促进伤口愈合的方法
【专利说明】促进伤口愈合的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年7月27日提交的SG专利申请201205614-9号的优先权权益， 将其内容以其整体引入于此以作参考用于所有目的。 发明领域
[0003] 本发明通常涉及生物化学领域。具体而言，本发明涉及可用于伤口治疗的mi-RNA、 抗-miRNA和多肽。
[0004] 发明背景
[0005] 糖尿病为一组特征在于由受试者产生和/或使用胰岛素的能力受损引起的血液 中高葡萄糖水平的疾病。当糖尿病没有得到良好控制时，糖尿病可稳步恶化并引起并发症 如失明、神经损伤、肾衰竭、心脏病和截肢。许多这些并发症是由脉管系统损伤和不能愈合 伤口造成的。由糖尿病患者不能愈合伤口引起的慢性伤口是主要的全球性健康负担，且为 最常见的下肢截肢的原因。在极端情况下，无效的伤口愈合可导致死亡。
[0006] 伤口愈合需要复杂的生物学事件的协调整合，这些生物学事件包括细胞迀移、增 殖和伴随基质沉积的细胞外重塑，普遍受到TGF-β和其它生长因子刺激。在糖尿病中，这 些复杂且交互的防护过程被破坏。因此，需要提供能够恢复或改善正常伤口愈合的方法或 组合物。
[0007] 发明概述
[0008] 在一个方面，提供有一种促进伤口愈合或伤口闭合的方法。本文所述的方法包括 施用miR-198抑制剂和/或卵泡抑素样-I (follistatin-like-1，FSTL1)多肽。
[0009] 在另一方面，提供有一种治疗慢性皮肤伤口的方法。治疗慢性皮肤伤口的方法可 包括施用miR-198抑制剂和/或卵泡抑素样-I (FSTLl)多肽。
[0010] 在另一方面，提供有一种不愈合伤口（慢性皮肤伤口）的鉴定方法。所述慢性皮 肤伤口的鉴定方法可包括分析miR-198的表达水平，其中miR-198的表达或表达增加表明 所述伤口为慢性皮肤伤口。如本文所述的不愈合伤口的鉴定方法可任选包括分析FSTLl基 因的表达和/或FSTLl多肽水平，其中FSTLl基因的表达减少或无表达和/或FSTLl多肽 的水平降低或缺失表明所述伤口为慢性皮肤伤口。
[0011] 在另一方面，提供有miR-198作为用于鉴定不愈合伤口（慢性皮肤伤口）的生物 标记物的用途。
[0012] 在另一方面，提供有miR-198在制备用于治疗不愈合伤口的药物中的用途。还提 供FSTLl多肽在制备用于治疗不愈合伤口的药物中的用途。
[0013] 在另一方面，提供有一种包含如本文所述的组合物或化合物的药物组合物。所述 药物组合物可包含miR-198抑制剂和TGF-β 1 ;或miR-198抑制剂和FSTLl多肽；或FSTL 多肽和TGF-β 1 ;或miR-198抑制剂和TGF-β 1以及FSTLl多肽。
[0014] 附图简述
[0015] 参见详细说明，并结合非限制性实例和附图考虑时，将更好地理解本发明，在附图 中：
[0016] 图1示出在上下文特定生理状态下外显子miRNA或所连接的ORF的表达。a)染 色体3(NCBI参考序列：NM_007085)中FSTLl基因的示意图，示出外显子-内含子边界，编 码!1^1?-198前体的3'-^1?序列（下划线的核苷酸表示成熟1^1?-198)。13)示出1^1?-198 表达的柱状图，如通过qRT-PCR在器官培养外植体中在损伤后的指定时间点所测定的。如 早在损伤后3小时观察到的miR-198的显著下调**[P〈0. 001]。c)在损伤后的（左）0和 (右）24小时时，由对正常皮肤上的成熟miR-198具有特异性的LNA探针原位杂交获得的 图像。注意，受伤后24小时时，miR-198表达显著下调。d)在损伤前后在指定的时间点，对 外植体样品中FSTLlmRNA的典型半定量-RT-PCR分析。e)在受伤后的（左）0和（右）24 小时时FSTLl蛋白的免疫组织化学定位。FSTLl蛋白表达在受伤后24小时时观察到（η = 5)。比例尺=100 μΜ。图1阐明了在损伤后0和24小时时，人皮肤离体器官培养系统的差 异miRNA表达谱。图1阐明了 miR-198为在损伤时下调的一致且显著差异表达的miRNA。
