1.5L洗脱，再用60% 甲醇1. 5L洗脱，收集60%甲醇洗脱液，减压浓缩、干燥，得高纯度东革阿里提取物6. 4g。
[0031] 含量测定：采用实施例1方法，测得本批次东革阿里提取物样品中主要成分1-5的 含量依次为13β，21-二羟基东革酮（2. 06%)、东革酮（20. 71%)、东革醇苷（9. 15%)、东 革醇（23. 69% )、14,15β-二羟基克莱尼酮（2. 44% )。
[0032] 实施例4 :东革阿里提取物中的化合物分离鉴定
[0033] 选取实施例1中CLQE样品70g，用15%甲醇500ml溶解，上DaisogelRP-18柱 (40-60μm，柱体积4L)中压制备色谱，用15% - 40%甲醇梯度洗脱240min，流速100ml/ min。采用HPLC分析，相同流分合并，得到18个流分（EL1-22)。
[0034] (1)EL8分离纯化：EL8用RP-18中压制备色谱分离，18%甲醇等度洗脱60min;所 得EL8. 1再用硅胶柱层析分离纯化，CH2C12:CH30H(10 : 0至9 : 1)梯度洗脱，得到化合物 l(74mg)，经ES頂S、NMR波谱分析并和文献数据比较，鉴定为13β，21_二羟基东革酮（13β， 21-dihydroxyeurycomanone)〇
[0035] (2)EL10分离纯化：EL10通过S印hadexLH20分离，20 %甲醇洗脱，得到 EL10. 1-10. 7。EL10. 2经重结晶得到化合物2 (612mg)，经ES頂S、NMR波谱分析并和文献数 据比较，鉴定为东革酮（eurycomanone)。EL10.3用硅胶柱层析，012C12:CH30H(10 : 0至 9 : 1)梯度洗脱，得到ELIO. 3 (15mg)，经ES頂S、NMR波谱分析并和文献数据比较，鉴定为 13α，21_ 二氛东革酬（13a，21-Dihydroeurycomanone)〇
[0036] (3)EL12分离纯化：EL12用RP-18中压制备色谱分离，20%甲醇等度洗脱lOOmin， 分别得到EL12. 1-12. 2。EL12. 1反复重结晶，S印hadexLH20纯化得到化合物3 (434mg)， 经ESIMS、NMR波谱分析并和文献数据比较，鉴定为东革醇苷（eurycomanonol-2-Ο-β-D-g lucopyranoside)。EL12·2用硅胶柱层析，CH2Cl2:CH30H(10:0至9:l)梯度洗脱，得到 EL12. 2(12mg)，经ES頂S、NMR波谱分析并和文献数据比较，鉴定为13β，21-二羟基东革醇 (13β，21-Dihydroxyeurycomanol)〇
[0037] (4)EL13分离纯化：EL13用RP-18中压制备色谱分离，20%甲醇等度洗脱130min， 得到EL13. 1，经反复重结晶，S印hadexLH20纯化得到化合物4(1021mg)，经ESIMS、NMR波 谱分析并和文献数据比较，鉴定为东革醇（eurycomanol)。
[0038] (5)EL14分离纯化：EL14用RP-18中压制备色谱分离，20 % -40 %甲醇梯度 400min，得到EL14.1-EL14.12。EL14.4 用硅胶柱层析，CH2C12:CH30H(10 : 0 至9 : 1) 梯度洗脱，分别得到化合物EL14-1 (18mg)、EL14-2 (79mg)。EL14. 5用硅胶柱层析， CH2C12:CH30H(10 : 0 至9 : 1)梯度洗脱，分别得到化合物EL14-3(26mg)、EL14-4(10mg)。 经ES頂S、NMR波谱分析并和文献数据比较，鉴定EL14-1为龙革内酯（Longilactone)， EL14-2 为Δ4'5，14-羟基乐园树醇（A4'5，14-hydroxyglaucarubol)，EL14-3 为Δ4'16， 6α-羟基异东革内酯E(Δ4'16,6a-hydroxy-isoeurycolactoneE，参见HidejiItokawa报 道化合物 4,JNatProduct1993, 56,1766-1771)，EL14-4 为 13β，18-二氢东革醇（13β， 18-dihydroeurycomanol)〇
[0039] (6)EL16分离纯化：EL16用RP-18中压制备色谱分离，27%甲醇等度80min，得到 EL16. 1经S印hadex分离得到化合物5 (303mg)，经ESIMS、NMR波谱分析并和文献数据比较， 鉴定为 14,15β-二羟基克莱尼酮（14,15β-dihydroxyklaineanone)〇
[0040] 其中，化合物1-5的结构见下式，其13C-NMR数据参见表1。
[0041]
[0045] 实验例1 :东革阿里提取物中化合物的体外抗肿瘤作用考察
[0046] 采用MTT法，测试实施例4中分离获得各化合物的抗肿瘤活性；5种人肿瘤细胞 株包括A549人非小细胞肺癌细胞，!fepG2人肝癌细胞，PC3人前列腺癌细胞，SW620人大肠 癌细胞，SK0V-3人卵巢癌细胞，均购于上海中国科学院细胞生物研究所。各化合物均配制 为100、50、25、12. 5、6. 25μg/L。取对数生长期细胞株细胞，用胰酶消化后配制成浓度为 IX105个/mL的细胞悬液，接种于96孔酶标板中，每孔100μ1。48h后加含不同药物及相 应溶媒对照的新鲜培养液，对照组以等体积溶媒替代样品的培养液，空白组加等体积的不 含细胞的培养液，每孔100μ1，每组设5个平行孔。在上述条件下培养24、48、72h，其后每 孔加入5mg/mLMTT10μ1，继续培养l-2h，每孔加50μ1DMS0溶解，于酶标仪上测定0D值， 实验重复3次，取平均值，计算抑制率。
