为自变量，以TFCL回收率为响应值Y，响应面试验方案及试验结果 见表1，响应面曲面方差分析见表2,经回归模型拟合，三因子对响应值Y的影响可用以下多 元二次方程：Υ=63· 31-0. 72A-0. 83B-0. 14C-0. 072D-0. 71AB-0. 053AC-0. 7AD-0. 41BC+ 0· 54BD-0. 21CD-2. 500Ε-0. 78Α2-0· 53Β2-2· 22C2-0. 71D2。
[0015] 由表1分析可知，（/Μ). 047〈/M). 05)二次回归方程模型显著，失拟项不显著 (/Μ). 428>/M). 05)。通过该模型的方差分析可知：上样pH (B)对TFCL回收率影响差异显 著（/M). 047)，而上样浓度（A)、洗脱浓度（C)和洗脱速度（D)三个因素对TFCL回收率影响 差异不显著。即：上样液pH的改变将会显著影响TFCL的回收率。四因素对TFCL回收率影 响效应的大小依次pH (B) >上样浓度（A) >洗脱浓度（C) >洗脱速度（D)。
[0016] (5)实验结果分析与优化 利用Design-Expert软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应 面及其等高线图。
[0017] 如图1-6所示，回收率的响应面开口向下，回收率Y和四个个制约因素呈现明显 的二次抛物线关系。随着每个因素的增加，响应值回收率Y也在增大。根据浸提动力学理 论，随着pH (B )、上样浓度（A)、洗脱浓度（C)、洗脱速度（D )的增加，响应值回收率Y出现极 大值，后随着A、B、C、D再增加，萃取率Y呈现不同斜率的下降，该回归模型具有稳定点，稳 定点是最大值。借助Design-Expert Software 8.0中多元二次回归模型对TFF萃取率进 行估算，对二次抛物线函数模型进行极值分析，预测四因素的最佳组合：上样浓度〇. 86mg/ ml，pH=6,洗脱浓度74. 27%和洗脱流速2. 23ml/min此时模型预测极大值Y=87. 3667% (Ρ=0. 994)。
[0018] 经在上述最佳组合条件下，进行三组重复试验，测得本实施例方法得到的茼蒿总 黄酮的含量为96. 51%。
[0019] 对比例1 一种响应面优化高纯度茼蒿总黄酮的提取纯化方法，包括如下步骤： 步骤一：茼蒿总黄酮的粗提 选取茼蒿，粉碎，称取茼蒿粉末〇. 5Kg，加入提取剂体积分数为65%的乙醇溶液15L， 25°C下，对混合液在80khz 200W条件下超声波处理60min，置于60°C恒温水浴锅中浸提lh， 离心，取上清液，得到粗提液，制成0. 86mg/ml的茼蒿黄酮乙醇提取液。
[0020] 步骤二：茼蒿总黄酮的纯化 (1)大孔吸附树脂预处理 取树脂适量，95%乙醇完全浸泡24h，去除大孔树脂碎片及杂物。采用湿法装柱，用95% 乙醇反复洗涤，直至水与流出液不产生白色浑浊，再用蒸馏水洗至无醇味；接着先后用体积 分数5%的盐酸与质量分数2%的强氧化钠反复淋洗，并静止置2-4h后，用蒸馏水洗至pH值 中性，浸泡于蒸馏水中备用。
[0021] (2)大孔吸附树脂分离纯化 将步骤一得到的茼蒿黄酮乙醇提取液，调至pH值分别为6,加入到D-101大孔树脂柱 中，上样体积为60ml，用体积分数分别为74. 29%的洗脱剂乙醇以2. 23mL/min的流速进行洗 脱，对洗脱液进行浓缩，测得茼蒿总黄酮含量为54. 32%。
