破碎，得到细胞破碎液，将细胞破碎液放 入100°C水浴锅中保持30分钟进行水浴脱毒处理，主要是通过高溫使其他蛋白、核酸等变 性，起到脱毒和消毒作用。脱毒处理后的细胞破碎液W5000r/min离屯、lOmin，弃细胞壁沉 淀，保留上清液；其中，细胞破碎除上述超声波细胞破碎外，还可W选用胶体磨、超高压均质 机进行细胞破碎，W胶体磨、超高压均质机进行细胞破碎时，将培养好的肉毒杆菌发酵液倒 入胶体磨或超高压均质机中，开机运转即可将肉毒杆菌破碎，为保证破碎效果可反复破碎 1-3次，至显微镜下观察没有完整的细胞即可；W超声波进行细胞破碎时，将培养好的肉毒 杆菌发酵液置于烧杯中，将烧杯置于冰浴中，在低溫条件下，将超声波探头置于肉毒杆菌 发酵液中，进行超声波细胞粉碎，每间隔10超声秒一次，约超声时间总计10分钟，至在显微 镜中检查没有完整的肉毒杆菌细胞即可； ③ 向②中的上清液加入硫酸锭，使硫酸锭终浓度达到50%，离屯、，80(K)r/min-10000r/ min,离屯、lOmin，收集富含蛋白的沉淀，弃上清液，将收集的蛋白质沉淀按照每1L肉毒杆 菌发酵液溶于80mL憐酸盐缓冲液（P册.8)的比例溶于憐酸盐缓冲液（pH6. 8)，然后装入 透析袋(规格8000-14000道尔顿，美国Viskase公司生产)，透析袋外的透析缓冲液同样为 憐酸盐缓冲液，在揽拌下，透析24小时，每隔6小时更换一次透析缓冲液，W彻底去除硫 酸锭，透析结束后，取透析袋中的蛋白液按照常规操作方法进行十二烷基硫酸钢-聚丙締 酷胺凝胶电泳（SDS-PAGE)分析，测试样品分S个浓度，分别为透析结束透析袋中的蛋白液 原液和加2倍、5倍体积的憐酸盐缓冲液（pH6. 8)稀释至1/3和1/6浓度的蛋白液稀释 液，WT'hermoFisherScientific公司生产的蛋白质分子量标准（PageRuler?Prestained ProteinLadder, 10to180kDa，型号26616)为参照，结果见附图3,对比条带可见，肉毒 杆菌经破碎、透析后，收集的蛋白液中的蛋白分子量为23kd，进一步W考马斯亮蓝G-250染 色结合分光光度计分析测定收集的蛋白液中的蛋白浓度，并调整蛋白浓度为0. 3-0. 5wt. %， 作为制备本发明的护肤膏时使用的肉毒杆菌破壁蛋白液。
[0024]其中，考马斯亮蓝染色的具体过程如下： A.试剂配置选取结晶牛血清清蛋白或酪蛋白，W微量凯氏定氮法或者根据牛血清清 蛋白的消光系数是6. 6来计算蛋白质百分含量，然后配制成浓度为100ug/mL的牛血清清 蛋白标准液。考马斯亮蓝G-250原液溶于50血95%乙醇，加入100血质量浓度为0. 85g/mL 的憐酸，作为母液保存，使用时用水稀释到lOOOmU得考马斯亮蓝G-250稀释液，其终浓度 为考马斯亮蓝G-250质量浓度为0. 01%、憐酸质量浓度为0. 085g/mU用于下述使用。
[00巧]B.绘制蛋白质标准曲线 取18只试管，分为6组，每组3只作为重复W减小误差，按下表加入
然后向上述每只试管分别加入5.OmL考马斯亮蓝G-250稀释液，摇匀放置5min，借助紫 外-可见分光光度计在595nm处测定吸光值，W每组试管的吸光值平均值为纵坐标，W牛血 清蛋白的质量为横坐标绘制蛋白质标准曲线。
