治疗奶牛隐性子宫内膜炎的益生菌组合活菌制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及益生菌菌株唾液乳杆菌 SaJiKariiA?)菌株LWT1和魏斯氏菌Aoreeftsis)菌株LWT20及治疗奶牛隐性子 宫内膜炎的益生菌组合活菌制剂。
【背景技术】
[0002] 奶牛子宫内膜炎是由产后细菌感染引起的一种常见的产科疾病。采用抗生素及化 学药物治疗常导致刺激子宫粘膜出血，细菌耐药性及牛奶污染等问题。中药制剂药方复杂、 操作不便、剂量大、见效慢；中西药复方仍会有抗生素的残留；而激光、针灸、溶菌酶操作繁 琐、见效慢。所以子宫内膜炎的治疗急需新型药物，而微生态制剂在肠道中已经得到广泛性 应用，并且效果显著，但对奶牛子宫内膜炎治疗方面尚处于空白阶段。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是为解决抗生素药物残留、致病菌的耐药性；中药制剂药方复杂、操 作不便、剂量大、见效慢；激光、针灸、溶菌酶操作繁琐、见效慢等问题，因此提供益生菌菌 株唾液乳杆菌（ZacioAaciUiA? SaJiKarii/61 )LWT1 和魏斯氏菌Aoreeftsis) LWT20及治疗牛子宫内膜炎的益生菌组合活菌制剂。
[0004] 唾液乳杆菌菌株LWT1，保藏编号：CGMCC No. 11133。
[0005] 魏斯氏菌菌株LWT20,保藏编号：CGMCC No. 11134。
[0006] 治疗奶牛隐性子宫内膜炎的益生菌组合活菌制剂，它是由保藏编号为CGMCC No. 11133的唾液乳杆菌菌株LWT1和保藏编号为CGMCC No. 11134的魏斯氏菌菌株LWT20组 合成的活菌制剂； 所述的牛为奶牛； 所述的唾液乳杆菌菌株LWT1与魏斯氏菌菌株LWT20的浓度比为1-3:1 ; 所述的唾液乳杆菌菌株LWT1与魏斯氏菌菌株LWT20的浓度比为2:1 ; 所述的活菌制剂为MRS培养基活菌制剂； 所述的活菌制剂终浓度为：1015CFU/mL。
[0007] 本发明提供了唾液乳杆菌菌株LWT1，它的保藏编号为CGMCC No. 11133和魏斯氏 菌菌株LWT20,它的保藏编号为CGMCC No. 11134, 2株益生菌均从健康奶牛阴道内分离获 得，它们在治疗奶牛隐性子宫内膜炎方面均具有良好的疗效，本发明还提供了由唾液乳杆 菌菌株LWT1与魏斯氏菌菌株LWT20用MRS培养基培养的菌液，浓度比为2:1，终浓度为 1015CFU/mL，用于治疗奶牛隐性子宫内膜炎的益生菌组合活菌制剂。唾液乳杆菌菌株LWT1 和魏斯氏菌菌株LWT2经过300次传代，并没有发现变异现象，对抗生素均具有较好的敏感 性，具有良好的稳定性和安全性。并且在4°C保存半年后其抑菌能力没有明显变化，所以该 益生菌组合活菌制剂可以长期保存，该益生菌组合活菌制剂治疗奶牛隐性子宫内膜炎治愈 率达到85%。
【附图说明】
[0008] 图1分离的乳酸菌产酸测定结果图。
【具体实施方式】
[0009] 实施例1菌株来源 1)唾液乳杆菌、魏斯氏菌、嗜酸乳杆菌均从健康奶牛阴道内分离获得，具体方法如下： a从吉林农业大学奶牛场和九台养牛场分别选取30头产后健康奶牛作为样本。用棉拭 子采集健康奶牛阴道内分泌物。采完后立即在无菌条件下放入事先配置好的MRS液体培养 基的试管中，lh内送回实验室并在37 °C下厌氧培养18 - 24小时，完成细菌的富集并取一 部分菌液保存备用。
[0010] b使用MRS选择性培养基对乳酸菌进行分离与纯化，最后对乳酸菌分离株进行保 存。
[0011] 2)筛选与鉴定 通过乳酸菌对致病菌的抑菌试验对乳酸菌分离株进行筛选，此次使用的致病菌指示菌 为金黄色葡萄球菌。具体操作如下： 本试验采用杯碟法对乳酸菌抑制致病菌生长能力进行测试。分别取乳酸菌上清液240 ul加入事先准备好的金黄色葡萄球菌平板上的牛津杯中。将平板放入培养箱中37 °C培养 48 h，每个菌株设置3个重复组，对照组添加等量的灭菌水，培养完后使用游标卡尺分别测 量各个菌株的抑菌环直径大小并做好记录。具体结果如表1所示：
通过乳酸菌对金黄色葡萄球菌的抑菌试验筛选出了 13株具有抑菌能力的乳酸菌分离 株，并通过16 SrDNA测序对乳酸菌分离株进行鉴定，经鉴定乳酸菌分离株分别为唾液乳杆 菌7株、魏斯氏菌5株、嗜酸乳杆菌1株。（具体结果为：LWT1，3, 5, 6, 12, 16, 17为唾液乳杆 菌，LWT18, 19, 20, 111，112为魏斯氏菌，LWT113为嗜酸乳杆菌)。随后对筛选出的13株乳酸 菌进行了对大肠杆菌、沙门氏菌和链球菌的抑菌活性试验，抑菌结果如表1所示。
[0012] 最后通过乳酸菌分离株对4种指示菌的抑菌活力试验，筛选出唾液乳杆菌LWT1、 魏斯氏菌LWT20和嗜酸乳杆菌LWT113进一步研究其益生特性(唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌 LWT20和嗜酸乳杆菌LWT113在其所属的菌种里抑菌能力最强)。