[0022] 对比例2 一种响应面优化高纯度茼蒿总黄酮的提取纯化方法，包括如下步骤： 步骤一：茼蒿总黄酮的粗提 选取茼蒿，粉碎，称取茼蒿粉末〇. 5Kg，加入提取剂体积分数为65%的乙醇溶液15L， 25°C下，对混合液在80khz 200W条件下超声波处理60min，置于60°C恒温水浴锅中浸提lh， 离心，取上清液，得到粗提液； 步骤二：双水相萃取 将步骤一得到的粗提液，加入C2H5OH- (NH4) 2S04形成的双水相体系，所述C 2Η50Η的质量 分数为24%，所述（NH4) 2S04的质量分数为18%，加入质量分数为1. 7%的NaCl，加入质量分数 为0. 5%的羟丙基-β -环糊精，调节pH值为7,混匀，分相； 取出富含茼蒿总黄酮的乙醇上相，进行减压蒸馏、浓缩溶液，得到0. 86mg/ml不同质量 浓度的茼蒿黄酮乙醇提取液； 步骤三：茼蒿总黄酮的纯化 (1)大孔吸附树脂预处理 取树脂适量，95%乙醇完全浸泡24h，去除大孔树脂碎片及杂物。采用湿法装柱，用95% 乙醇反复洗涤，直至水与流出液不产生白色浑浊，再用蒸馏水洗至无醇味；接着先后用体积 分数5%的盐酸与质量分数2%的强氧化钠反复淋洗，并静止置2-4h后，用蒸馏水洗至pH值 中性，浸泡于蒸馏水中备用。
[0023] (2)大孔吸附树脂分离纯化 将步骤二得到的茼蒿黄酮乙醇提取液，调至pH值分别为6,加入到D-101大孔树脂柱 中，上样体积为60ml，用体积分数分别为74. 29%的洗脱剂乙醇以2. 23mL/min的流速进行洗 脱，对洗脱液进行浓缩，测得茼蒿总黄酮含量为61. 31%。
[0024] 对比例3 一种响应面优化高纯度茼蒿总黄酮的提取纯化方法，包括如下步骤： 步骤一：茼蒿总黄酮的粗提 选取茼蒿，粉碎，称取茼蒿粉末〇. 5Kg，加入提取剂体积分数为65%的乙醇溶液15L， 25°C下，对混合液在80khz 200W条件下超声波处理60min，置于60°C恒温水浴锅中浸提lh， 离心，取上清液，得到粗提液； 步骤二：双水相萃取 将步骤一得到的粗提液，加入C2H5OH- (NH4) 2S04形成的双水相体系，所述C 2Η50Η的质量 分数为24%，所述（NH4) 2S04的质量分数为18%，加入质量分数为1. 7%的NaCl，加入质量分数 为0. 5%的羟丙基-β -环糊精，调节pH值为7,混匀，分相； 取出富含茼蒿总黄酮的乙醇上相，进行减压蒸馏、浓缩溶液，测定茼蒿总黄酮的含量为 62. 82%〇
[0025] 以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对 于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而 易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。
【主权项】
1. 一种响应面优化高纯度茼蒿总黄酮的提取纯化方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤一：茼蒿总黄酮的粗提 选取茼蒿，粉碎，称取茼蒿粉末，按1:30-35( g:mL)料液比，加入提取剂体积分数为 60%-70%的乙醇溶液，20-30°C下，对混合液在80khz 200W条件下超声波处理50-70min，置 于60°C恒温水浴锅中浸提0. 5-1. 5h，离心，取上清液，得到粗提液； 步骤二：双水相萃取 将步骤一得到的粗提液，加入C2H5OH- (NH4) 2S04形成的双水相体系，所述C 2H50H的质量 分数为20%-28%，所述（NH4)2SO4的质量分数为16%-24%，加入质量分数为1. 5%-3%的NaCl， 加入质量分数为〇. 3-0. 5%的羟丙基-P -环糊精，调节pH值为6-8,混匀，分相； 取出富含茼蒿总黄酮的乙醇上相，进行减压蒸馏、浓缩溶液，得到0. 25-2. OOmg/ml不 同质量浓度的茼蒿黄酮乙醇提取液； 步骤三：茼蒿总黄酮的纯化 (1) 大孔吸附树脂预处理 (2) 大孔吸附树脂分离纯化 将步骤二得到的0. 25-2. 