon搅拌室系统，对于更大体积则借助于使用具有10kDa分离阈值的膜板的Minitan Millipore切线流过滤系统。由此浓缩的部分在4℃对含有0.1％Zwittergent 3-14的20mM柠檬酸缓冲液(pH 3.0)透析过夜。
将该透析液装载在含有强阳离子交换型支持物(Biorad MacroPrep High S凝胶)的柱子上，该柱子已用含有0.1％Zwittergent3-14的20mM柠檬酸缓冲液(pH 3.0)平衡过。在0.7M NaCl浓度时洗脱出rP40蛋白(速度为61cm/h)。电泳图谱显示了大约95％的纯度。通过SDS-PAGE检查蛋白的状态。从肺炎克雷伯氏菌膜提取的P40蛋白根据其变性或天然形式具有特征性的电泳行为(迁移)。实际上，在变性剂如尿素或盐酸胍作用下，或经SDS存在下100℃加热的变性形式(α螺旋结构)相比，天然形式(β片层结构)具有较低的分子量。无论复性在有或无0.1％(w/v)Zwittergent 3-14时进行，复性结束时rP40蛋白均不能正确复性。另一方面，在对含有0.1％Zwittergent 3-14的25mM Tris-HCl(pH 8.5)缓冲液透析后获得完全复性。然而，应该注意，只有稀释步骤和室温处理本身均在有Zwittergent 3-14下进行时，才可实现该复性(无去污剂时产生阴性结果)。实施例4rP40与抗原呈递细胞(APC)的特异结合，方法学人T淋巴细胞的纯化通过离心(1800rpm，20min，室温)，在水溶性聚蔗糖(Ficoll)梯度上，从健康自愿者的外周血分离单核细胞(MNC)。离心后，收获位于ficoll/血浆分界面的MNC，用完全培养基(CM)(RPMI 1640＋10％ FCS＋L－谷氨酰胺＋抗生素)洗涤两次。然后通过玫瑰花结技术分离T淋巴细胞，该技术利用了T淋巴细胞结合羊红细胞(SRBC)的能力。简单地说，MNC与SRBC在4℃孵育1小时。在ficoll梯度上离心后，B淋巴细胞和单核细胞位于分界面，而结合SRBC的T淋巴细胞位于细胞沉淀中。回收细胞沉淀并用低渗盐溶液裂解SRBC后，T淋巴细胞的纯度通过流式细胞计用抗CD3的抗体评价，其大于95％。人单核细胞的纯化使用MACS(磁性活性细胞分拣仪)技术通过正向选择从MNC中纯化单核细胞。用偶联于磁性颗粒的抗CD14抗体标记MNC，然后通过磁化柱。与抗体-胶粒复合物结合的单核细胞留在柱中，而未结合抗体的细胞经连续冲洗洗脱。紧接着，通过在无磁铁的情况下进行洗脱解离单核细胞。所收集部分的纯度大于98％。从单核细胞产生人树突细胞(DC)在存在IL 4(20ng/ml)和GMCSF(20ng/ml)时，在CM中以106/ml的浓度培养纯化单核细胞6-7天。在此阶段产生的DC是未成熟的DC，该DC表达CDIa，但不表达或表达很少的CD83。采用流式细胞计技术验证其表型。从扁桃体纯化人B淋巴细胞将扁桃体研碎，并将收获的细胞装载在ficoll梯度上。洗涤分界面回收的MNC，然后将该细胞与SRBC一起孵育。Ficoll离心后，B淋巴细胞位于分界面，而结合SRBC的T淋巴细胞位于细胞沉淀中。然后洗涤B淋巴细胞。通过流式细胞计验证的细胞纯度大于96％。细胞系的培养在CM中培养RPMI 8866、DAUDI、HL60和Jurkat细胞系。rP40与Alexa488荧光染料的偶联在PBS中将rP40蛋白的浓度调节至2mg/ml。向500ul蛋白中加入50ul 1M碳酸氢纳。然后将该溶液转移至含有Alexa488染料的反应管中，并在室温进行偶联。1小时后，加入15ul羟胺终止偶联反应。通过柱纯化将标记蛋白与游离染料分离开。
然后通过比色分析估计Alexa488标记的rP40的量。
-通过流式细胞计研究P40-Alexa488与各种细胞的结合。
对于每次标记，用FACS缓冲液(PBS＋1％BSA＋0.01％叠氮化钠)洗涤200 000个细胞，并在锥形底96孔板中重悬在50ul FACS缓冲液中。然后加入P40-Alexa488蛋白或对照蛋白(血型糖蛋白-Alexa488)至10-6M，4℃孵育大约1小时。孵育后，用FACS缓冲液洗涤细胞3次，然后将细胞重悬在200ul同样的缓冲液中，并通过流式细胞计分析。结果rP40蛋白与人APC选择性结合，这些APC例如为-来源于人外周血液的单核细胞，-外周血单核细胞产生的树突细胞，-来源于扁桃体的B淋巴细胞，B淋巴细胞系DAUDI和RPMI 8866(参照图1)，和来源于外周血的B淋巴细胞(结果未显示)。
没有观察到与不能呈递抗原的细胞的结合，这些细胞例如为非活化外周血T淋巴细胞、非活化Jurkat T淋巴细胞系和非活化HL60单核细胞系。实施例5rP40与DC的结合是特异的1)rP40与DC的结合是剂量依赖性的。方法用FACS缓冲液洗涤200000个DC，并在含有各种浓度的rP40(从10-10至5×10-6M)的50ul缓冲液中于4℃孵育大约1小时。孵育后，用FACS缓冲液洗涤细胞3次，然后将细胞重悬在50ul含有5ug/ml抗P40兔多克隆抗体或对照兔IgG抗体的同样缓冲液中。孵育20分钟后，再次洗涤细胞，并在含有荧光素标记的羊抗兔IgG多克隆抗体(稀释至1∶200)的100ul FACS缓冲液中进行孵育。孵育20分钟后，洗涤细胞，用FACS缓冲液重悬，并通过流式细胞计进行分析。结果从10-7M起rP40与DC的结合是显著的(p＜0.001)，并在2×10-6M达到最大值(参见图2)。
