SP0TDiluent，室温孵育 1 小时。
[0119] (4)可选性：用清洗缓冲液（WashBuffer)清洗至少1次。
[0120] (5)用无菌水配置标准液，轻微摇晃15分钟在进行下一步的稀释。
[0121] (6)用IXELISA/ELISPOTDiluent稀释标准液，加lOOuL标准品去相应的微量孔 内，2列浓度的标准品，用来绘制标准曲线；加100uL样品至相应的微量孔。室温孵育2小 时。
[0122] (7)重复第二步的清洗3_5次。
[0123] (8)加lOOuL检测抗体至所有微量孔，室温孵育1小时。
[0124] (9)重复第二步的清洗3-5次。
[0125](10)向所有的微量孔内加入100uL抗生蛋白链菌素-HRP(Str印tavidin-HRP)，室 温孵育30分钟。
[0126] (11)重复第二步的清洗5_7次。
[0127] (12)加100uLTMB底物溶液。室温孵育15分钟。
[0128] (13)向每个微量孔内加入50uL停止液（StopSolution)。
[0129] (14)使用酶标仪以基色波长为450nm检测各个微量孔吸光度。
[0130] (4)肺组织的收集
[0131] 小鼠最后滴鼻24h后，处死小鼠，取出全部肺组织，将其放在生理盐水中进行清 洗，洗去肺部组织的血液及其他残留，然后放入4%的中性甲醛中进行固定，在4°C冰箱中 保存。
[0132] 肺组织H&E染色
[0133] 脱水透明，将固定好的组织用PBS冲洗，出去残留的固定液，然后用80%、90%、 100 %的乙醇对组织进行脱水。
[0134] 浸蜡包埋：将已经透明处理了的组织放在已经溶化了的石蜡里，放在熔蜡箱里保 存。等到石蜡完全浸入组织块以后进行包埋处理：将已经溶化的石蜡倒入事先准备好的容 器中，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入容器中，冷却凝固成块。
[0135] 切片与贴片：将已经包埋好的变硬了的蜡块固定在切片机上，切成薄片。用镊子将 切好的蜡片平铺在4至45度水面上使得皱的蜡块平整，然后将平整后的蜡块迅速捞到载玻 片上，放在60至65度烘箱中烤片20min左右，然后进行染色。
[0136]H&E染色步骤：
[0137] 脱蜡：二甲苯⑴15min，二甲苯（II)15min，接着顺序经过100%乙醇5min，100% 乙醇2min，95%乙醇2min，80%乙醇2min，75%乙醇2min，最后用蒸馏水洗3次，每次5min。
[0138] 染色：苏木精染液5min，用流水蓝化15min，1%盐酸酒精分化1~3s，然后用水洗 3〇8，蒸馏水洗1~28,95%乙醇1111；[11，0.5%伊红染液1-2111；[11。
[0139] 脱水透明：用蒸馏水冲洗1~2s，然后95%乙醇（1)1分钟，95%乙醇（11)1分钟， 100%乙醇lmin并重复lmin，然后分别用二甲苯（I)、二甲苯（II)、二甲苯（III)透明处理， 每次2min，重复2 -次。
[0140] 封片：取出片子，待二甲苯蒸发以后，加入中性树胶覆压盖玻片，要缓慢操作，防止 因过快封片而产生气泡，然后在室温下晾干，在光镜观察拍照。
[0141] (5)实验数据采用Excel与SPSS17. 0软件，方差分析采用LSD法，检验水准a= 0. 05。P〈0. 05认为差别有统计学意义，P〈0. 01认为差别有显著统计学意义。
[0142] 2.结果
[0143] 2.1小鼠行为学结果
[0144] 空白组的小鼠行为和外观方面并没有出现明显的哮喘症状。模型组小鼠在滴鼻激 发过程中出现明显的脸鼻部骚痒挠鼻，呼吸急促，肚子出现明显的呼吸收缩，毛发直立，弓 背等哮喘的症状。药物组及阳性地塞米松组都出现了不同程度的哮喘症状，但其程度较模 型组要低。
[0145] 2.2血清中1区￡
[0146] 由ELISA试剂盒测得血清中IgE含量，空白组：5.981±0.845耶/1^;模型组： 46.532±4.684ug/mL;地塞米松组（2mg/kg) :33.356±4.376ug/mL;桔皮素组（10mg/kg): 28. 636±2. 546ug/mL;桔皮素组（30mg/kg) :21. 624±5. 500ug/mL。
[0147] 模型组与空白组比较可知，模型组比空白组血清中IgE含量显著提高（P〈0.01)， 说明本次实验成功建立了BABL/c小鼠过敏性哮喘模型；与模型组和地塞米松组（2mg/kg) 相比，可知桔皮素可以降低过敏性哮喘BABL/c小鼠血清中IgE含量，且10mg/kg和30mg/kg 的桔皮素降低血清中IgE含量的效果要强于2mg/kg的地塞米松。
[0148] 表1:各组小鼠血清中IgE的含量极其显
[0149]
[0150] 2. 3肺泡灌洗夜中IL-4的含量