[0047] 抑制率（％ ) = [ (1-样品组0D值/对照组0D值）]X100%
[0048] 结果：采用ΜΤΤ法对实施例4中分离获得的11个化合物进行了抗肿瘤活性筛选， 结果显示含有Α环α，β不饱和烯酮结构的化合物对5种人肿瘤细胞株均有一定程度抑制 作用；化合物 1、2、5 在 72h的IC5。范围依次为 9. 6-28. 7、8· 5-23. 7、2· 9-10. 3ymol/L。结 果提示含有该类有效成分的东革阿里提取物具有抗肿瘤作用。
[0049] 实验例2 :东革阿里提取物的抗炎作用考察
[0050] 选用实施例1东革阿里提取物（ELQE)进行抗炎实验。取20-25g小鼠80只，雌雄 各半，分为ELQE低/中/高剂量组（50、100、200mg/kg)、吲哚美辛对照组（20mg/kg)和模型 组5组，预灌胃给药一周。最后一次灌药2小时后，用二甲苯25微升均匀涂于小鼠右耳，半 小时后处死小鼠，用直径6_打孔器，取小鼠的左右耳相同部位，用分析天平称重。取下的 右耳减去左耳重量为肿胀度，计算对照组和给药组的均值与标准差，t检验比较组间差异显 著性。按下式求出肿胀抑制率：
[0051] 肿胀抑制率（％) = [1-给药组平均肿胀度/模型组平均肿胀度]X100%
[0052] 结果：ELQE中/高剂量（100、200mg/kg)组对二甲苯所致小鼠耳廓急性炎症均有 抑制作用，肿胀抑制率依次为56. . 3、74. 5(% )。
【主权项】
1. 一种东革阿里提取物，特征在于所述东革阿里提取物由以下步骤制备获得： (1) 选取东革阿里根药材，采用水进行提取，提取液合并，得东革阿里提取液； (2) 由（1)所得东革阿里提取液，上大孔树脂柱进行吸附，先用水洗脱，再用20-50%乙 醇洗脱，收集20-50%乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得。2. 根据权利要求1的东革阿里提取物，特征在于所述东革阿里提取物中含有东革酮、 东革醇、东革醇苷、13β，21-二羟基东革酮和14,15β-二羟基克莱尼酮等五种成分。3. 根据权利要求2的东革阿里提取物，特征在于所述东革阿里提取物中东革酮、东革 醇、东革醇苷三种成分含量大于20%。4. 根据权利要求2的东革阿里提取物，特征在于所述东革阿里提取物中13β，21_二羟 基东革酮含量大于1 %，14,15β-二羟基克莱尼酮含量大于1 %。5. 根据权利要求2的东革阿里提取物，特征在于所述东革阿里提取物中含有13α， 21-二氢东革酮、13β，21-二羟基东革醇、龙革内酯、Δ4'5,14-羟基乐园树醇、Δ4'16,6α-羟 基异东革内酯Ε、13β，18-二氢东革醇等六种成分中的任意两种以上。6. 根据权利要求1的东革阿里提取物，特征在于所述步骤（1)中水提取温度为60-100 度，所述步骤（2)中优选用30-40%乙醇洗脱。7. 根据权利要求1的东革阿里提取物，特征在于所述步骤（2)中东革阿里提取物进 一步用10-15%甲醇溶解，上样于反相碳十八柱，依次用10-15%、40-60%甲醇洗脱，收集 40-60%甲醇洗脱液，浓缩，干燥，即得。8. 根据权利要求7的东革阿里提取物，特征在于所述东革阿里提取物中东革阿里酮、 东革阿里醇、东革阿里醇苷三种成分含量大于40 %，13β，21-二羟基东革阿里酮含量大于 2%，14,15β-二羟基克莱尼酮含量大于2%。9. 根据权利要求1-8的东革阿里提取物在制备抗肿瘤药品或保健食品中的应用。10. 根据权利要求1-8的东革阿里提取物在制备抗炎药品或保健食品中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种东哥阿里提取物的制备方法及其用途，所述制备方法包括以下步骤：选取东哥阿里根药材，采用水进行提取，得提取液；提取液上大孔树脂柱，先用水洗脱，再用20-50％乙醇洗脱，收集相应乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得。所述东哥阿里提取物中含有东革酮、东革醇、东革醇苷、13β，21-二羟基东革酮和14，15β-二羟基克莱尼酮等五种主要苦木素类成分，其中东革酮、东革醇、东革醇苷三种成分含量大于20％。本发明所述制备工艺完整保留了东革阿里水提物中的苦木素类有效成分，并具有生产工艺简洁、产品质量可控等显著优点。所述东哥阿里提取物具有优良抗肿瘤、抗炎作用，可应用于制备相关功效的药品或保健食品。
【IPC分类】A61P29/00, A61P35/00, A61K36/185, A23L33/105
【公开号】CN105362315
【申请号】CN201510906420
【发明人】田景奎, 张琳, 李红亮, 韩昊特, 周生海, 刘江云
【申请人】常熟求是科技有限公司
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月7日