用于治疗过度增生性病症的mek抑制剂和erk抑制剂的组合的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明总地设及具有对抗过度增生性病症例如癌症的活性的MEK抑制剂(MEKi)和 ERK抑制剂化RKi)的药物组合。本发明也设及使用使用化合物治疗哺乳动物的方法。
【背景技术】
[0002] RAS/RAF/MEK/E服途径在多于30 %的人类癌症中被活化，最常见的是通过K-ras致 癌基因突变W及通过BRAF突变活化。因此该途径作为癌症的治疗祀点而引起众多关注 (P.J.Roberts and C.J.Der,Oncogene 2007 26:3291-310))。到目前为止直接祀向RAS的 尝试没有成功，但是最近用BRAF和有丝分裂原活化细胞外信号调节激酶(MEK)抑制剂的临 床试验已经表明，祀向运些下游RAS效应分子有潜力治疗含有该途径中的致癌基因突变的 癌症化.T.Flahedy et al.，Curr.Opin.Oncol.2010 22:178-83)。尽管临床反应和抗癌活 性可观，特别是对于BRAF突变型黑色素瘤中的BRAKW制剂，但是多数患者最终发展成临床 耐药的和进行性疾病（Flahe;rty，supra;D.B. Solit and N.Rosen,N.Elngl .J.Med. 2011 364: 772-4)。临床前研究已经确定对BRA巧巧制剂的获得性耐药性的多种机制，包括，在RAF 亚型之间切换（J.Villaneuva et al. ,Cancer Cell 2010 18:683-95)，上调RTK或NRAS信 号（R.化zarian et al. ,NaUire 2010 468:973-7)，W及通过COT活化再激活有丝分裂原活 化有丝分裂原活化(MAPK)信号（C.MJohannessen et al.，化Uire 2010 468:968-72)或通 过MEK激酶活化突变再激活有丝分裂原活化有丝分裂原活化(MAPK)信号(N.Wagle et al.， J. Clin. Oncol. 2011 29:3085-96)。类似地，临床前研究已经确定细胞借W获得对MEK抑制 作用的耐药性不同机制，包括突变BRAF的扩增(R.B.Corcorran et al.，Sci.Signal 2011 3:ra84)，STAT3上调（B.Dai et al. ,Cancer Res.2011 71:3658-68),或可将抑制剂直接结 合于MEK激酶活性处的MEK变构袋(allosteric pocket)中的突变巧.Wang et al. ,Cancer Res.2011 71:5535-45;C.M.血ery et al.,Proc.化t.Acad.Sci.USA 2009 106:20411-6)。 已经描述MEK突变在来自用MEK化mera，上文）或BRAF(Wagle，上文）抑制剂治疗的患者的肿 瘤标本中显示了临床实用性。
[0003] 尽管已经报告了选择性邸K1/2抑制剂且与抑制剂相比其目前用于临床 开发，但是对抗在肥1(下游直接作用的E服1/2的小分子抑制剂的鉴定与开发仍然滞后。
【发明内容】
[0004] 本发明总地设及具有抗癌活性的MEK抑制剂和邸K抑制剂的协同组合，其组合施用 可抑制癌细胞的生长。本发明的组合和方法可用于治疗过度增生性病症例如癌症。组合物 可W抑制哺乳动物的肿瘤生长并且可W用于治疗人类癌症患者。
[000引一方面，本发明包括治疗过度增生性病症的方法，包括:将治疗性组合作为组合制 剂施用于哺乳动物或通过交替方式施用于哺乳动物，其中所述治疗性组合包含治疗有效量 的MEKi化合物和治疗有效量的E服i。在本发明的一方面，E服抑制剂选自（S)-1-( 1-(4-氯- 3-氣苯基）-2-径乙基)-4-(2-((1-甲基-IH-化挫-5-基）氨基）喀晚-4-基）化晚-2( IH)-酬 (1曰，60(：-0994)，4-(3-((乙基二甲基甲娃烷基）甲基)-[1，2,4]^挫并[4,3-曰]化晚-7-基)-N-(l-甲基-IH-化挫-5-基）喀晚-2-胺ab)，（S)-4-(3-(2-(4-氯苯基)-2-甲氧基乙基)-[1， 2,4]S 挫并[4,3-b]化嗦-7-基)-N-(l-甲基-IH-化挫-5-基)喀晚-2-胺（Ic)或(S)-N-(l-甲 基-IH-化挫-5-基）-4-(3-(2-甲基下基）-[l，2,3]S挫并[l，5-a]化晚-6-基）喀晚-2-胺 (Id) ;MEK抑制剂是CObimetiniKII ,GDC-0973)或5-((2-氣-4-舰苯基）氨基)-N-(2-^基乙 氧基）咪挫并[l，5-a]化晚-6-甲酯胺（IIa，GDC-0623)。在本发明的另一方面，MEK抑制剂是 (II)，E服抑制剂为GDC-0994(Ia)。
