苷作用后的细菌生存率。计算公式为： 生存率（％)=(加入肌苷的活菌数/不加肌苷的活菌数）X100%。结果（图1A)表明，对照组 (即没有添加肌苷）的细菌生存率为69. 97%，而添加肌苷后，随着添加浓度的升高，细菌的生 存率从9. 04%降低为0. 09%，其杀菌效率从7倍提高至近800倍。5mM肌苷时可提高敏感性 近300倍，后续相关试验选取此浓度进行。
[0026] 3、肌苷提高大肠埃希菌对氨苄青霉素的敏感性具有抗生素浓度依赖性：为了解在 不同抗生素浓度时肌苷提高大肠埃希菌敏感性的情况，以20、40和80 μ g/mL共3个浓度的 氨苄青霉素和5mM肌苷处理细菌，4h后分别进行活菌计数，结果（图1B)发现，在加入肌苷 前提下，随着加入氨苄青霉素浓度的升高，其对细菌杀菌效率的提高越显著。具体情况是： 添加肌苷后，在20 μ g/mL氨苄青霉素时，对细菌的杀菌效率提高了 7. 04倍(生存率由未添 加的89. 78%下降到添加后的12. 76%)，在50 μ g/mL氨苄青霉素时，对细菌的杀菌效率提高 了 248倍(生存率由未添加的67. 12%下降到添加后的0. 27%)，在80 μ g/mL氨苄青霉素时， 对细菌的杀菌效率提高了近600倍(生存率由未添加的33%下降到添加后的0. 06%)。
[0027] 4、肌苷提高大肠埃希菌对氨苄青霉素的敏感性具有时间依赖性：在制备的细菌样 本中添加5 mM肌苷和50 μ g/mL氨苄青霉素，37°C作用8小时。每2小时进行活菌计数， 并计算不同时间肌苷作用后的生存率。计算公式为：生存率（％)=(加入肌苷后在某个时间 点的活菌数/不加肌苷在此时间点的活菌数）X100%。结果（图1C)发现，在仅添加氨苄青 霉素不添加肌苷时，其活菌数在2小时仅下降了 12. 4% (生存率为87. 6%)，随后随着时间延 长活菌数逐渐减少，8小时时生存率降为67. 16%。而当在添加氨苄青霉素同时加入肌苷后， 从2小时开始活菌数就明显下降(生存率为5. 4%)，随着时间的延长活菌数就越少。特别在 4小时及以上时间时，添加肌苷后，细菌杀菌效率可提高260~700倍。
[0028] 实施例2肌苷提高持续态细菌（persister)对氨节青霉素的敏感性 Persister是一类处于休眠状态的细菌，其生长速率低，能够耐受抗生素处理。
[0029] 1、凡co/i K12 BW25113对氨苄青霉素耐药菌株的筛选：用两倍稀释法检测大肠杆 菌敏感菌co/i K12 BW25113)对氨苄青霉素的最小抑菌浓度（MIC)。将IO5菌 落形成单位/毫升的起始菌在含1/2MIC氨苄青霉素的培养基中连续培养10代，测定所获 单克隆的最小抑菌浓度。结果发现，选择出的菌株对氨节青霉素的最小抑菌浓度为16 μ g/ mL，是敏感菌株最低抑菌浓度（6. 25 μ g/mL)的64倍，说明获得了耐药大肠杆菌菌株，命名 为 AMP-R。
[0030] 2、Persister制备：挑取大肠埃希菌K12 BW25113, AMP-R和临床获得的大肠埃 希菌多重耐药菌Y17单克隆于LB培养基中培养过夜，用1. 25~80 μ g/mL氧氟沙星分别处 理3种菌的饱和菌液各4小时，测定活菌数，并计算细菌生存率。如果在某一抗生素浓度 以后的生存率达到稳定，表明此时剩余的细菌就是persister，此时的抗生素浓度即为制备 persister的浓度。从结果（图2A)可以看出，3种菌的persister制备浓度依次为2. 5,5 和 5 μ g/mL〇
[0031] 分别用2. 5、5和5 μ g/mL氧氟沙星制备上述3种菌的persister，将菌液OD值调 节为0. 6,分装5晕升于试管中备用。
[0032] 3、肌苷提高persister对氨节青霉素的敏感性：将第2步制备的persister样 本在不加和加氨苄青霉素（BW25113, AMP-R，Y17的persisters的氨苄青霉素浓度分别为 1.2、1.6、1.6mg/mL)的前提下，分别加入和不加肌苷（5mM)，37 °C处理4小时，进行活菌计 数，并计算生存率。结果（图2B)发现，仅仅添加氨节青霉素不能杀死persisters,在添加氨 节青霉素同时加入肌苷则能明显提高persisters对氨节青霉素的敏感性。本研究加入的 5 mM肌苷能提高BW25113、AMP-R和Y17敏感性分别为300、100和32倍。
