作都严格遵守 《实验动物管理条例》来执行。
[0031] 将实验动物随机分为5组，每组10只，进行行为观察，血清IgE测定，肺泡灌洗液IL-4,IL-13测定，肺组织切片测定。
[0032] 实验设计：
[0033] 桔皮素组设两个剂量组，即10mg/kg体重，30mg/kg。另设空白组、模型对照组、地 塞米松组（阳性对照组）
[0034] 1)致敏过程
[0035] 模型对照组和药物组在第0、7、14天选择OVA腹腔注射与皮下注射相结合。每只 老鼠每次共注射0. 2mL0VA致敏液（腹腔注射0.lmL+颈后部皮下注射0. 05mL+大腿外侧皮 下注射0. 05mL);空白组以相同的注射方式注射等量生理盐水。
[0036] 2)激发过程
[0037]在21，22, 23天桔皮素组腹腔注射桔皮素（10mg/kg，30mg/kg)，地塞米松组注射地 塞米松2mg/kg，注射量为0. 2mL。模型组和正常对照组，腹腔注射等量生理盐水，注射一小 时后滴鼻激发。
[0038] 本次激发采取滴鼻激发，模型对照组和药物组在第21、22、23天连续三天滴鼻激 发（激发液50uL)，空白对照组采用等量的生理盐水滴鼻激发。每次激发后观察小鼠相关行 为。
[0039] 仪器与试剂
[0040] (1)仪器
[0041 ] 高速冷冻离心机（美国Thermo公司）；
[0042] 水平离心机（美国Thermo公司）；
[0043] 酶标仪（奥地利TECAN公司）；
[0044] 涡旋混合器（北京金紫光科技发展有限公司）；
[0045] 数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；
[0046] METTLETOLEDOG204 型电子天平（瑞士公司）；
[0047] -80°C超低温冰箱（青岛海尔股份有限公司）；
[0048] 培养箱/干燥箱上海一恒科学仪器有限公司；
[0049]PHSJ-4A实验室PH记上海雷磁。
[0050] (2)试剂
[0051] 鸡卵白蛋白：美国sigma公司
[0052] 硫酸铝钾：（分析纯）天津市福晨化学试剂厂
[0053] 氢氧化钠：（分析纯）天津市福晨化学试剂厂
[0054]0. 9%氯化钠注射液：长春豪邦药业有限公司
[0055] 桔皮素：自提取，纯度99%以上
[0056] 鸡卵白蛋白：美国sigma公司
[0057] 小鼠血清IgEELISA试剂盒：美国Bioscience公司
[0058] 小鼠IL-4ELISA试剂盒：美国Bioscience公司
[0059] 小鼠IL-13ELISA试剂盒：美国Bioscience公司
[0060] 乙酰甲胆碱：美国sigma公司
[0061] BSA:美国sigma公司
[0062] Trizol:美国sigma公司
[0063] 吐温-80 :宝泰克生物科技公司
[0064] 瑞士吉姆萨染色液：南京建成科技有限公司
[0065] 地塞米松：郑州卓峰制药有限公司
[0066] 其他化学试剂：北京化工
[0067] 试验方法
[0068] 实验试剂的配置
[0069] 0VA致敏液：参考Se-WoongOh等的配置方法，500ug/mL的0VA中加入等量百分之 十的AIK(S04) 2，待其均匀，用10M氢氧化钠调节其PH值为6. 5,室温孵育一小时，750g离心 15分钟，弃上清，现配先用。
[0070] 0VA激发液：取0VA8.Omg溶于4mL生理盐水中。
[0071] 桔皮素的溶解：取20%乙醇，5%的吐温80,加热超声（40度）至全溶，加75%生 理盐水稀释成50mg/kg的母液，不可超声；取母液0. 3mL，用生理盐水稀释至1. 5mL，即为 10mg/kg的桔皮素溶液；取母液1. 2mL，用生理盐水稀释至2.OmL，即为30mg/kg，每次现用现 配。
[0072] 血清IgE的测定
[0073] 最后一次注射药物滴鼻激发24h后，摘取老鼠眼球取血。血液室温放置30min后， 将其放置在4°C冰箱中静置放置一夜后，在4°C离心机中以4500r/min的速度离心15分钟， 取其上清液置于小离心管中，然后在同样温度下以l〇〇〇〇r/min的速度离心10min，再取其 上清液，将其放置在4度冰箱中保存备用。
[0074] 血清中IgE的测定，使用ELISA试剂盒（美国Bioscience公司）测定。具体步骤 如下
[0075] ELISA板的每个孔加上100uL捕获抗体（captureantibody)，4°C孵育过夜。