00mg/ml不同质量浓度的茼蒿黄酮乙醇提取液，用酸或碱调 至4-9的不同pH值，加入到D-101大孔树脂柱中，用55%-95%不同的体积分数的洗脱剂乙 醇以I. 0-5. OmL/min的不同的流速进行洗脱，对洗脱液进行浓缩，得到提取液； (3) 用吸光光度法测定总黄酮含量 步骤（2)得到的吸取提取液lmL，用70%乙醇补至5mL，加入浓度为5%NaN02 0. 3mL， 摇匀置6min;再加入浓度为10%A1 (NO3)3 0. 3mL，摇匀置6min ;加浓度为4%NaOH4mL，用 蒸馏水定容至10mL，摇匀15min后测定吸光度，根据吸光度（Y)和浓度（X)的回归方程： y=9. 12x-0. 023, R2=O. 9986,计算浓度； (4) 实验设计与统计分析 a单因素试验 依次改变上样浓度、上样PH、洗脱剂浓度、流速进行单因素试验，用步骤（3)中吸光光 度法测定所得的茼蒿总黄酮提取液中的总黄酮的浓度； b响应面法优化设计 根据单因素试验结果，选择上样浓度、上样PH、洗脱剂浓度、流速四个因素，利用 Design-Expert软件根据Box-Benhnken设计原则进行实验设计，以样浓度A、上样pH B、洗 脱剂浓度C、洗脱流速D为自变量，以TFCL回收率为响应值Y，建立多元二次方程： Y=63. 31-0. 72A-0. 83B-0. 14C-0. 072D-0. 71AB-0. 053AC-0. 7AD-0. 41BC+0. 54BD-0. 21C D-2. 500E-0. 78A2-0. 53Bz-2. 22Cz-〇. 7ID2 (5) 实验结果分析与优化 利用Design-Expert软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应 面及其等高线图。2. 根据权利要求1所述的一种响应面优化高纯度茼蒿总黄酮的提取纯化方法，其特征 在于，所述步骤（1)的大孔吸附树脂预处理方法具体如下： 用95%乙醇大孔吸附树脂完全浸泡24h，采用湿法装柱，用95%乙醇反复洗涤，直至水与 流出液不产生白色浑浊，再用蒸馏水洗至无醇味；接着先后用体积分数5%的盐酸与质量分 数2%的强氧化钠反复淋洗，并静止置2-4h后，用蒸馏水洗至pH值中性，浸泡于蒸馏水中备 用。3.根据权利要求1或2所述的一种响应面优化高纯度茼蒿总黄酮的提取纯化方法，其 特征在于，所述步骤（2)大孔吸附树脂分离纯化具体如下： 将质量浓度分别为〇. 25、0. 50、0. 75、1. 00、1. 25、1. 50和2. OOmg/ml的步骤二到的茼蒿 黄酮乙醇提取液，，用酸或碱调至pH值分别为4、5、6、7、8、9，加入到0-101大孔树脂柱中，用 体积分数分别为55%、65%、75%、85%、95%的洗脱剂乙醇以I. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. OmL/min的流 速进行洗脱，对洗脱液进行浓缩。
【专利摘要】本发明涉及一种响应面优化高纯度茼蒿总黄酮的提取纯化方法包括如下步骤：超声波辅助法对茼蒿总黄酮进行粗提，双水相萃取法分离茼蒿总黄酮，利用响应面优化方法对大孔树脂分离纯化茼蒿总黄酮进行优化，得到含量高的茼蒿总黄酮。本发明针对茼蒿本身，采用超声波辅助提取，双水相萃取的工艺，使茼蒿总黄酮的提取率变高，其他非黄酮成分的提取率变低，并且可以用大孔树脂进行分离纯化，具备操作工艺简单、成本低、易操作的特点。
【IPC分类】A61K36/28
【公开号】CN104997826
【申请号】CN201510396370
【发明人】陈建中, 葛水莲
【申请人】邯郸学院
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月8日