[0033] 实施例3肌苷可提高大肠埃希菌对多种抗生素的敏感性 将制备的细菌样本添加2. 5 mM肌苷和8种抗生素(每种抗生素浓度分别为：核糖霉 素 1、2、4 μ g/mL，庆大霉素 0· 5、1、1· 5μ g/mL，氯霉素 100、200、400μ g/mL，巴洛沙星 0· 4、 0· 8、1· 2μ g/mL，头孢西丁酸 L 56、3· 125、6· 25μ g/mL，氨曲南 3· 125、6· 25、12· 5μ g/mL，莫 西沙星〇· 1、〇· 2、0· 3μ g/mL，头孢唑林钠3· 125、6· 25、12· 5μ g/mL)，37°C处理4小时进行活 菌计数，并计算生存率。结果（图3)发现，添加肌苷后大肠埃希菌对不同浓度核糖霉素敏感 性分别提高3、5和6倍，对不同浓度庆大霉素敏感性分别提高1. 3、2. 6和8倍，对不同浓度 氯霉敏感性分别提高1. 2、1. 3和1. 8倍，对不同浓度巴洛沙星敏感性分别提高2、3和10倍， 对不同浓度头孢西丁酸敏感性分别提高4、5和6倍，对不同浓度氨曲南敏感性提高均为1. 5 倍，对不同浓度莫西沙星敏感性分别提高2、9和12倍，对不同浓度头孢唑林钠敏感性分别 提高7、25和50倍。这些结果表明肌苷可提高大肠埃希菌对多种抗生素敏感性。
[0034] 实施例4肌苷提高多种病原菌对氨苄青霉素的敏感性 1、多种病原菌对氨苄青霉素最低抑菌浓度的测定：用两倍稀释法检测大肠埃希菌K12 BW25113、大肠埃希菌K12、迟缓爱德华氏菌ATCC15947、迟缓爱德华氏菌EIB202、副溶血弧 菌和无乳链球菌对氨苄青霉素的最小抑菌浓度（MIC)结果见下表1。
[0035] 表1.病原菌对氨节青霉素的最低抑菌浓度
【主权项】
1. 肌苷在提高细菌对抗生素敏感性方面的应用。
2. -种抑菌或杀菌的药物，其特征在于，含有抗生素和肌苷。
3. -种提高细菌对抗生素敏感性的方法，其特征在于，将肌苷与抗生素联用。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的细菌为大肠埃希菌、金黄色葡萄球 菌、迟钝爱德华菌、乙型溶血性链球菌、绿脓杆菌或弧菌。
5. 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述的细菌为敏感菌、耐药菌及其持 续态细菌。
6. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的肌苷与抗生素的剂量比例按重量 计为 1 :0· 0015~300。
7. 根据权利要求3或4或6所述的方法，其特征在于，所述的抗生素选自氨苄青霉素、 核糖霉素、庆大霉素、氯霉素、巴洛沙星、头孢西丁酸、氨曲南、莫西沙星或头孢唑林钠。
8. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的肌苷的使用量为3mg~30g/次给药。
【专利摘要】本发明属于生物医药领域，具体公开了一种提高抗生素清除病原菌的小分子代谢物，即一种小分子化合物肌苷（Inosine）的新功能。本发明通过研究发现肌苷能够提高细菌包括耐药菌对抗生素的敏感性，从而克服细菌耐药性的问题。因此，将肌苷和抗生素连用可以显著提高抗生素的杀菌作用，比现有的只用抗生素在作为抗细菌耐药性药物的应用上，具有更好的效果以及更高的安全性和操作性。
【IPC分类】A61K31-4709, A61K31-427, A61K31-165, A61K31-43, A61P31-04, A61K31-546, A61K31-7036, A61K31-708
【公开号】CN104606219
【申请号】CN201410846650
【发明人】彭宣宪, 李惠, 赵贤亮
【申请人】中山大学
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2014年12月31日