在卵泡同步化后的单剂重组牛fsh的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及使用有生物活性的重组促卵泡激素（rFSH)在非人类哺乳动物中提高 生殖性能的方法和组合物。本发明还涉及使用rFSH在非人类哺乳动物中增加排卵、胚胎产 生或妊娠的方法。本发明尤其可以在人工授精或体外授精程序中用于有蹄类动物例如牛或 马。
【背景技术】
[0002] 在非人类哺乳动物例如牛、马或其他有蹄类动物中提高生殖性能的能力，对所有 者来说可以具有显著利益。这可以通过在这样的非人类哺乳动物中提高生育力和/或生殖 力来实现。目前，已提出了数种方法或方案来提高生殖性能，它们是基于使用雌二醇和其 他激素例如GnRH (促性腺激素释放激素）、LH (促黄体激素）、FSH (促卵泡激素）或孕激素 (progestagen)(例如孕酮）来模拟在目标物种中存在的激素的天然或接近天然的水平。一 些这些方案包括在雌性中使排卵同步化的步骤，以便以同步化方式促进卵泡的刺激、生长 和排卵，允许定时人工授精，避免发情期检测的必要性。这些所谓的同步化方案在全世界被 广泛用于商业化牛奶场和肉牛牧场。
[0003] 用于使卵泡波的出现同步的最常用处理方法之一，包括使用不同类型的雌激素。 然而，这种留类激素在世界的许多地方不能使用，并且已开发了可替选的方法来控制卵泡 和黄体期，其目的在于例如在雌二醇不可用的国家中改进胚胎供体母牛的超数排卵过程。 一种似乎是有希望的选项的方法是在GnRH诱导的排卵之后，在新的卵泡波出现时启动FSH 处理。此外，由于目前可用的FSH产品的半衰期一般来说短（约6小时），因此超数排卵方 案包括每日两次FSH处理，总共4至5日，这是相当耗时、紧张的，并容易发生错误。此外， 在目前开发的超数排卵计划期间的这些频繁的管理，使其几乎不可能应用于例如放养在牧 场中的肉牛。因此，标准的超数排卵方法是基于在通常发生在天然存在的发情期后8至12 天的卵泡波出现时多次注射FSH。这种方法被称为"基于发情期的"，并且它尽管在胚胎产 生方面高效，但取决于发情周期的阶段，并需要发情期检测。较晚的研宄发现，与允许更理 想的从授精到排卵的时间间隔的现代同步化方案相比，在"基于发情期"的程序中生育率明 显较低。
[0004] 为了确定延长FSH刺激方案是否能够增加排卵反应，已进行了研宄。作者似乎得 出结论，将FSH注射时间长度从连续4天延长到连续7天，可以维持卵泡生长并导致更多卵 泡获得排卵能力。更多的研宄正在进行中，以在不同牛品种中验证这个假说。
[0005] 在另一个已报道的方案中，将母牛用FSH处理3天而不是4天，并且将第4天的最 后两次注射用2eCG (马绒毛膜促性腺激素）注射代替（Barros等，2008)。这种处理似乎增 加了胚胎的数目，尽管处理时间仍然长。此外，eCG是相当大的分子，并且已被描述在重复 使用时诱导抗体形成，并且可能限制这些类型的方案的广泛/频繁使用。
[0006] 在试图减少FSH注射的数目的尝试中，已开发了一种可选替方案，其中将FSH包埋 在缓释聚合物（透明质酸）中。使用这种缓释制剂，在"基于发情期"的超数排卵计划后进 行单次注射。然而，作者得出结论，透明质酸也过于粘稠，并且单次肌内注射产生较低的超 数排卵反应（Bo等，2010)。
[0007] EP2134165提出了一种使用单链FSH提高生殖的可替选方法，在所述单链FSH中两 个亚基由肽连接物共价连接，其在发情期后7至13天在单一药剂中给药。根据这种方法， 通过鉴定参考发情期（或发情）日期（最后发情的当天）来准备用于FSH注射的动物，然 后在动物周期的第7至8天之间在单次注射中给药FSH。结果似乎令人满意，但是需要动物 的个体观察和监测来确定最有效的处理方式。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明涉及使用有生物活性的重组促卵泡激素（rFSH)在非人类哺乳动物中提高 生殖性能的方法和组合物。本发明还提供了用于在非人类哺乳动物中提高生殖、特别是生 育力和生殖力的改进的方法。
[0010] 更具体来说，本发明提供了改进的基于rFSH的组合物和处理方法，其通过最小化 给药次数和剂量，在非人类哺乳动物中提供了提高的生殖性能。
[0011] 本发明的具体目的涉及重组rFSH类似物或包含rFSH类似物的组合物，其用于在 经历卵泡同步化方案和/或处理的非人类哺乳动物中提高生殖性能。更优选地，所述rFSH 类似物在单次给药中，优选地以约〇. 01 μ g至约5mg之间的剂量范围给药。
