一种用于防控雏禽肠道病原的复合微生态制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及应用微生物技术领域，特别涉及一种用于防控雏禽肠道病原的复合微 生态制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 在当前禽类养殖规模化、集约化发展的过程中，雏禽的健康养殖对养殖的成败有 着关键作用。而雏禽在从种鸡场孵出到进入养殖场这一阶段，体质弱，肠道菌群发育不完 善，抵抗力差，极易感染沙门氏菌、致病性大肠杆菌等病原引起的下痢、脐炎等疾病，导致较 高的死亡率，严重影响养殖效益。当前在养殖实践中，多采用抗生素来防治或治疗雏禽易于 产生的疾病，从雏鸡开口进食即开始给药。然而，雏禽抗生素的滥用，抑制肠道正常菌群的 建立，影响内脏器官和免疫系统的发育，且在随后的养殖中，抗生素药物使用成为常态，最 终禽类产品的药物残留严重。随着禽类绿色、健康养殖成为发展的趋势，养殖中抗生素的使 用受到越来越多的限制，微生态制剂替代抗生素的使用成为国内外研究和应用的热点。
[0003]饲用微生态制剂具有调节动物肠道菌群、抑菌抗病、调节动物免疫、提升动物生长 和生产性能的作用，且无药残、无污染，可作为实现禽类绿色、健康养殖的有效理想途径。针 对雏禽养殖面临的肠道菌群不完善，易感染病原等实际问题，已有一些相关研究利用微生 态制剂进行防控。如中国发明专利ZL201010175469. 0公开了 "复合菌剂及其在幼禽增重 及防治下痢中的应用"，该发明复合了芽孢杆菌属和肠球菌属的多株细菌，用以防治幼畜禽 下痢，促进幼畜禽增重。申请公开的中国发明专利"调整禽畜肠道菌群益生菌微生物菌剂 及其制备方法"，申请公布号：CN103060247A，公开了由产朊假丝酵母、粪链球菌、枯草芽孢 杆菌、纳豆芽孢杆菌、植物乳杆菌和沼泽红假单胞菌构成的菌群，用以调整禽畜肠道菌群结 构，促进有益菌生长并抑制有害菌生长。因此，调节肠道菌群，改善肠道环境，进而产生包括 抑制病原在内的一系列有益功能，将是现有微生态制剂的主要作用模式。然而，其作用需要 一个过程，尤其是在抑制肠道病原方面没有针对性，无法真正满足替代抗生素的要求。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于针对雏禽肠道菌群不完善，易感染沙门氏菌、大肠杆菌引起下 痢等疾病的实际情况，提供一种能有效防控雏禽肠道病原，促进肠道菌群发育的复合微生 态制剂。
[0005]本发明的另一个目的是提供上述适用于防控雏禽肠道病原，促进肠道菌群发育的 复合微生态制剂的制备方法。
[0006]本发明目的通过以下技术方案来实现的： 一种用于防控雏禽肠道病原，促进肠道菌群发育的复合微生态制剂，所述的制 剂包括保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（ChinaGeneral MicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC)，保藏号为 11255 的多粘类芽抱杆 菌BPZ-1和保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心（ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC)，保藏号 为11256的干酪乳杆菌（ZacioAaciUiA?caseiOLCZ-l菌株。两种菌在复合微生态制剂总 质量中的质量百分比分别为：多粘类芽孢杆菌55%~70%，干酪乳杆菌30%~45%。