[0013] 实施例2乳酸菌产酸试验 将唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20和嗜酸乳杆菌LWT113接种于已灭菌的MRS液体培 养基中，放入厌氧培养箱中，37 °C厌氧静止培养24 h。每隔2 h，使用酸度计分别测量各试 管中菌液的酸度值。用未接菌的液体培养基做空白对照。最后以时间为横坐标，酸度值为 纵坐标，绘制益生菌的酸度变化曲线。结果见图1。
[0014] 实施例3乳酸菌抗生素敏感性试验 挑取唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20和嗜酸乳杆菌LWT113的单菌落接种于MRS液 体培养基中，37 °C厌氧培养24 h，离心去上清，用生理盐水重新悬浮并调整菌液浓度为 3X106 CFU/mL，使用涂布器在平板上均匀涂布，盖上平皿盖，室温下放置5分钟，用无菌眼 科镊子将抗生素纸片贴于平板上，37 °C厌氧培养18 h。使用游标卡尺测量其抑菌圈的大 小，对抑菌圈不明显的，细菌分布不均的和抑菌圈过大的平板要做补充试验，以做进一步的 验证。药敏试验具体评价标准如表2所示。
[0015] +敏感++中度敏感+++高度敏感R抗性 唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20对万古霉素具有抗性，此外唾液乳杆菌LWT1还对庆 大霉素具有抗性，嗜酸乳杆菌LWT113对所有测试抗生素都具有较好的敏感性。由此可以得 出3株乳酸菌都具有较好的安全性。
[0016] 唾液乳杆菌SaJiKariiAs· )LWT1、魏斯氏菌々areeftsis) LWT20,已于2015年7月17日送于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC)保藏，地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。唾液乳杆 菌（ZacioAaciUiA? SaJiKari?Λ? )LWT1 保藏编号：CGMCC No. Ill33 ;魏斯氏菌 LWT20 保藏编号：CGMCC No. 11134。
[0017] 实施例4唾液乳杆菌、魏斯氏菌、嗜酸乳杆菌对子宫内膜上皮细胞粘附研究 将细胞浓度为2X 105 CFU/mL的细胞悬浮液接种于6孔细胞培养板中培养至长成单层 细胞。然后使用PBS冲洗3次后，每孔中加入1 mL细菌悬液和1 mL新鲜的DMEM/F12不完 全培养液，以无菌PBS缓冲液作为对照，置37 °C、5% C02培养箱中培养90 min。培养完成 后用PBS冲洗单层细胞5次，除去未粘附的细菌。
[0018] 黏附结果： 平均每个子宫内膜上皮细胞黏附的唾液乳杆菌、魏斯氏菌、嗜酸乳杆菌的细菌数分别 为70. 5、34. 1、40. 2,从黏附试验结果中可看到唾液乳杆菌LWT1的黏附能力显著高于嗜酸 乳杆菌。
[0019] 实施例5乳酸菌组合对金黄色葡萄球菌抑菌性能研究 评价1株菌株是否可以作为开发微生态制剂的益生菌使用，其最主要的性能是其对致 病菌的抑菌能力高低，从上表1可以看出，嗜酸乳杆菌LWT113和魏斯氏菌LWT20对4种致 病菌的抑菌能力相近，无显著差异，但唾液乳杆菌LWT1对其余4种致病菌的抑菌能力要远 远高于嗜酸乳杆菌LWT113。本研究的目的是开发一种用于治疗奶牛隐性子宫内膜炎益生菌 组合，所以接下来就益生菌组合对致病菌金黄色葡萄球菌的抑菌能力进行测试，同时本项 研究对每组益生菌组合的比例进行筛选。
[0020] (1)唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20益生菌组合，组合比例为1 :1 ;2 :1 ;1 :2 ;3 : 1;1:3五组不同比例。其抑菌能力结果如下表：
(2) 唾液乳杆菌LWT1、嗜酸乳杆菌LWT113益生菌组合，组合比例为1 :1 ;2 :1 ;1 :2 :3 : 1;1:3五组不同比例。其抑菌能力结果如下表.
(3) 魏斯氏菌LWT20、嗜酸乳杆菌LWT113益生菌组合，组合比例为1 :1 ;2 :1 ;1 :2 ;3 :1 ; 1:3五组不同比例。其抑菌能力结果如下表：
从上述表格可知：当唾液乳杆菌LWT1、魏斯氏菌LWT20组合最佳比例为2:1 ;唾液乳杆 菌LWT1和嗜酸乳杆菌LTW113组合最佳比例为1:1 ;魏斯氏菌LWT20和嗜酸乳杆菌LTW113 组合最佳比例为1:3。然后以唾液乳杆菌LWT1和魏斯氏菌LWT20益生菌2:1组合、唾液乳 杆菌LWT1和嗜酸乳杆菌LTW113益生菌1:1组合、魏斯氏菌LWT20和嗜酸乳杆菌LTW113益 生菌1:3组合对大肠杆菌、链球菌和沙门氏菌进行了抑菌试验(见下表)。