一种增强抗肿瘤功效的真菌组合物及其多糖的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于制药技术领域，涉及一种增强抗肿瘤功效的真菌组合物及其多糖的提 取方法。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是一类常见的多发病，其中恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的一类疾 病。据世界卫生组织统计，当今世界，每6秒即有1人死于癌症。在我国，随着人口老龄化， 肿瘤的发病率和死亡率呈上升趋势。因此抗肿瘤药物的筛选和作用机制的研究是近年来生 物技术方面的研究热点。目前对恶性肿瘤的发病机制及防治研究已取得较大进展，但仍有 许多难点有待解决，比如采用的放射治疗、化学药物治疗及生物治疗，都是一些辅助疗法， 未能从根本上解决问题，使得临床应用因疗效、毒性反应以及肿瘤细胞耐药等问题受到了 一定的限制。因此，从不同途径寻找高效低毒的天然抗肿瘤药物是一个崭新的出发点。
[0003] 近几十年来国内外在大型真菌的食用、药用等方面的研究和开发应用发展较快， 从大型真菌中分离得到的抗肿瘤活性成分主要包括糖类、蛋白质类、萜类、生物碱、有机酸 类等，表明真菌是寻找抗肿瘤药物的宝贵资源库。
[0004] 真菌在长期的生物进化过程中，为抵抗外来物种侵袭以及适应外界环境，产生了 大量的化学防御物质和生长调节物质，这些物质对人类来说具有防病、治病的作用，是我们 开发利用真菌的基础。自1957年Lucas等通过实验证实高等真菌具有抗癌活性，日本科学 家就对真菌多糖的药用活性展开了广泛研究，随着科学研究的深入，发现真菌多糖及多糖 衍生物具有抗肿瘤活性，而且真菌中存在蛋白质类、萜类等大量具有抗肿瘤活性的天然化 合物。
[0005] 真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体和发酵液中分离出的，由10个以上的单糖通过 糖苷键连接而成的高分子多聚物。据文献报道，这类化合物在体内的抗肿瘤活性主要是通 过恢复和提高宿主的免疫功能来实现的，在体外对肿瘤细胞有直接的细胞毒性，可直接杀 死癌细胞，而对机体正常细胞无杀伤作用，这是真菌多糖与其他细胞毒类抗肿瘤药物相比 具有优势的地方之一。现代医学药理研究表明，香菇、灵芝、姬松茸等大型真菌中的某些多 糖组分，具有激活人体内免疫活性的功能，刺激抗体产生，从而达到提高人体免疫力，增强 人体抗肿瘤的能力。
[0006] 如：香燕多糖（lentinan，LNT)是从香燕（Lentinusedodes)的子实体中分离得到 的一种β-1，3-葡聚糖，它具有高纯度、高分子结构，是一种重要的免疫调节剂。LNT的抗肿 瘤作用并非直接杀伤肿瘤细胞，而是在体内诱导和增强Τ细胞，ΝΚ细胞及单核巨噬细胞的 作用，激活宿主产生抗肿瘤免疫应答，使宿主细胞对淋巴因子、激素和其他生理活性因子的 反应性由低下恢复到接近于正常能力，使肿瘤受抑制，从而发挥抗癌作用。
[0007] 灵芝多糖，灵芝[Ganoderma Lucidum(Leyssex Fr. )Karst]属担子菌纲多孔菌目 灵芝属真菌，自古以来就被尊称为"瑞草"、"仙草"。具有抗氧化、抗肿瘤及免疫调节等作用， 而多糖是灵芝的主要活性成分之一。灵芝多糖（ganodema lueudim polysaceharide，GLP) 具有抗肿瘤作用，其机制是通过增强巨噬细胞的吞噬功能，提高淋巴细胞的活性，使IL-1、 TNF-α的分泌增强，并使IL-2的释放增加，提高机体的免疫功能，从而减少肿瘤的发生
[0008] 姬松鸾多糖，姬松鸾（Agaricus subrufescens)又名巴西蘑燕，属担子菌亚门伞 目蘑燕属真菌，学名柏氏蘑燕，其抗癌作用被认为真菌之首。姬松鸾多糖（agaricusblazei murrill polysaccharides，ABP)是姬松鸾发挥抗肿瘤作用的主要成分。其作用机制主要 是增强宿主细胞免疫功能及诱导细胞凋亡。姬松茸多糖通过活化T淋巴细胞、巨噬细胞、天 然杀伤细胞，诱发促进干扰素的产生等对肿瘤细胞直接或间接地发挥作用，对宿主的免疫 系统产生影响，抑制肿瘤增殖，诱导细胞凋亡，从而达到治疗肿瘤的目的。
[0009] 虫草多糖，虫草（Chinese Caterpillar Fungus)，是一种属于麦角菌科虫草属的 冬虫夏草菌。现已证明虫草多糖是虫草调节机体免疫功能的活性成分。
[0010]目前，香菇、灵芝、云芝、姬松茸中多糖的提取，主要采用传统的热水浸提法，提取 率仅在8 %左右，提取率低，效率低，成本高。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是克服上述不足之处提供一种增强抗肿瘤功效的真菌组合物及其 多糖的提取方法。
[0012] 本发明的目的是通过以下方式实现的：