[0007] 在一个优选的方式中，该菌株通过以下方式获得：于2013年从湖北襄阳、江苏宿 州、浙江嘉兴等地养鸡场获取约15日龄健康雏鸡，宰杀后分离肠道内容物，冷藏后带回实 验室处理。获得的样本分别分为2份，分别用于芽孢类细菌和乳酸类细菌的分离。用于芽 孢类细菌分离的样本，于空平板中，在20 °C-25 °C的室温下放置约1周，随后在60 °C的 烘箱中处理24h。处理后的样本取1g加入装有100ml无菌水的三角瓶中，在30°C的摇 床中培养过夜，静止2h后取上清液lml做梯度稀释，并在肉膏蛋白胨平板中涂布，培养，分 离菌株，最终获得7株芽孢类菌。用于乳酸菌分离的样本，取湿样1g，接入200mLMRS肉 汤培养基中富集培养，一周后取100μL富集液接入新鲜的200mLMRS肉汤培养基中继续 培养，再过一周后采用稀释涂布平板法用加有1 %碳酸钙的MRS琼脂平板分离乳酸菌，共分 离获得可产生透明圈的菌株11株。随后以易引起雏鸡下痢、脐炎的常见病原菌一沙门氏 杆菌、大肠杆菌为指示菌，通过体外抑菌法一牛津杯法，对筛选获得到18株细菌进行体外 拮抗试验，对沙门氏菌有较好抑菌效果的芽孢类菌株共3株，其中1株抑菌圈直径大于6. 8 cm，乳酸菌4株，抑菌圈直径均大于5. 5cm;对大肠杆菌有较好抑菌效果的芽孢类菌株共有 4株，抑菌圈直径均大于6. 0cm，乳酸菌3株，抑菌圈直径均大于5.1cm。随后对获得的菌 株进行进一步筛选，最终获得对沙门氏菌和大肠杆菌均有较好抑制效果的芽孢类菌和乳酸 菌各1株。这两株菌经16SrRNA基因序列分析和生理生化鉴定，确定为多粘类芽孢杆菌 和干酪乳杆菌（ZacioAaciUiA?casei)，分别命名为BPZ-1 和 LCZ-l〇
[0008] 两株菌已于2015年8月20日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心（ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC)，保藏 号：11255和11256,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，邮编 100101。 已有实验证实菌株BPZ-1和LCZ-1在生长过程中具有较强的抑制沙门氏菌和大肠杆菌 生长效果，经液体发酵后发酵液亦具有较强的抑菌活性。
[0009]
[0010] 本发明还提供了该用于防控雏禽肠道病原的复合微生态制剂的制备方法，所述多 粘芽孢杆菌和干酪乳杆菌菌剂的制备方法，分别按以下步骤进行： A.多粘芽孢杆菌菌剂的制备步骤： (1) 各级培养基的配置，其中： 斜面培养基：为牛肉膏蛋白胨固体培养基，备用； 摇瓶菌种培养基和种子罐发酵培养基：为牛肉膏蛋白胨液体培养基，备用； 批量生产培养基：玉米芯粉45~60%，麸皮30~40%，砻糠：5~10%，葡萄糖3%，酵 母膏2%，按料水比1 :0. 8加入水分； (2) 摇瓶菌种扩增：将用斜面培养基活化的多粘芽孢杆菌BPZ-1，在无菌操作下，接入 100mL的摇瓶培养基中，在30°C，160rpm/min的摇床中，培养24h后备用； (3) 种子罐发酵：将步骤（1)种子罐发酵培养基放入种子罐中，在种子罐内进行蒸汽高 温灭菌并冷却后，按接种量5~8%接入步骤（2)的摇瓶菌种；开动搅拌机在转速160rpm/ min，温度30°C，通气量4m3/h，罐压0. 1MPa，自然pH的条件下培养24h后备用； (4) 批量产品的制备：将步骤（1)固体培养基灭菌并冷却，按制备菌剂重量的3~5 %的 比例称取步骤（3)种子罐液体菌种，按菌种与水1 :5的比例放入无菌水中，再接入固体培养 基中并混匀；移入培养室，料厚3. 5~5cm，室温控制在30~35 °C，培养72h后在低于60 °C的条件下烘干、粉碎、装袋，备用，所获多粘芽孢杆菌BPZ-1制剂活菌数量不低于40X10s CFU/g; B.干酪乳杆菌菌剂的制备步骤： (1) 各级培养基的配置，其中： 斜面培养基：为MRS琼脂培养基，备用； 摇瓶菌种培养基和种子罐发酵培养基：MRS肉汤培养基，备用； 批量生产培养基：玉米粉50~60%，豆柏25~35%，麸皮10~15%，CaC03 1~1. 5 %， 物料高温灭菌处理，按料水比1 7加入水分； (2) 摇瓶菌种扩增：分别将用斜面培养基活化的干酪乳杆菌LCZ-1接入100mL的摇瓶 培养基中，在30°C，培养24h后备用； (