[0026]C.蛋白样品取3只试管，每支加入0.5mL透析后透析袋中的蛋白液，并加蒸馈水 补充至1. 0血，另取3只试管分别加入1. 0血蒸馈水做空白组，然后向每支试管加入5. 0血 考马斯亮蓝G-250稀释液，摇匀放置5min后，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光 值。借助B中的蛋白质标准曲线及测定结果的平均值计算透析袋中的蛋白液的蛋白含量， 并调整蛋白浓度，具体调整方法为若测定的蛋白浓度高，则直接W憐酸盐缓冲液稀释；若浓 度低，则重新W硫酸锭沉淀、离屯、、并透析，至蛋白浓度为0. 3-0. 5wt. %。
[0027] (3)=屯粉和巧等粉在使用前进行预处理，预处理的步骤包括灭菌、干燥和粉碎， 粉碎后的粒度为300目，取（2)中的肉毒杆菌破壁蛋白液80mU按照实施例1所示配比边揽 拌边依次加入丙=醇、维生素E、维生素A、维生素C、胶原蛋白、=屯粉、巧等粉、尿囊素、薄 荷冰、薰衣草精油和簇甲基纤维素钢，得混合浆体； (4)将（3)中的混合浆体混合后，在匀浆机上匀浆半小时即得消除妊娠纹和皱纹的复合 护肤膏，为便于携带及保存，可将复合护肤膏进行分装、密封为小包装产品，如15g/瓶，3瓶 /盒。
[0028] 应用实施例 选取分娩后6月-36个月的女性300名，分成30个试用小组，每小组10人，每小组配 一名美导师负责指导试用并负责观察和记录受试者桂除妊娠纹的疗效情况. 使用方法：于早晚各使用各一次，最好在洗浴后使用，使用时用手挑取护肤膏稍许(约 0. 5克)涂抹在妊娠纹或皮肤皱纹处均匀涂展开来，在涂展的同时可W用手轻轻按摩涂展部 位(按摩大约五分钟)，通过按摩可W帮助皮肤有效吸收，改善和提高产品效果。一盒为一个 疗程，使用一个疗程后暂停使用7--10天，再进行下一个试用疗程，共使用3个疗程后统计 的效果如下：
综合可见，本发明提供的消除妊娠纹和皱纹的护肤品，经临床300名受试者试用，其中 有92. 67% (278人)的受试者，基本消除了妊娠纹；6. 33% (19人)的受试者，减轻了妊娠纹； 1. 00% (3人)的受试者，轻微的减轻了妊娠纹，同时，本产品还能有效地减轻皮肤皱纹，预防 皮肤老化和增强皮肤弹性的作用，同时还兼具有减轻皮肤痊痒等作用，对皮肤具有滋润、白 暫等效果。
【主权项】
1. 一种消除妊娠纹的复合护肤膏，其特征在于，所述护肤膏包括均匀混合的下述原 料：60-100mL肉毒杆菌破壁蛋白液、5-15mL丙三醇、5-15mL维生素E、5-15mL维生素A、 10-20g维生素C、15-25 g胶原蛋白、10-25 g三七粉、10-25 g茯苓粉、2-10mL薰衣草精油、 0. 1-10g羧甲基纤维素钠，所述肉毒杆菌破壁蛋白液为肉毒杆菌发酵液经破壁处理后提取 的蛋白溶液，其蛋白含量为〇. 3-0. 5wt. %。2. 根据权利要求1所述的一种消除妊娠纹的复合护肤膏，其特征在于，所述护肤膏的 原料还包括5-15 g尿囊素和0. 1-0. 2 g薄荷冰。3. 根据权利要求1所述的一种消除妊娠纹的复合护肤膏，其特征在于，所述护肤膏由 下述原料均勾混合而成：80_100mL肉毒杆菌破壁蛋白液、10_15mL丙三醇、10_15mL维生素 E、10-15mL维生素A、15-20g维生素C、20-25 g胶原蛋白、22-25 g三七粉、22-25g茯苓粉、 10-15 g尿囊素、0.1-0. 15 g薄荷冰、2-4mL薰衣草精油、5-8 g羧甲基纤维素钠。4. 根据权利要求1-3任一所述的一种消除妊娠纹的复合护肤膏，其特征在于，所述肉 毒杆菌破壁蛋白液是按照如下方法制备的：（1)取肉毒杆菌菌种按接种量1环/IL或体 积比0. 01-0. 