[0017] 图2a)的直方图表示转染有对照或miR-198的N/TERT-1细胞中的成熟miR-198定 量（η = 3)。13)示出在刮伤后在不同时间点转染有非祀标miRNA对照（上图）或miR-198(下 图）的角化细胞迀移的代表图。虚线标记了角化细胞的细胞膜片（cellsheet)的迀移边缘 (η = 6)。c)的直方图表示在刮伤试验中的相对伤口闭合。经过24小时，在对照转染细胞中 观察到完全伤口闭合，而miR-198的过表达导致35 ± 10 %的伤口闭合（η = 6)。林P〈0. 001。 误差棒表示标准误差。d)示出转染有对照或miR-198的角化细胞的增殖，通过相对细胞汇 合度来评价。miR-198的过表达与增殖的任何显著差异并不相关（η = 3)。e)示出转染有 对照或miR-198模拟物的N/TERT-1细胞中FSTLlmRNA的相对水平。N. S :不显著（η = 3)。 miR-198过表达不导致FSTLlmRNA水平的显著变化。f)示出细胞共转染有FSTL13'-UTR荧 光素酶报告基因构建体以及miR-198或非靶向乱序对照。标准化的相对荧光素酶活性显示 为柱形图。荧光素酶活性表示为相对于对照的平均值，N. S :不显著（η = 3)。g)示出从转 染有对照或miR-198的角化细胞的微阵列数据中选择的基因的基因表达值，表示为热图。 表达值显示为在线性标度下相对于基因的单个平均值的明暗度。h)示出表示从微阵列中 鉴定的且通过qRT-PCR验证的所选基因的相对转录本丰度（对照对miR-198过表达）的直 方图（η = 3)。微阵列数据示出与qRT-PCR结果的显著相关。*P〈0. 05, #P〈0. 001。学生 t检验用于计算P值，误差棒表示平均值土 s. e. m.。因此，图2示出miR-198抑制角化细胞 迀移不依赖于FSTLl。
[0018] 图3示出人皮肤器官培养物损伤模型中靶基因表达的结果。a)示出在损伤后0和 24小时使用来自皮肤（器官培养物）的RNA由微阵列产生的选择基因（假定靶标）的热 图。表达值显示为在作为热图的线性标度下相对于基因的单个平均值的明暗度。b)示出通 过荧光素酶报告基因试验的miR-198的直接靶标的验证。293T细胞共转染有如图所示的 3' -UTR荧光素酶报告基因构建体以及miR-198或非靶向乱序对照。标准化的相对荧光素 酶活性示为柱形图。荧光素酶活性表示为相对于对照的平均值。（η = 3)。**P〈0. 001。学生 t检验用于计算P值，误差棒表示平均值土s.e.m.。c)示出损伤后0小时和24小时，在来 自器官培养物的切片和来自慢性糖尿病伤口的切片上miR-198靶标PLAU、LAMC2和DIAPHl 的免疫组织化学分析。在受伤后24小时时（中间图）清楚观察到靶基因的蛋白表达的大 幅增长。然而，在慢性糖尿病性溃疡伤口（右图）中，靶基因的表达仍相对较低（η = 8)。 d)示出在损伤后24小时的正常伤口或在慢性伤口切片上通过免疫组织化学检测FSTLl蛋 白表达（左图）和对miR-198的原位杂交（右图）（η = 8)。比例尺-100 μΜ。FSTLl仅在 正常伤口中检测到，而未在慢性糖尿病伤口中检测到。慢性糖尿病伤口持久表达高水平的 miR-198,而miR-198在正常损伤中下调。因此，图3阐明了调控开关在慢性伤口中受损。
[0019] 图4示出为了理解转录后调控开关而进行的一系列试验，确定转录本起到 pri-miRNA或mRNA的作用的命运。a)示出在TGF-M存在或缺失下使用抗KSRP抗体或 IgG对照对来自角化细胞裂解物RNA免疫沉淀。表示转录本富集倍数的定量RT-PCR揭示了 KSRP与pri-miR-198转录本的特异性结合，但不与最丰富的mRNA种类KRT14特异性结合（η =3)。b)显示了 RNA-凝胶阻滞试验，其示出KSRP与在pre-miR-198转录本的环中的富含 G-的基序特异性结合，且取消了与该位点的突变⑶C基序（Mut-I)的结合。pre-miR-198转 录本的茎中GG基序突变为CC仅产生适度的结合损失（Mut-2)。仅用KSRP观察到RNA-蛋 白质复合物，而用BSA对照则未观察到（最后泳道）（η = 3)。c)示出在重组KSRP (rKSRP) 的存在下pre-miR-198的有效加工。体外合成的pre-miR-198转录本用293T细胞质提取 物在rKSRP的浓度有无增加下孵育。裂解的成熟miR-198通过与在pre-miR-198用RNase III处理时释放的产物的共迀移来检测。d)示出表示成熟miR-198的密度定量的直方图