2)未标记的rP40蛋白减少rP40 Alexa488与DC的结合方法为了阐明P40结合的特异性，在rP40-Alexa488与未标记rP40之间进行竞争。DC与5×10-8-2×10-6M未标记rP40一起孵育10分钟，然后加入P40-Alexa488(使用浓度为2×10-6M)。4℃孵育20分钟后，按前述方法通过流式细胞计分析细胞。结果未标记rP40蛋白以剂量依赖性方式抑制2×10-6M P40-Alexa488的结合(当以2×10-6M使用时，抑制大于60％)(参见图3)。实施例6在TT、BB和rP40载体蛋白中，仅有rP40蛋白结合DC方法破伤风类毒素(TT)和BB载体蛋白(来源于链球菌G蛋白，对人白蛋白具有亲和性)，以及rP40蛋白和对照蛋白血型糖蛋白A均按上述方法用Alexa488标记。按前述方法通过流式细胞计评价这些分子与DC的结合。简单地说，用FACS缓冲液洗涤200 000DC细胞，然后在存在10-6M每种Alexa488标记蛋白的情况下在50ul缓冲液中4℃孵育大约1小时。孵育后，用FACS缓冲液洗涤细胞3次，然后重悬在200ul同样的缓冲液中，并通过流式细胞计进行分析。结果在10-6M浓度时，仅有rP40结合树突细胞。未检测到TT、BB和血型糖蛋白的结合(参见图4)。
孵育后，用PBS-BSA缓冲液洗涤细胞3次，并将细胞重悬在100ul同样的缓冲液中，然后在显微镜载玻片上进行细胞离心。然后通过聚焦显微镜分析该载玻片。结果对37℃与rP40-Alexa共同孵育的细胞进行的观察显示出细胞质内标记，该标记在30分钟后可检测到，孵育2小时后仍可观察到37℃孵育1小时后获得的代表性结果显示在图5B中。当细胞在4℃与rP40一起孵育时，观察到膜的标记而不是细胞质内标记(参见图5A)，而在存在血型糖蛋白-Alexa时(37℃孵育及4℃孵育后)未观察到标记。化学分子Alexa的这个例子说明，任何与P40偶联的化学分子均可被递送给抗原呈递细胞，包括树突细胞。
序列表<110>PIERRE FABRE MEDICAMENT<120>肠细菌OmpA蛋白在特异导向抗原呈递细胞中的应用<130>D17777<150>FR9814007<151>1998-11-06<150>PCT/FR99/02734<151>1999-11-08<160>2<170>PatentIn Ver.2.2<210>1<211>1035<212>DNA<213>肺炎克雷伯氏菌<220><221>外显子<222>(1)..(1032)<220><221>内含子<222>(1033)..(1035)<220><221>CDS<222>(1)..(1032)<400>1atg aaa gca att ttc gta ctg aat gcg gct ccg aaa gat aac acc tgg48Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp1 5 10 15tat gca ggt ggt aaa ctg ggt tgg tcc cag tat cac gac acc ggt ttc96Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe20 25 30tac ggt aac ggt ttc cag aac aac aac ggt ccg acc cgt aac gat cag 144Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln35 40 45ctt ggt gct ggt gcg ttc ggt ggt tac cag gtt aac ccg tac ctc ggt 192Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly50 55 60ttc gaa atg ggt tat gac tgg ctg ggc cgt atg gca tat aaa ggc agc 240Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser65 70 75 80gtt gac aac ggt gct ttc aaa gct cag ggc gtt cag ctg acc gct aaa 288Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys85 90 95ctg ggt tac ccg atc act gac gat ctg gac atc tac acc cgt ctg ggc 336Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly100 105 110ggc atg gtt tgg cgc gct gac tcc aaa ggc aac tac gct tct acc ggc 384Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly115 120 125gtt tcc cgt agc gaa cac gac act ggc gtt tcc cca gta ttt gct ggc 432Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly130 135 140ggc gta gag tgg gct gtt act cgt gac atc gct acc cgt ctg gaa tac 480Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr145 150 