[0007] 本发明的另一方面提供治疗由RAS/RAF/MEK/E服激酶调节的过度增生性疾病或病 症的方法，包括：向需要治疗的哺乳动物施用有效量的式Ia-Id化合物和式II或IIa化合物。 可W将式Ia-Id化合物和式II或IIa化合物共配制W作为药物组合物组合施用，或者可W将 它们作为治疗性组合W交替方式单独(先后)施用。
[0008] 本发明的另一方面提供治疗过度增生性病症的方法，包括：向需要治疗的哺乳动 物施用有效量的式Ia-Id化合物、式II(GDC-0973)或IIa化合物和另一种化疗剂。
[0009] 本发明的另一方面包括制造制品或试剂盒，其包括式Ia-Id化合物和式（GDC-0973)或IIa化合物，容器，和任选的指示治疗的药品说明书或标签。
[0010] 本发明的另一方面包括确定可组合地用于治疗癌症的化合物的方法，包括:a)将 MEKi和ERKi的治疗性组合施用于具有Kras突变的体外肿瘤细胞系，和b)测量协同或非协同 效应。
【附图说明】
[00川图1显示当如下给药时A549非小细胞肺癌(NS化C)细胞的细胞增殖:单独给药GDC-0994、化、Ic或Id和GDC-0973,或者将GDC-0994、Ib、Ic或Id与GDC-0973组合使用实施例6的 方案给药。用所指定最大药物浓度用3倍倍比稀释系列培养细胞。通过使用 CeIITiter-GIo猶试验(CTG)确定细胞活力。
[001引图2显示当如下给药时A549非小细胞肺癌(NSCLC)细胞的细胞增殖和调亡程度:单 独给药 GDC-0994、Ib、Ic 或 Id 和 GDC-0973,或者将 GDC-0994、Ib、Ic 或 Id 与 GDC-0973 组合给 药。使用化加试验来确定细胞增殖。使用nucELISA试验来测量调亡。
[0013] 图3显示用单独或组合形式的组合1邸和6服抑制剂进行治疗的药效学结果。抑制 了邸K介导的RSK的憐酸化。细胞周期进程显著减慢，证据是细胞周期蛋白Dl减少W及p27增 加。提高的细胞死亡(调亡）的证据是剪切的PARP含量增加。
[0014] 图4 Bliss超过量表面(Bliss excess surface)，其描述了通过用指定浓度的每 种药物处理384孔板中细胞4她确定的在异步指数增长的A549细胞中抑制DNA合成。对于最 后化的处理中，用5-乙烘基-2/-脱氧尿巧巧加)处理IuM细胞W标记新合成的DM。然后通过 将2%多聚甲醒和0.02%化iton X-IOO添加到培养基中保持30分钟将细胞固定和透性化， 然后根据厂商操作守则(Xife Technologies ,Eugene, OR)用Alexa-Fluor 635叠氮化物对 结合的EdU进行巧光标记，并用化echst 33342复染DNA。
[0015] 巧光显微镜图像使用化rkin Elmer Opera高容量成像系统获得。使用Acapella图 像分析软件确定EdU-标记的细胞相对于细胞总数的分数。
[0016] 为确定药物治疗之间可能存在的相互作用，将针对每对浓度观察到的响应与针对 两种不相互作用的药剂基于Bliss加和模型（Fa+b = Fa+Fb-Fa冲b，其中化和即是药剂a和b的 部分效应)的预测响应进行比较。观察到的和预测的部分效应之差称为Bliss超过量。
[0017] 图5用MEKi(GDC-0973)和E服i(GDC-0994)抑制剂的组合处理NS化C细胞。测试的 19/29细胞系显示使用邸K+MEK的一定组合效应。所有非-Q61H Kras突变细胞系显示对该组 合的一定灵敏性。在板上的两个化af突变细胞系中没有观察到组合效应。