[0076] 根据说明书上的要求配置封闭液（BlockingBuffer)。
[0077] 用清洗缓冲液（WashBuffer) (400uL/we11)抽洗，每次清洗缓冲液在孔内停留 lmin〇
[0078]每孔加入250uL封闭液（BlockingBuffer)，室温孵育2h。
[0079]配置标准品（Standard)〇
[0080] 重复第三步的清洗步骤2次。
[0081] 用无菌水配置标准液，再用工作液A(AssayBufferA)稀释标准品，建立 2列浓度的标准品，用来绘制标准曲线。所有的标准品孔均加入相应浓度的标准品 (standard) 100uL，注意不要划伤微量孔内壁。
[0082]空白组加入100uL工作液A(AssayBufferA) 〇
[0083]样品组加入50uL工作液A(AssayBufferA)。
[0084] 加入50uL预稀释的样品至相应的微量孔内，至少用工作液A(AssayBufferA)稀 释了 25倍。
[0085] 覆盖粘膜，室温（18-25)孵育2小时，可用微量振荡器以400rpm摇动。
[0086] 重复第二步清洗4次。
[0087] 制备检测抗体（DetectionAntibody)(根据说明书上相关要求）。
[0088] 加入100uL稀释过的检测抗体（DetectionAntibody)至所有的微量孔。
[0089] 室温孵育lh，可使用微量振荡器以400rpm摇动。
[0090] 重复第三步清洗4次。
[0091]配置抗生蛋白链菌素-HRP(Streptavidin-HRP)〇
[0092] 向所有的微量孔内加入100uL抗生蛋白链菌素-HRP(Str印tavidin-HRP)。
[0093] 室温孵育30分钟。
[0094] 重复第三步清洗4次。
[0095] 向所有微量孔内加入lOOuLTMB底物溶液。室温避光孵育15分钟。
[0096]向每个微量孔内加入100uL停止液（StopSolution)〇
[0097] 使用酶标仪以基色波长为450nm检测各个微量孔吸光度。
[0098] (3)肺泡灌洗夜
[0099] 小鼠取肺部后，用PBS灌洗，0. 3、0. 3、0. 4灌洗三次，收集灌洗夜，立刻500g冷冻离 心5分钟，取上清，检测细胞因子。
[0100] 细胞活素检测，IL-4.IL-13,用ELISA(美国Bioscience公司）测量
[0101]a.肺泡灌洗夜中IL4的检测
[0102] (1)ELISA板的每个孔加上100uL捕获抗体（captureantibody)，4°C孵育过夜。
[0103] (2)用清洗缓冲液（WashBuffer)( >250uL/well)抽洗，每次清洗缓冲液在孔内 停留lmin。
[0104] (3)用 4 倍的去离子水稀释 1 倍的5XELISA/ELISP0TDiluent，用200uL的IX ELISA/ELISP0TDiluent，室温孵育 1 小时。
[0105] (4)可选性：用清洗缓冲液（WashBuffer)清洗至少1次。
[0106](5)用无菌水配置标准液，再用IXELISA/ELISP0TDiluent稀释标准液，加100uL 标准品至相应的微量孔内，2列浓度的标准品，用来绘制标准曲线；加100uL样品至相应的 微量孔。室温孵育2小时。
[0107] (6)重复第二步的清洗3-5次。
[0108] (7)加100uL检测抗体至所有微量孔，室温孵育1小时。
[0109] (8)重复第二步的清洗3-5次。
[0110] (9)向所有的微量孔内加入100uL抗生蛋白链菌素-HRP(Str印tavidin-HRP)，室 温孵育30分钟。
[0111] (10)重复第二步的清洗5-7次。
[0112] (11)加100uLTMB底物溶液。室温孵育15分钟。
[0113](12)向每个微量孔内加入50uL停止液（StopSolution)。
[0114](13)使用酶标仪以基色波长为450nm检测各个微量孔吸光度。
[0115]b.肺泡灌洗夜中白介素13的检测
[0116](1)ELISA板的每个孔加上100uL捕获抗体（captureantibody)，4°C孵育过夜。
[0117](2)用清洗缓冲液（WashBuffer)( >250uL/well)抽洗，每次清洗缓冲液在孔内 停留lmin。
[0118] (3)用 4 倍的去离子水稀释 1 倍的5XELISA/ELISP0TDiluent，用200uL的IX ELISA/ELI