155 160cag tgg gtt aac aac atc ggc gac gcg ggc act gtg ggt acc cgt cct 528Gln Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro165 170 175gat aac ggc atg ctg agc ctg ggc gtt tcc tac cgc ttc ggt cag gaa 576Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Glu180 185 190gat gct gca ccg gtt gtt gct ccg gct ccg gct ccg gct ccg gaa gtg 624Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val195 200 205gct acc aag cac ttc acc ctg aag tct gac gtt ctg ttc aac ttc aac 672Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn210 215 220aaa gct acc ctg aaa ccg gaa ggt cag cag gct ctg gat cag ctg tac 720Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr225 230 235 240act cag ctg agc aac atg gat ccg aaa gac ggt tcc gct gtt gtt ctg 768Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu245 250 255ggc tac acc gac cgc atc ggt tcc gaa gct tac aac cag cag ctg tct 816Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser260 265 270gag aaa cgt gct cag tcc gtt gtt gac tac ctg gtt gct aaa ggc atc 864Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile275 280285ccg gct ggc aaa atc tcc gct cgc ggc atg ggt gaa tcc aac ccg gtt 912Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val290 295 300act ggc aac acc tgt gac aac gtg aaa gct cgc gct gcc ctg atc gat 960Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp305 310 315 320tgc ctg gct ccg gat cgt cgt gta gag atc gaa gtt aaa ggc tac aaa1008Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys325 330335gaa gtt gta act cag ccg gcg ggt taa1035Glu Val Val Thr Gln Pro Ala Gly340<210>2<211>344<212>PRT<213>肺炎克雷伯氏菌<400>2Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp1 5 10 15Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe20 25 30Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln35 40 45Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly50 55 60Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser65 70 75 80Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys85 90 95Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly100 105 110Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly115 120 125Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly130 135 140Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr145 150 155 160Gln Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro165 170 175Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Glu180 185 190Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val195 200 205Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn210 215 220Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr225 230 235 240Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu245 250 255Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser260 265 270Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile275 280 285Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val290 295 300Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp305 310 315 320Cvs Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys
325 330335Glu Val Val Thr Gln Pro Ala Gly340
权利要求
1. 肠细菌OmpA蛋白或其片段在制备旨在使与其相连的生物活性物质特异导向抗原呈递细胞的药物组合物中的应用。
2. 权利要求1的应用，其特征在于所述肠细菌OmpA蛋白或其片段特异地与抗原呈递细胞结合。
3. 权利要求1或2的应用，其特征在于所述肠细菌OmpA蛋白或其片段被内化进入抗原呈递细胞。
4. 权利要求1至3之任意一项的应用，其特征在于所述抗原呈递细胞选自树突细胞、单核细胞和B淋巴细胞。
5. 权利要求4的应用，其特征在于所述抗原呈递细胞是树突细胞。
6. 权利要求1至5之任意一项的应用，其特征在于所述肠细菌OmpA蛋白或其片段采用提取方法从所述肠细菌的培养物获得。
7. 权利要求1至5之任意一项的应用，其特征在于所述肠细菌OmpA蛋白或其片段通过重组方法获得。
8. 权利要求1至7之任意一项的应用，其特征在于所述肠细菌是肺炎克雷伯氏菌。
9. 权利要求8的应用，其特征在于所述肠细菌OmpA蛋白或其片段的氨基酸序列包含a)序列SEQ ID No.2的氨基酸序列；b)与序列SEQ ID No.2有至少80％同源性的氨基酸序列；或c)a)或b)所定义序列的具有至少5个氨基酸的片段的氨基酸序列。
10. 权利要求1至9之任意一项的应用，其特征在于所述生物活性物质选自肽、脂肽、多糖、寡糖、核酸、脂和化学物质。
11. 权利要求10的应用，其特征在于所述生物活性物质与所述OmpA蛋白或其片段通过共价连接偶联。
12. 权利要求11的应用，其特征在于通过共价连接进行的偶联是化学偶联。
13. 权利要求12的应用，其特征在于为了便于化学偶联，在所述OmpA蛋白或其片段中和/或所述生物活性物质中引入一或多个连接元件。
14. 权利要求13的应用，其特征在于引入的所述连接元件是氨基酸。
15. 权利要求11的应用，其特征在于通过共价连接与所述OmpA蛋白或其片段偶联的所述生物活性物质是由编码所述生物活性物质和所述OmpA蛋白或其片段的核酸结构的表达产生的重组嵌合蛋白。
16. 权利要求10-15的应用，其特征在于所述生物活性物质是抗原或半抗原。
17. 权利要求1-16的应用，用于调整针对抗原或半抗原的免疫应答。
18. 权利要求17的应用，用于改善针对抗原或半抗原的免疫应答。
19. 权利要求1-18的应用，用于制备旨在通过活性物质预防或治疗疾病的药物组合物，其中所述活性物质的有效性通过抗原呈递细胞对其的内化来调整和/或与此相关。
20.权利要求19的应用，用于制备旨在通过活性物质预防或治疗疾病的药物组合物，其中所述活性物质的有效性通过树突细胞对其的内化来调整和/或与此相关。
21. 权利要求19和20之任意一项的应用，用于制备旨在预防或治疗癌症、优选与肿瘤抗原相关的癌症、自身免疫疾病、变态反应、移植物排斥、心血管疾病、中枢神经系统疾病、炎症、感染性疾病或与免疫缺陷相关的疾病的药物组合物。
22. 权利要求21的应用，用于制备旨在预防或治疗感染性疾病或与肿瘤抗原相关的癌症的疫苗药物组合物。
23. 权利要求19-22之任意一项的应用，其特征在于所述药物组合物还包含免疫佐剂。
24. 权利要求19-23之任意一项的应用，其特征在于所述药物组合物以可改善其稳定性和/或免疫原性的形式进行运载。
25. 权利要求24的应用，其特征在于所述药物组合物以由于编码所述生物活性物质和所述OmpA蛋白或其片段的核酸结构的表达而可产生重组嵌合蛋白的脂质体、病毒载体、或转化宿主细胞的形式进行运载。
全文摘要
本发明涉及肠细菌OmpA蛋白,优选肺炎克雷伯氏菌P40蛋白,在与之相连的生物活性物质特异导向抗原呈递细胞,尤其是人树突细胞中的应用。本发明还涉及OmpA蛋白在制备用于预防和/或治疗疾病,尤其是涉及肿瘤相关抗原的癌症、自身免疫疾病或感染性疾病的药物组合物中的应用。
文档编号A61P29/00GK1326360SQ9981345
公开日2001年12月12日 申请日期1999年11月8日 优先权日1998年11月6日
发明者J－Y·邦内佛伊, S·雷科奈特, J－P·奥布利, P·让涅, T·鲍桑特 申请人:皮埃尔法博赫药品公司