一种响应面优化高纯度茼蒿总黄酮的提取纯化工艺的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种植物有效成分提取工艺，具体涉及一种响应面优选高纯度茼蒿总 黄酮的提取纯化工艺。
【背景技术】
[0002] 茼蒿，是菊科植物蒿子杆和茼蒿的茎叶，由于它的花很像野菊，所以又名菊花菜， 茼蒿的茎和叶可以同食，蒿之清气、菊之甘香，一般营养成分无所不备，尤其胡萝卜素的含 量超过一般蔬菜，中医认为茼蒿辛、甘、平，归脾、胃经，能开胃增食、降压补脑等，对咳嗽多 痰、脾胃不和、便秘、记忆力减退、睡眠不足等症有一定的疗效，还有养血清心的作用，比较 适合冠心病、高血压病人食用。黄酮类物质具有抗癌、抗病毒，调节免疫力、治疗心脑血管疾 病、骨质疏松和糖尿病并发症等多种生理活性药用作用。有研究报告茼蒿内含有较为丰富 的黄酮，茼蒿总黄酮对羟自由基具备较好的清除作用。但是目前提取方法得到的茼蒿总黄 酮的纯度普遍偏低，一直制约着茼蒿总黄酮药理和质量控制的研究。因此发明一种从茼蒿 内提取获得纯度含量高的茼蒿总黄酮变得尤为重要。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种响应面优化高纯度茼蒿总黄酮 的提取纯化工艺。
[0004] 为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下： 一种响应面优化高纯度茼蒿总黄酮的提取纯化方法，其关键技术点在于，包括如下步 骤： 步骤一：茼蒿总黄酮的粗提 选取茼蒿，粉碎，称取茼蒿粉末，按1:30-35( g:mL)料液比，加入提取剂体积分数为 60%-70%的乙醇溶液，20-30°C下，对混合液在80khz 200W条件下超声波处理50-70min，置 于60°C恒温水浴锅中浸提0. 5-1. 5h，离心，取上清液，得到粗提液； 步骤二：双水相萃取 将步骤一得到的粗提液，加入C2H5OH- (NH4) 2S04形成的双水相体系，所述C 2Η50Η的质量 分数为20%-28%，所述（NH4)2SO4的质量分数为16%-24%，加入质量分数为1. 5%-3%的NaCl， 加入质量分数为〇. 3-0. 5%的羟丙基-β -环糊精，调节pH值为6-8,混匀，分相； 取出富含茼蒿总黄酮的乙醇上相，进行减压蒸馏、浓缩溶液，得到0. 25-2. 00mg/ml不 同质量浓度的茼蒿黄酮乙醇提取液； 步骤三：茼蒿总黄酮的纯化 (1) 大孔吸附树脂预处理 (2) 大孔吸附树脂分离纯化 将步骤二得到的0. 25-2. 00mg/ml不同质量浓度的茼蒿黄酮乙醇提取液，用酸或碱调 至4-9的不同pH值，加入到D-101大孔树脂柱中，用55%-95%不同的体积分数的洗脱剂乙 醇以I. 0-5. OmL/min的不同的流速进行洗脱，对洗脱液进行浓缩，得到提取液； (3) 用吸光光度法测定总黄酮含量 步骤⑵得到的吸取提取液lmL，用70%乙醇补至5mL，加入浓度为5%NaN020. 3mL， 摇匀置6min;再加入浓度为10%A1 (NO3)3 0. 3mL，摇匀置6min ;加浓度为4%NaOH4mL，用 蒸馏水定容至10mL，摇匀15min后测定吸光度，根据吸光度（Y)和浓度（X)的回归方程： y=9. 12χ-0· 023, R2=O. 9986,计算浓度； (4) 实验设计与统计分析 a单因素试验 依次改变上样浓度、上样PH、洗脱剂浓度、流速进行单因素试验，用步骤（3)中吸光光 度法测定所得的茼蒿总黄酮提取液中的总黄酮的浓度； b响应面法优化设计 根据单因素试验结果，选择上样浓度、上样PH、洗脱剂浓度、流速四个因素，利用 Design-Expert软件根据Box-Benhnken设计原则进行实验设计，以样浓度A、上样pH B、洗 脱剂浓度C、洗脱流速D为自变量，以TFCL回收率为响应值Y，建立多元二次方程： Y=63. 