基于中国人群的原代人源乳腺癌移植瘤模型的建立方法及模型的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医疗评价、检测技术领域，具体地说涉及基于中国人群的原代人源乳腺癌移植瘤模型的建立方法及模型。
【背景技术】
[0002]在女性生殖系恶性肿瘤中，乳腺癌约占全身恶性肿瘤的7%?10%，发病率占妇科恶性肿瘤的第一位，全世界每年新发乳腺癌越150万例，死亡57万例。乳腺癌的发病在世界范围内呈明显上升趋势，无论在高发区还是低发区，乳腺癌发病率均以5-20%的不同速度上升。
[0003]乳腺癌动物模型被普遍应用于抗乳腺癌药物筛选和药效学研宄，已有较多文献报道了现有的乳腺癌动物模型在抗乳腺癌药物筛选和药效学研宄上的应用。乳腺癌动物模型的制作对研宄乳腺癌的病因、发病机理，从而对其进行有效预防、提高治疗效果起到非常关键的作用，尤其在抗癌药物的药理研宄中更为重要。
[0004]自发性和诱发性乳腺癌动物模型发生的条件比较自然，与人类患病过程更为相似，还有利于观察遗传因素及环境因素对肿瘤发生的影响，但此模型肿瘤发生的潜伏期长，病程与癌块大小无法，成功率低，故均不适合乳腺癌治疗药物的药效学评价。
[0005]移植性乳腺癌模型的移植物来源于自发性或诱发性乳腺肿瘤细胞株，或人类乳腺细胞株。通过瘤细胞悬液注射、瘤组织小块接种等方法将肿瘤原位或异位植入动物体内。瘤株的建立过程，也是肿瘤在动物间反复传代的过程，大概经过20代以后，它的组织类型与生长特性已趋稳定，并能在同系或同种受体动物中继续传代，即成为一个可移植的瘤株。目前人类肿瘤的荷瘤动物模型研宄较多的是移植瘤模型，以异种移植模型为主，移植方法包括组织块移植法，细胞种植法，肾包膜下移植法等。
[0006]目前用于移植的人乳腺癌细胞系有二十多种，主要包括MCF-7、BT-474、T47D、HBL-100、MDA-MB-435细胞等，其中应用较多的是MCF-7细胞。尽管已有许多用Nod-SCID鼠重建人体免疫系统和移植人类肿瘤成功的报道，但是由于细胞系传代过多已经积累了很多突变即在很多方面它的生理学特性已经改变，很多在我们真实的人体内的乳腺癌的生物学特性无法用细胞系移植瘤模型去研宄，在细胞系移植瘤模型上得到的研宄结果也很多无法用于临床病人的治疗实践当中。相比之下，原代人源乳腺癌移植瘤模型直接来源于病人的术中的乳腺癌组织，可以基本上真实的反映乳腺癌的生物学特性，在原代人源乳腺癌移植瘤模型上取得的研宄成果也能较直接应用于日常的乳腺癌病人的治疗当中。而目前尚未见国内外有关基于中国人群的原代人源乳腺癌移植瘤模型的报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，提供一种基于中国人群的原代人源乳腺癌移植瘤模型的建立方法。
[0008]本发明的目的之一在于提供一种基于中国人群的原代人源乳腺癌移植瘤模型。
[0009]本发明一方面公开了一种基于中国人群的原代人源乳腺癌移植瘤模型的建立方法，包括如下步骤:
[0010]I)人乳腺癌组织标本的获取
[0011]取人乳腺癌组织标本放入预冷装有1640的离心管中并埋入冰中，在20分钟内送入动物房；
[0012]2)第一次接种
[0013]将步骤I)获取的人乳腺癌组织标本倒入装有4°C含双抗PBS的培养皿中清洗，然后将人乳腺癌组织标本剪成块状移入套管针内备用；第一次接种小鼠在接种前4到5天前依托泊苷腹腔注射抑制免疫，接种时，将第一次接种小鼠两侧背部剃毛，剃毛部位酒精消毒处理，然后在第一次接种小鼠上肢近端背侧的进针部位剪小口，进针送人乳腺癌组织标本进行接种，接种完毕后，进针部位消毒处理；
[0014]3)培养第一次接种小鼠
[0015]喂养第一次接种小鼠形成瘤体体积在300-500mm3的第一次瘤体小鼠，喂养过程中，喂养含雌激素的饮用水；另外喂养过程中每周换笼两次，换笼时，将新的笼盖、笼盒喷洒75%酒精溶液，然后置于超净台内紫外线照射消毒处理；
[0016]4)第二次接种
[0017]采用颈椎脱臼法处死步骤3)培养的成瘤小鼠，瘤体部位消毒后游离下肿瘤组织放入装有4°C的PBS培养皿中；然后把肿瘤组织剪成大小约2*2mm小块，留2块3*3mm大小待做石蜡；将肿瘤小块装入套管针备用；第二次接种小鼠在接种前4到5天前依托泊苷腹腔注射抑制免疫，接种时，将第二次接种小鼠两侧背部剃毛，剃毛部位酒精消毒处理，然后在第二次接种小鼠上肢近端背侧的进针部位剪小口，进针送人乳腺癌组织标本进行接种，接种完毕后，进针部位消毒处理；