1%接种至LB液体培养基中，37°C恒温培养48-96h，得肉毒杆菌发酵液；（2) 将（1)中的肉毒杆菌发酵液进行细胞破碎，100°C水浴脱毒处理后离心弃沉淀，保留上清 液；（3)向（2)中的上清液加入硫酸铵，离心收集沉淀，将收集的沉淀以磷酸盐缓冲液透析 18-30h，调整蛋白含量为0. 3-0. 5wt. %，得肉毒杆菌破壁蛋白液。5. 权利要求1所述的一种消除妊娠纹的复合护肤膏的制备方法，其特征在于，所述制 备方法包括以下步骤： (1) 按照权利要求4所述步骤制备肉毒杆菌破壁蛋白液； (2) 取（1)中的肉毒杆菌破壁蛋白液60-100mL，边搅拌边依次加入5-15mL丙三醇、 5-15mL维生素E、5-15mL维生素A、10-20g维生素C、15-25 g胶原蛋白、10-25 g三七粉、 10-25 g茯苓粉、2-10mL薰衣草精油和0.1-10 g羧甲基纤维素钠，得混合浆体； (3 )将（2 )中的混合浆体搅拌20-40分钟，得复合护肤膏。6. 根据权利要求5所述的一种消除妊娠纹的复合护肤膏的制备方法，其特征在于，所 述肉毒杆菌菌种为从变质腐烂腊肉中分离纯化获得，其分离纯化过程如下：挑取腊肉腐烂 表面的细菌接种于LB固体培养基37°C恒温培养24-72h，挑取单菌落接种至新的LB固体培 养基上，37°C恒温培养24-72h，显微镜下观察，反复进行挑取单菌落接种至新的LB固体培 养基恒温培养，至显微镜下观察菌落为纯肉毒杆菌，即筛选得到纯化的肉毒杆菌菌种。7. 根据权利要求5所述的一种消除妊娠纹的复合护肤膏的制备方法，其特征在于，所 述肉毒杆菌发酵液进行细胞破碎、l〇〇°C水浴脱毒处理后的离心条件为4500-5500r/min、 8_15min;所述加入硫酸铵后进行离心的条件为8000r/min-10000r/min、8-15min。8. 根据权利要求5所述的一种消除妊娠纹的复合护肤膏的制备方法，其特征在于，所 述透析过程为：以IL肉毒杆菌发酵液所得沉淀加70-90mL磷酸盐缓冲液计，将溶有沉淀的 缓冲液放入透析袋中，再将透析袋放入磷酸透析缓冲液中，维持搅拌，每4-6h更换一次透 析缓冲液，透析18-30h。9. 根据权利要求5所述的一种消除妊娠纹的复合护肤膏的制备方法，其特征在于，所 述步骤（2)中三七粉和/或茯苓粉在加入前进行预处理，所述预处理包括灭菌、干燥、粉碎， 粉碎后的三七粉和/或茯苓粉粒度为200-300目。
【专利摘要】本发明公开了一种消除妊娠纹的复合护肤膏及其制备方法，属日化用品及美容用品领域，采用的技术方案是，一种消除妊娠纹的复合护肤膏，包括均匀混合的下述原料：60-100mL肉毒杆菌破壁蛋白液、5-15mL丙三醇、5-15mL维生素E、5-15mL维生素A、10-20g维生素C、15-25？g胶原蛋白、10-25？g三七粉、10-25？g茯苓粉、2-10mL薰衣草精油、0.1-10？g羧甲基纤维素钠，肉毒杆菌破壁蛋白液为肉毒杆菌培养液经破壁处理后提取的蛋白溶液，其蛋白含量为0.3-0.5？wt.%。其优点是配比合理，有效消除及减轻妊娠纹，且生物相容性好，安全性高，制备方法简单，适宜工业生产。
【IPC分类】A61K8/99, A61Q19/02, A61Q19/08, A61Q19/00, A61K8/64, A61K8/97
【公开号】CN105213291
【申请号】CN201510550402
【发明人】尹志明, 邱德文
【申请人】吉安市御美丽健康产业股份有限公司
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年9月1日