[0013] -种具有增强抗肿瘤功效的真菌组合物，该组合物包括以下重量份的组分：香菇 30-35重量份、云芝20-25重量份、灵芝20-25重量份、姬松茸15-20重量份，虫草菌丝体2-6 重量份，灵芝孢子粉2-6重量份。
[0014] 优选该组合物包括以下重量份的组分：香菇30重量份、云芝23重量份、灵芝23重 量份、姬松鸾16重量份，虫草菌丝体4重量份，灵芝孢子粉4重量份。
[0015] 上述具有增强抗肿瘤功效的真菌组合物中真菌多糖提取方法包括以下步骤： 取香菇、云芝、灵芝和姬松茸超声提取后过滤，得到的滤液进行微滤，操作条件是：压力 为0. 25~0. 45MPa，操作温度为36°C ;得到的浓缩液再进行超滤，超滤条件为：压力为 1. 05Mpa~1. 25Mpa，操作温度为20°C~45°C，浓缩倍数为3~6倍，再进行真空冷冻干燥： 操作条件是：干燥室压力lllPa，加热板温度42. 5°C，降温速率-0. 29°C /min，得到的产物再 与虫草菌丝体和灵芝孢子粉进行混合。
[0016] 本发明超声提取具体为采用料液比为lg : 30-50mL的水浸泡24h后开启超声进 行提取，超声功率100W，提取温度为50-60°C，提取时间为40-60min。本发明微滤采用孔径 0. 2 μπι的陶瓷微滤。本发明超滤采用截留分子量值为5万的聚砜膜。本发明真空冷冻干燥 需要原料厚度为6~10mm。
[0017] 本发明联合使用超声提取，膜分离浓缩，冷冻干燥技术使得多糖提取率大大提高， 功效增加。
[0018] 本发明具有增强抗肿瘤功效的真菌组合物可在制备抗肿瘤的药物中应用。
[0019] 第一步，超声辅助提取法，超声的机械化学作用通过破坏细胞壁和加强细胞内的 传质作用，提高了植物中有机化合物的提取速度。超声波在液体内传播时，液体介质不断 受到压缩和拉伸，在拉力作用下，液体断裂形成暂时的近似真空的空洞，压缩时，这些空洞 就会发生崩溃，出现局部高温以及放电现象，产生空化作用。超声波空化可以从稳态空化 转化成瞬态空化，空化泡瞬间长大破裂，吸收的能量在极短的时间和极小的空间内释放出 来，形成高温高压的环境，同时伴随有一定强度的冲击波和微声流，从而破坏细胞壁结，使 其在瞬间破裂，释放细胞内的有效成分，大大提高了提取率。从植物中得到提取物的过程 中，超声方法比传统方法更有效率。
[0020] 第二步，膜分离浓缩，采用陶瓷膜分离，操作条件是：压力为〇· 25~0· 45MPa，操作 温度为36°C。微滤优选采用孔径0. 2 μ m的陶瓷微滤。
[0021] 所述的超滤采用采用聚砜膜分离，操作条件是：采用截留分子量值为5万的聚砜 膜。压力范围为1. 〇5Mpa~1. 25Mpa，操作温度为20°C~45°C，浓缩倍数为3~6倍。
[0022] 第三步，真空冷冻干燥，采用低温、真空状态下进行，避免了热敏和氧化作用。抑制 细菌繁殖，脱水更彻底，含水量控制在2%~5%。操作条件是：厚度6~10mm干燥室压力 lllPa，加热板温度42. 5°C，降温速率-0. 29°C /min。
[0023] 与传统热水浸提相比，超声提取可以获得更多的水溶性多糖，只用不到一半的时 间，提取率提尚了 25%以上。
[0024] 本发明提取方法不仅提高了多糖的得率，节约了能源，而且还保持低温，显著增加 抗肿瘤功效活性。
[0025] 以下通过具体药效试验例对本发明进行进一步解释说明：
[0026] 一、对动物移植肿瘤Η印s抑制作用
[0027] 1.试验材料
[0028] 1. 1热水浸提真菌组合物
[0029] 制备方法：将药材（药材取用比例与实施例1相同）经粉碎机粉碎，加入90°C以 上热水浸提3h，药材与水重量比例1:10,过滤，滤液收集，滤渣加入100°C热水浸提2h，药材 与水比例1:10,第二次提取的溶液过滤，合并两次滤液，减压浓缩到相对密度为1. 1~1. 2， 将浓缩液喷雾干燥，提取物得率在8~12%。
[0030] 配制方法：称取lg热水浸提真菌组合物，加入40mlCMC-Na中，充分稀释成25mg/ ml均匀液体，给药体积为0. 4ml/20g，即给药剂量为500mg/kg。再将此液按比例稀释成其他 剂量。
[0031] L 2本发明真菌组合物（按照实施例1方法制备得到）
[0032] 配制方法：称取lg本发明真菌组合物，加入40mlCMC_Na中，充分稀释成25mg/ml 均匀液体，给药体积为〇. 4ml/20g，即给药剂量为500mg/kg。再将此液按比例稀释成其他剂 量。
[0033] 1. 3 动物
[0034] 品系：ICR小鼠，清洁级，体重：18_22g，性别：雌性。
[0035] 饲料：颗粒饲料由江苏省协同医药生物工程有限公司责任公司供给。
[0036] 饲养条件：空调房间，温度18_24°C，相对湿度70%。
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