31-0. 72A-0. 83B-0. 14C-0. 072D-0. 71AB-0. 053AC-0. 7AD-0. 41BC+0. 54BD-0. 21C D-2. 500Ε-0. 78Α2-0. 53Βζ-2. 22Cz-〇. 7ID2 (5) 实验结果分析与优化 利用Design-Expert软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应 面及其等高线图。
[0005] 作为本发明进一步的改进，所述步骤（1)的大孔吸附树脂预处理方法具体如下： 用95%乙醇大孔吸附树脂完全浸泡24h，采用湿法装柱，用95%乙醇反复洗涤，直至水与 流出液不产生白色浑浊，再用蒸馏水洗至无醇味；接着先后用体积分数5%的盐酸与质量分 数2%的强氧化钠反复淋洗，并静止置2-4h后，用蒸馏水洗至pH值中性，浸泡于蒸馏水中备 用。
[0006] 作为本发明进一步的改进，所述步骤（2)大孔吸附树脂分离纯化具体如下： 将质量浓度分别为〇. 25、0. 50、0. 75、1. 00、1. 25、1. 50和2. 00mg/ml的步骤二得到的茼 蒿黄酮乙醇提取液，用酸或碱调至pH值分别为4、5、6、7、8、9，加入到0-101大孔树脂柱中， 用体积分数分别为55%、65%、75%、85%、95%的洗脱剂乙醇以I. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. OmL/min的 流速进行洗脱，对洗脱液进行浓缩。
[0007] 本发明中"加入质量分数为1. 5%_3%的NaCl，加入质量分数为0. 3-0. 5%的羟丙 基-β -环糊精"，是指"NaCl在双水相中的质量分数为1. 5%-3%，羟丙基-β -环糊精在双水 相中的质量分数为〇. 3-0. 5%。" 为了得到高纯度的茼蒿总黄酮，发明人进行了大量的研究。本领域技术人员所公知的 植物内总黄酮的提取方法较多，例如超声波辅助提取法，索氏提取法，热回流提取法，超声 波协同复合酶法，微波提取法等。发明人采用常规的提取方法对茼蒿总黄酮进行了提取，虽 然可以得到一定含量的茼蒿总黄酮液，但是提取结果让发明人沮丧。由于茼蒿本身的多种 复杂成分所影响，采用常规的黄酮提取工艺得到的茼蒿总黄酮提取液的纯度不高。为了想 得到高纯度的茼蒿总黄酮，发明人进入了新的一轮思索。发明人不得不对获得的茼蒿总黄 酮提取液进行分离纯化，大孔树脂分离纯化是化合物提取纯化中常用的方法，可以简单的 将粗提物进行分离纯化，发明人欣喜于上述构思，但是当付诸实施后，实际情况让发明人失 望。发明人尝试用了多种大孔树脂：0-101、48-8、、04-201、30-401和01-301，无论如何调 整上样浓度、PH、洗脱剂种类和浓度以及流速分离纯化结果均不理想。正当发明人想要放弃 时，意外的发现，在用大孔树脂纯化之前，用双水相体系中加入羟丙基-β -环糊精可以达 到良好的萃取分离效果，使得萃取产物可以利用大孔树脂得到纯化分离，分析其原因是羟 丙基-β-环糊精将杂质物质选择性的进行了包裹，由于羟丙基β环糊精的水溶性大，将杂 质滞留在下相中，基于上述发现，经过合理的实验设计、无数次的探索和巨大的创造性劳动 寻找到了一种高纯度茼蒿总黄酮的提取纯化方法，整体形成了本发明的技术方案。
[0008] 与现有技术相比，本发明取得有益效果为： 本发明针对茼蒿本身，采用超声波辅助提取，双水相萃取的工艺，使茼蒿总黄酮的提取 率变高，其他非黄酮成分的提取率变低，并且可以用大孔树脂进行分离纯化，使最终得到的 茼蒿总黄酮纯度显著提高。