[0018]5)培养第二次接种小鼠
[0019]喂养第二次接种小鼠形成瘤体体积在300-500mm3的第二次瘤体小鼠，喂养过程中，喂养含雌激素的饮用水；另外喂养过程中每周换笼两次，换笼时，将新的笼盖、笼盒喷洒75%酒精溶液，然后置于超净台内紫外线照射消毒处理；
[0020]6)第三次接种
[0021]采用颈椎脱臼法处死步骤5)培养的第二次成瘤小鼠，瘤体部位消毒后游离下肿瘤组织放入装有4°C的PBS培养皿中；然后把肿瘤组织剪成大小约2*2mm小块，留2块3*3_大小待做石蜡；将肿瘤小块装入套管针备用；第二次接种小鼠在接种前4到5天前依托泊苷腹腔注射抑制免疫，接种时，将第二次接种小鼠两侧背部剃毛，剃毛部位酒精消毒处理，然后在第二次接种小鼠上肢近端背侧的进针部位剪小口，进针送人乳腺癌组织标本进行接种，接种完毕后，进针部位消毒处理；
[0022]7)培养第三次接种小鼠
[0023]喂养第三次接种小鼠形成瘤体体积在300-500mm3的第三次瘤体小鼠建成乳腺癌动物模型，喂养过程中，喂养含雌激素的饮用水；另外喂养过程中每周换笼两次，换笼时，将新的笼盖、笼盒喷洒75%酒精溶液，然后置于超净台内紫外线照射消毒处理。
[0024]在本发明的一个优选实施例中，所述雌激素水溶液的配制方法是:先将1.5mg17β雌二醇溶解于10ul 75%的酒精溶液中进行杀菌，然后再将所配制的10ul 17 β雌二醇酒精溶液溶入250ml饮用水中即可。这样做的目的是由于免疫缺陷小鼠很容易遭受细菌感染而死亡，本发明先将17β雌二醇溶入75%酒精溶液中就可以杀灭绝大部分的细菌再溶解在无菌饮用水中喂食免疫缺陷小鼠，从而实现无菌喂养，不会对免疫缺陷小鼠造成污染。再者现有皮下植入雌激素药片刺激小鼠肿瘤生长的方法只能维持90天，而本发明小鼠第一次成瘤基本上都要180天左右，因此注射雌激素无法达到稳定对小鼠肿瘤的刺激生长。
[0025]在本发明的一个优选实施例中，所述小鼠可以选自裸鼠、SCID鼠或Nod-SCID鼠。
[0026]在本发明的一个优选实施例中，所述人乳腺癌组织标本为空芯针穿刺乳腺癌标本、手术乳腺癌标本、转移病人肝穿刺标本、转移病人肺穿刺标本或转移病人骨穿刺标本。
[0027]本发明第二方面公开了基于中国人群的原代人源乳腺癌移植瘤模型，采用前述方法建立而获得。
[0028]该基于中国人群的原代人源乳腺癌移植瘤模型可作抗乳腺癌药物筛选和药效学研宄中的试验动物。
[0029]本发明直接利用人乳腺癌组织标本来建立原代人源乳腺癌移植瘤模型，一定程度上开创了利用中国人群的原代人源乳腺癌移植瘤模型去研宄真实人体内的乳腺癌的生物学特性的先河，其在该模型上建立的研宄成果可用于临床病人的治疗并能够筛选出最适合每个中国乳腺癌病人的药物，克服了国内现有移植瘤模型所存在的因为传代过多所积累的很多突变所造成的生物学特性的改变，无法真实反映人体内的乳腺癌的生物学特性的问题。
[0030]本发明在国内外率先采用饮水雌激素结合联合免疫缺陷的小鼠的方法进行原代人源乳腺癌移植瘤模型的建立，国外虽已采用联合免疫缺陷的小鼠(SCID鼠或Nod-SCID鼠)进行相关模型的建立，但所使用的给予雌激素的方法不能实现对移植瘤的长期稳定的刺激，而饮水雌激素恰恰能实现对原代人源乳腺癌移植瘤生长的稳定和持久的刺激。
【附图说明】
[0031]图1为本发明的基于中国人群的原代人源乳腺癌移植瘤模型(第5代，Ρ5)与乳腺癌组织来源病人的免疫组化情况对比示意图。
【具体实施方式】
[0032]1.材料
[0033]1.1 动物
[0034]1.1.1.Female SCID 小鼠 4_6ws0
[0035]1.1.2.上海瑞金医院动物房饲养。
[0036]1.1.3.雌激素为17 β雌二醇。含雌激素的饮用水的配制方法是先将1.5mgl7 0雌二醇溶解于10ul 75%的酒精溶液中进行杀菌，然后再将所配制的10ul 17β雌二醇酒精溶液溶入250ml饮用水中即可。
[0037]1.2器械及耗材
[0038]1.2.1刮毛器、打洞器(耳号钳)、电子秤、卡尺、培养皿、15ml离心管
[0039]1.2.21640、10%福尔马林、Allprotect tumor tissue agent、P