[0012] 本发明的具体目的涉及重组rFSH类似物或包含rFSH类似物的组合物的用途，其 用于在经历卵泡同步化方案和/或处理的非人类哺乳动物中提高生殖性能。更优选地，所 述rFSH类似物在单次给药中，优选地以约0. 01 μ g至约5mg之间的剂量范围给药。
[0013] 本发明的另一个目的在于一种rFSH类似物（或包含rFSH类似物的组合物），其用 于在一个或数个非人类哺乳动物中提高生殖性能，其中在卵泡同步化后，将所述rFSH类似 物在单次给药中，优选地以10 μ g至Img之间的剂量范围给药于每个所述一个或数个非人 类哺乳动物。
[0014] 本发明的另一个目的在于一种用于在一个或数个非人类哺乳动物中提高生殖性 能的方法，所述方法包括在卵泡同步化后，优选地以10 μ g至Img之间的剂量范围向每个所 述一个或数个非人类哺乳动物单次给药rFSH类似物。
[0015] 本发明的另一个目的是一种用于在一个或数个非人类哺乳动物中诱导超数排卵 的方法，所述方法包括向每个所述一个或数个非人类哺乳动物给药rFSH类似物，其中所述 rFSH类似物在卵泡同步化方案和/或处理后，在单次给药中，优选地以10 μ g至Img之间的 剂量范围给药于所述非人类哺乳动物。
[0016] 本发明的另一个目的是一种用于在一个或数个非人类哺乳动物中提高排卵率的 方法，所述方法包括向每个所述一个或数个非人类哺乳动物给药rFSH类似物，其中所述 rFSH类似物在单次给药中，优选地以10 μ g至Img之间的剂量范围给药于所述非人类哺乳 动物。给药优选地在卵泡同步化之后进行。
[0017] 本发明的另一个目的是一种用于在一个或数个非人类哺乳动物中产生或回收卵 母细胞的改进方法，所述方法包括向每个所述一个或数个非人类哺乳动物给药rFSH类似 物，其中所述rFSH类似物在单次给药中，优选地以IOyg至Img之间的剂量范围给药于所 述非人类哺乳动物。
[0018] 给药优选地在卵泡同步化之后进行。这样的方法对于提高体外授精（IVF)方案或 程序的性能来说特别有利。
[0019] 就此而言，本发明的另一个目的涉及一种体外授精（IVF)方法，所述方法包括从 非人类哺乳动物供体获得卵母细胞的步骤和在体外对所述卵母细胞进行授精的步骤，其中 通过rFSH类似物的单次给药，优选地以10 μ g至Img之间的剂量范围对所述非人类哺乳动 物供体进行处理，以增加卵母细胞生产。给药优选地在所述非人类哺乳动物供体的卵泡同 步化之后进行。
[0020] 本发明的另一个目的是一种用于在非人类哺乳动物中提高黄体的质量和数量的 方法，所述方法包括向所述非人类哺乳动物给药rFSH类似物，其中所述rFSH类似物在单次 给药中，优选地以10 μ g至Img之间的剂量范围给药于所述非人类哺乳动物。
[0021] 在特定实施方式中，本发明涉及一种方法，其包括：
[0022] (a)提供经过处理以使卵泡同步化的非人类哺乳动物（例如有蹄类动物）或一组 非人类哺乳动物（例如一组有蹄类动物）；或者对非人类哺乳动物（例如有蹄类动物）或 一组非人类哺乳动物（例如一组有蹄类动物）进行处理，以使卵泡同步化；
[0023] (b)以约0. 01 μ g至约5mg之间的剂量范围，优选地通过注射、更优选地通过肌内 注射，向所述非人类哺乳动物或一组哺乳动物给药单剂rFSH类似物；以及
[0024] (c)优选地在排卵时间附近，更优选地在给药步骤（b)后2至7天、甚至更优选地 4至6天，对所述非人类哺乳动物或一组非人类哺乳动物进行授精，优选地通过人工授精来 进行。
[0025] 这种方法避免了对检测或监测发情期的需要，并且特别是对于成组非人类哺乳动 物更加有效。
[0026] 在另一种特定实施方式中，本发明涉及一种方法，其包括：
[0027] (a)提供经过处理以使卵泡同步化的有蹄类动物或一组有蹄类动物；或者对有蹄 类动物或一组有蹄类动物进行处理，以使卵泡同步化；
[0028] (b)以约10 μ g至约Img之间的剂量范围，优选地通过注射、更优选地通过肌内注 射，向所述有蹄类动物或一组有蹄类动物给药单剂rFSH类似物；
[0029] (C)优选地通过卵泡抽吸从所述有蹄类动物回收卵母细胞；
[0030] (d)任选地，在体外对所述回收的卵母细胞进行授精；以及
[0031] (e)任选地将所述受精的卵母细胞植入到受体动物中，优选地植入到以前通过以 约10 μ g至约Img之间的剂量范围给药单剂rFSH类似物进行处理的受体动物中。