[0009] 本发明利用Box-Benhnken Designs中心组合设计模型的响应面分析法，用四个变 量因素、3个水平共29个试验点（5个中心点）就可以得出优化结果，获得最佳的大孔树脂 分离纯化工艺，提高纯化后茼蒿总黄酮的纯度。
[0010] 本发明操作工艺简单、成本低、易操作，得到的最终茼蒿总黄酮的含量可以提高到 96. 51% 以上。
【附图说明】
[0011] 附图1为上样pH、上样质量浓度对回收率的影响的响应面三维图； 附图2为洗脱流速、上样质量浓度对回收率的影响的响应面三维图； 附图3为洗脱流速、上样pH对回收率的影响的响应面三维图； 附图4为洗脱流速、上样质量浓度对回收率的影响的响应面三维图； 附图5为洗脱流速、洗脱浓度对回收率的影响的响应面三维图； 附图6为洗脱浓度、上样pH对回收率的影响的响应面三维图。
【具体实施方式】
[0012] 以下结合具体实施例对本发明进行进一步详细的叙述。
[0013] 实施例1 一种响应面优化高纯度茼蒿总黄酮的提取纯化方法，其关键技术点在于，包括如下步 骤： 步骤一：茼蒿总黄酮的粗提 选取茼蒿，粉碎，称取茼蒿粉末〇. 5Kg，加入提取剂体积分数为65%的乙醇溶液15L， 25°C下，对混合液在80khz 200W条件下超声波处理60min，置于60°C恒温水浴锅中浸提lh， 离心，取上清液，得到粗提液； 步骤二：双水相萃取 将步骤一得到的粗提液，加入C2H5OH- (NH4) 2S04形成的双水相体系，所述C 2Η50Η的质量 分数为24%，所述（NH4) 2S04的质量分数为18%，加入质量分数为1. 7%的NaCl，加入质量分数 为0. 5%的羟丙基-β -环糊精，调节pH值为7,混匀，分相； 取出富含茼蒿总黄酮的乙醇上相，进行减压蒸馏、浓缩溶液，得到0. 25-2. OOmg/ml不 同质量浓度的茼蒿黄酮乙醇提取液； 步骤三：茼蒿总黄酮的纯化 (1)大孔吸附树脂预处理 取树脂适量，95%乙醇完全浸泡24h，去除大孔树脂碎片及杂物。采用湿法装柱，用95% 乙醇反复洗涤，直至水与流出液不产生白色浑浊，再用蒸馏水洗至无醇味；接着先后用体积 分数5%的盐酸与质量分数2%的强氧化钠反复淋洗，并静止置2-4h后，用蒸馏水洗至pH值 中性，浸泡于蒸馏水中备用。
[0014] (2)大孔吸附树脂分离纯化 将质量浓度分别为〇. 25、0. 50、0. 75、1. 00、1. 25、1. 50和2. OOmg/ml步骤二得到的茼 蒿黄酮乙醇提取液，用酸或碱调至pH值分别为4、5、6、7、8、9，加入到0-101大孔树脂柱中， 上样体积为60ml，用体积分数分别为55%、65%、75%、85%、95%的洗脱剂乙醇以I. 0、2. 0、3. 0、 4. 0、5. OmL/min的流速进行洗脱，对洗脱液进行浓缩，得到提取液； (3) 用吸光光度法测定总黄酮含量 步骤⑵得到的吸取提取液lmL，用70%乙醇补至5mL，加入浓度为5%似勵2的水溶液 0. 3mL，摇匀置6min;再加入浓度为10%A1 (NO3)3的水溶液0. 3mL，摇匀置6min;加浓度为 4%NaOH的水溶液4mL，用蒸馏水定容至10mL，摇匀15min后测定吸光度，根据吸光度（Y)和 浓度（X)的回归方程：y=9. 12x-0. 023, R2=O. 9986,计算浓度；的水溶液 (4) 实验设计与统计分析 a单因素试验 依次改变上样浓度、上样PH、洗脱剂浓度、流速进行单因素试验，用步骤（3)中吸光光 度法测定所得的茼蒿总黄酮提取液中的总黄酮的含量； b响应面法优化设计 根据单因素试验结果，对上样浓度、上样PH、洗脱剂浓度、流速四个因素，利用 Design-Expert软件根据Box-Benhnken设计原则进行实验设计，以样浓度A、上样pH B、洗 脱剂浓度C、洗脱流速D