[0018] 图6显示在带有NCI-H2122非小细胞肺癌(NSCLC)移植瘤的hconic雌nu/nu(裸)小 鼠中，平均肿瘤体积变化与时间的关系图，其中对所述小鼠每日给药W下物质:MCT媒介物 (￥6111。16)(0.5%甲基纤维素/0.2%1'讯661180)，60111邑/4邑式1曰(60(：-0994)和5111邑/4邑式11 (GDC-0973K图5a);或每日给药60mg/kg式Ia(GDC-0994)和每S天给药一次(Q3D，即，间歇 给药）15mg/kg式II(GDC-0973)(图加）。用口服管饲法对小鼠给药。药效学标记物支持了 W 下事实：细胞生长减少（图6c和6d)，证据是周期的Dl和Ki67含量降低（图6e); W及调亡增 加，证据是在肥122KRAS NSCLC异种移植法6中切割的半脫天冬酶3增多。
[0019] 图7显示在带有NCI-H2122非小细胞肺癌（NSCLC)移植瘤的hconic雌nu/nu(裸）小 鼠中，平均肿瘤体积变化与时间的关系图，其中对所述小鼠每日给药W下物质:MCT媒介物 (0.5% 甲基纤维素/0.2%Tween 80)，100mg/kg GDC-0994和 5mg/kg GDC-0973(图 7a);每日 给药lOOmg/kg GDC-0994和4mg/kg GDC-0973(图7b);或每日给药lOOmg/kg GDC-0994和每 S天给药一次(Q3D，即，间歇给药)15mg/kg GDC-0973 (图7c)。用口服管饲法对小鼠给药。
[0020] 图8显示在带有A549非小细胞肺癌(NSCLC)移植瘤的化conic雌nu/nu(裸)小鼠中， 平均肿瘤体积变化与时间的关系图，其中对所述小鼠每日给药W下物质:MCT媒介物(0.5% 甲基纤维素/0.2 % Tween 80)，60mg/kg式GDC-0994和5mg/kg GDC-0973(图5a);或每日给药 60mg/kg式GDC-0994和每S天给药一次(Q3D，即，间歇给药）15mg/kg GDC-0973 (图化）。用口 服管饲法对小鼠给药。
[0021] 图9显示根据肿瘤生长抑制表示的在HCT 116结肠直肠癌细胞系剂量范围组合药 效研究中GDC-0994和GDC-0973的药效总结。灰色细胞代表对于耐药体系的最好药效。黑色 细胞是不耐药的。用口服管饲法(PO)每日（QD)给药。
[0022] 图10描述了在膜腺导管腺癌（PDAC)的KRAS突变GEM模型中CObimetinib和GDC-0994 的稳健 的抗肿 瘤活性
[0023] 荷瘤Kras突变GEM模型用W下物质治疗：媒介物，GDC-0973 (5mg/kg，PO，W)，GDC-0994(60mg/kg,PO，QD)或GDC-0973和GDC-0994的组合。图10a显示了瀑布图，其描述了在 PDA对莫型中在用W下物质进行7天治疗之后基于超声成像的相对于基线的百分比肿瘤体积 变化（第0天，第7天）：媒介物（黑色，n = 8)，cobimetinib(绿色，n = 8)，GDC-0994(蓝色，n = 8)和组合（红色，n = 9)。图10b示出PDAC模型经过W下治疗队列（treatment coho;rts)的总 体生存率的Kaplan-Meier曲线图：媒介物（黑色，n= 13)，吉西他滨（澄色，n= 10)，IIb(绿 色，n = 9)，GDC-0994(蓝色，n = 8)，W及GDC-0994和GDC-0973的组合（红色，n = 13)。经过 log-rank检验，组合治疗相对于媒介物(**p<0.0001)和吉西他滨(*p = 0.0159)具有显著 性。
[0024] 图Ila由于增强的MAPK途径抑制作用，KRASGi2D，pi6/19FL/FL PDX-CRE-衍生细胞系 在GDC-0973、GDC-0994 W及GDC-0994和GDC-0973的组合存在下的生存力。图1 Ib在GDC-0973、GDC-0994W及GDC-0994和GDC-0973的组合存在下，KRASGl2D，pl6/19FL/FLpDX-CRE-衍 生细胞系中的PD标记物。
[002引图12用在开发的GDC-0994和多种MEK抑制剂的组合观察到的细胞生长活性。