[0151] 由ELISA试剂盒测得肺泡灌洗夜中IL-4含量，空白组：0.090±0. 006pg/mL;模 型组：0? 107±0. 003pg/mL;地塞米松组（2mg/kg) :0? 079±0. 004pg/mL;桔皮素组（10mg/ 1^):0.080±0.003卩区/1111;桔皮素组（3011^/1^):0.073±0.003卩区/111匕
[0152] 药物组与模型组比较可知，桔皮素具有降低过敏性哮喘小鼠肺泡灌洗夜中IL-4 含量的作用。
[0153] 2. 4肺泡灌洗夜中IL-13的含量
[0154] 由ELISA试剂盒测得肺泡灌洗夜中E-4含量，空白组：9. 460±0. 837pg/mL;模型 组：20. 518±0. 232pg/mL;地塞米松组（2mg/kg) :13. 237±0. 152pg/mL;桔皮素组（10mg/ kg) :14.289±0.662pg/mL;桔皮素组（30mg/kg) :12.001±0.614pg/mL。
[0155] 药物组与模型组比较可知，桔皮素具有降低过敏性哮喘小鼠肺泡灌洗夜中IL-13 含量的作用。
[0156] 表2 :各组小鼠BALF中IL-4的含量极其显著性
[0157]
[0158]
[0159] 表3 :各组小鼠BALF中E-4的含量极其显著性
[0160]Table3：thetypeofIL-4contentinBALFextremelysignificant
[0161]
[0162] 2. 5肺组织切片的结果
[0163] 和空白组（图1.)对比可知，模型组（图2.)的肺组织中出现了非常明显的炎症 情况，肺组织中的支气管与其中的血管出现了严重的浸润情况，肺组织中充满了炎症细胞， 主要是嗜酸性细胞以及淋巴细胞；地塞米松组（图3)和空白组（图1)相比，出现了明显的 炎症现象，和模型组（图2)相比，地塞米松组的炎症程度明显比模型组低；桔皮素组（图4、 图5)也出现了较轻的炎症情况，但其炎症程度明显较其他组要低。
[0164] 3.小结
[0165] 对0VA诱导BABL/c小鼠哮喘模型进行腹腔注射不同剂量的桔皮素，能够明显减低 血清的IgE水平、降低肺泡灌洗液中的细胞因子水平，从肺组织切片并染色处理结果可知， 肺组织的炎性浸润情况得到了明显的抑制。由以上实验结果可知，桔皮素具有一定的抗过 敏性哮喘作用。
[0166] 实施例2
[0167] 取纯度为98%的桔皮素21克，加淀粉104克混合均匀，装入胶囊，制成1000粒，得 魅力含有桔皮素约20毫克的抗过敏性哮喘药品，本品每日服用两次，每次两粒。
[0168] 实施例3
[0169] 取含桔皮素60%的陈皮总黄酮提取物35克，加淀粉90克混合均匀装入胶囊，制成 1000粒，得每粒含桔皮素约20毫克的抗过敏性哮喘的保健品。本品每日服用两次，每次两 粒。
【主权项】
1. 桔皮素在制备治疗过敏性疾病药物组合物中的用途。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述过敏性疾病为过敏性鼻炎、过敏性结膜 炎、过敏性支气管哮喘、播散性神经性皮炎、过敏症、昆虫针刺、药物过敏、食物过敏、过敏性 哮喘、湿疹。3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述过敏性疾病为过敏性哮喘。4. 如权利要求1所述的用途，其特征在于：还包含免疫治疗、抗血管新生剂、细胞因子、 激素、抗体、多核苷酸、光动力学治疗剂、非留体抗炎药、抗组胺药、a-肾上腺素激动剂、类 固醇及其任意组合。5. 如权利要求1所述的用途，其特征在于：药物组合物包含药用或制药药剂、载体、助 剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂或乳化剂、溶解促进剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。6. 如权利要求1所述的用途，其特征在于：药物组合物为颗粒剂、片剂、缓释剂、胶囊、 注射液或栓剂。
【专利摘要】本发明申请人意外的发现桔皮素具有治疗过敏性疾病的作用，尤其涉及过敏性哮喘，其可以作为唯一的活性成分单独使用，亦可与其他药物联合使用，其中联合使用的活性成分包括但不限于免疫治疗、抗血管新生剂、细胞因子、激素、抗体、多核苷酸、光动力学治疗剂、非甾体抗炎药、抗组胺药、α-肾上腺素激动剂、类固醇及其任意组合。
【IPC分类】A61P11/02, A61K31/352, A61P37/08, A61P11/06
【公开号】CN105055400
【申请号】CN201510473546
【发明人】时晓磊, 金永日, 李绪文, 揭金鑫, 吴迪
【申请人】吉林大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月5日