[0026] 图13评价对DNA合成的协同抑制作用。将指数增长的HCT116 (A，B)和A549 (C，D)细 胞用指定浓度的GDC-0994和GDC-0973处理47小时，然后添加5-乙烘基-2^-脱氧尿巧化加） 并保持60分钟，然后进行多聚甲醒固定W及用Alexa Fluor 647叠氮化物化ife Technologies ,Madison WI)对含E加的DNA进行标记。Hoechst 33542-标记的细胞核的总数 W及E加-标记的细胞核的分数由自动巧光显微镜测定，使用Perkin Elmer Opera仪器和 Acape Ila软件进行图像分析。
[0027] A，C等效线图。由两种药物的不同组合达到对DNA合成相等抑制作用的点所连成的 线。粗虚线对角线显示预期的50%抑制作用等效线，如果根据Loewe模型化合物组合显示简 单的加和作用（N.Geaiy，Unders1:andingsynergy .Am. J.Physiol .Endocrinol .Me 1:ab. 2012. doi:10.1152/a化endo.00308.2012)。
[002引 B，D剂量矩阵(Dose matrix)协同分析，显示为I:对于E加-阳性细胞相对于DMSO- 处理的对照的分数所观测到的百分比变化，2:基于适用于单一药剂剂量响应曲线的Loewe 加和模型的药物组合的预测效果，3:观测数据和预测加和效果之间的差。小于0的数值表示 与对添加药物所预测的相比，较大的对DNA合成抑制作用。
[0029] 使用Genedata ScreeneHGenedata AG, Basel)的化合物协同作用扩展模块 (Compound Synergy Extension module)分析数据。
【具体实施方式】
[0030]
[0031] ^^"包括"、"包含"当用于说明书和权利要求时意在指定存在所述特征、整数、组 分、或步骤，但是它们不排除存在或添加一种或多种其它特征、整数、组分、步骤、或其集合。
[0032] 术语"治疗(treat)"和"治疗(treatment)"是指治疗性处置，其中目的是预防或减 缓(减轻)不期望的生理学变化或病症如癌症的发展或扩散。出于本发明的目的，有益的或 期望的临床结果包括但不限于缓解症状、减小疾病程度、稳定（即不恶化)病症、延迟或减缓 疾病进展、改善或缓和疾病状态W及好转(部分好转或完全好转），无论运些结果是可检测 的还是不可检测的。"治疗（treatment)"还可表示与未接受治疗的预期存活相比延长的存 活。需要治疗的对象包括已经患有所述病状或病症的对象，例如癌症患者。
[0033] "抑制"是指与参照相比，降低或减少活性、功能、和/或量。
[0034] 短语"治疗有效量"表示(i)预防或治疗本申请描述的具体疾病、病症或病症的量， (ii)削弱、改善或消除本申请描述的具体疾病、病症或病症的一种或多种症状的量，或 (iii)预防或延迟本申请描述的具体疾病、病症或病症的一种或多种症状的发作的量。在癌 症的情况下，治疗有效量可降低癌细胞数目；减小肿瘤尺寸;抑制（即在一定程度上减慢W 及优选停止)癌细胞渗入周围器官中；抑制（即在一定程度上减慢W及优选停止)肿瘤转移； 在一定程度上抑制肿瘤生长;和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。如果 组合一定程度上可预防生长和/或杀死现有癌细胞，则其可W是细胞生长抑制性的 (切tostatic)和/或细胞毒性的。对于癌症治疗而言，可例如通过评价疾病进展时间（TTP) 和/或确定应答率(RR)来测量功效。
[0035] 除了对于给定的过度增生性病症提供改善的治疗之外，施用本发明的某些组合可 W改善患者的生命质量，与相同患者接受不同治疗所经历的生命质量相比。例如，向患者施 用组合可W提供改善的生命质量，与相同患者若仅接受一种单独药剂进行治疗所要经历的 生命质量相比。例如，使用本申请所述组合进行组合治疗法可W减少治疗药剂的所需剂量。 组合治疗法也可W减少或消除对使用化疗剂的需求W及高剂量化疗剂所带来的副作用(例 如恶屯、，呕吐，脱发，皮疹，食欲降低，体重下降等）。该组合也可W促使减轻肿瘤负荷W及有 关的不良事件，例如疼痛，器官功能不全，体重下降等。因此，本发明的一方面提供治疗用途 的组合，其用于改善用本申请所述药剂治疗其过度增生性病症的患者的生命质量。
[0036] 术语"癌症"和"癌的"设及或