组。二十周时，低剂量DEN麻油组小鼠肝脏可见细胞坏死，炎细胞浸润及脂肪化，但未发现有肿瘤结节形成。而nano-DEN组全部存活的16只小鼠中有4只肉眼可见肿瘤结节，有2只小鼠虽未见肉眼肿瘤结节，但镜下可见肿瘤结节，肝癌发生率为37.5%。表明DEN经纳米化后对肝脏产生更为严重的损伤。Nano-DEN有望作为建立原发性肝癌更好的诱导剂。
[0039]为了实现第一个目的，本发明采用了如下技术措施:
[0040]选用昆明KM小鼠预饲养适应环境一周后，随机均分为3组，每组16只小鼠:正常组，常规自由饮水;DEN水溶组，每天按体重给予16.5mg/kg(即2.5ml.lOg—1)的DEN水溶液，且每天以普通过滤水补充不足;经口高剂量组，每天按体重经口给予16.5mg/kg(即4μ1.lOg"1)的DEN麻油溶液(麻油的作用是引诱剂，小鼠对麻油的味道极为敏感，与橄榄油、鱼油或其它油溶液相比，小鼠最喜食麻油，麻油的香味掩盖了DEN的刺激性气味)。研究优化小鼠原发性肝癌模型的建立方法，改善传统化学诱导肝癌模型的个体差异大、顺应性差的问题。
[0041 ]为了实现第二个目的，本发明采用了如下技术措施:
[0042]选用昆明KM小鼠预饲养适应环境一周后，随机均分为4组，每组16只小鼠:正常组，常规自由饮水;经口高剂量7次组，按体重经口给予16.5mg/kg( S卩4μ1.10g—O的DEN麻油溶液(7次/周)；经口高剂量3次组，按体重经口给予16.5mg/kg(S卩4μ1.10g—1)的DEN麻油溶液(3次/周)；经口高剂量I次组，按体重经口给予16.5mg/kg(BP4μ1.10g—1)的DEN麻油溶液(I次/周)。研究优化小鼠原发性肝癌模型的建立方法，改善传统化学诱导肝癌模型的死亡率高的问题。
[0043]为了实现第三个目的，本发明采用了如下技术措施:
[0044]选用昆明KM小鼠预饲养适应环境一周后，随机均分为4组，每组16只小鼠:正常组，常规自由饮水;经口低剂量I次组，按体重经口给予8.25mg/kg(即4μ1.10g—O的DEN麻油溶液(I次/周)；纳米载体组，按体重经口给予8.25mg/kg(即4μ1.10g—工)的纳米载体(I次/周)；纳米化DEN组，按体重经口给予8.25mg/kg(即4μ1.10g—1)的纳米化DEN( I次/周)。研究优化小鼠原发性肝癌模型的建立方法，改善传统化学诱导肝癌模型的实验周期长的问题。
[0045]本发明采用实验室广泛使用的昆明KM小鼠，以DEN为诱癌剂，通过经口给药，20周时成功建立了小鼠原发性肝癌模型，并克服了 DEN水溶造模的缺陷。由于诱导肝癌是通过小剂量长时间的刺激肝脏癌变，一般实验时间需要18-30周，而将DEN纳米化后，能增强DEN对肝脏的损伤作用，因此nano-DEN有望能在更短时间内建立原发性肝癌动物模型。
[0046]实施例1经口给予DEN麻油溶液优化的小鼠原发性肝癌模型建立方法
[0047]动物:受试SPF级昆明KM雄性小鼠48只(由湖北省实验动物研究中心提供)，体重18-22g，自由饮水饮食，饲养间室温保持在25±1°C，明暗周期为12小时。
[0048]诱癌剂的配制:
[0049](I )DEN水溶液:取347.5μ1 (即330mg)的DEN原液，加至5000ml无菌蒸馏水中，即66μg.ml—1的DEN水溶液；
[0050](2)高剂量DEN麻油溶液:取0.5ml(即470mg)的DEN原液加至10.894ml麻油中，SP41.25mg.ml—1 的DEN麻油溶液。
[0051 ]可根据该方式制备不同含量的DEN麻油溶液。
[0052]1、原发性肝癌模型的建立
[0053]选用昆明KM小鼠预饲养适应环境一周后，随机均分为3组，每组16只小鼠:正常组，常规自由饮水;DEN水溶组，每天按体重给予16.5mg/kg(即2.5ml.lOg—1)的DEN水溶液，且每天以普通过滤水补充不足;经口高剂量组，每天按体重经口给予16.5mg/kg(即4μ1.lOg"1)的DEN麻油溶液。连续造模20周后，各组剩余小鼠脱白处死，打开腹腔，取肝脏。
[0054]2、小鼠行为学及肝脏大体观
[0055]每天观察小鼠精神状态，饮食状况，被毛变化，并每周称重，记录每组小鼠死亡数；造模20周后，观察各组剩余小鼠肝脏的形态、颜色、质地和肝表面肉眼可见的癌结节数;计算小鼠存活率及肝癌发生率，存活率=每组存活的小鼠数/各组小鼠总数X 100% ;肝癌发生率=每组发生肝癌的小鼠数/各组小鼠总数X 100%。
[0056]3、实验结果
[0057]正常组小鼠活泼好动、反应灵活、皮毛光泽，其余各组小鼠均出现不同程度毛色枯燥、发黄、无光泽、行动迟缓。DEN水溶组及高剂量DEN麻油组小鼠体重均明显低于正常组小鼠。各组体重变化，见图1A以及图1B，其中，NG:正常组;NVG:纳米载体组;DWG: DEN水溶组；HD07G:高剂量DEN麻油每周7次组;HD03G:高剂量DEN麻油每周3次组;HDOlG:高剂量DEN麻油每周I次组;LDOlG:低剂量DEN麻油每周I次组;NDlG:纳米DEN每周I次组。与正常组比较，
P〈0.001。从图中可以看出，DEN水溶组及高剂量DEN麻油组小鼠体重均明显低于正常组小鼠。小鼠的死亡率详见图2所示，其中，NG:正常组;NVG:纳米载体组;DffG: DEN水溶组;HD07G:高剂量DEN麻油每周7次组;HD03G:高剂量DEN麻油每周3次组;HDOlG:高剂量DEN麻油每周I次组；LD01G:低剂量DEN麻油每周I次组；ND1G:纳米DEN每周I次组。与正常组比较，***Ρ〈
0.001。造模过程中，正常组未出现小鼠死亡，未发现原发性肝癌的发生，见图3(&)。20周时，DEN水溶组小鼠的死亡率为75%，存活4只小鼠均有肉眼可见肿瘤结节，见图3(c)，肝癌发生率为25%。高剂量DEN麻油(7次/周)组小鼠死亡率为75%，存活4只小鼠均有肉眼可见肿瘤结节，见图3(d)，肝癌发生率为25%。各组死亡小鼠大体检查则见其肝脏肿大、颜色偏黄，部分可见边缘发黑，未见肿瘤发生。
[0058]实施例2不同频率地经口给予DEN麻油溶液诱导的小鼠原发性肝癌模型比较
[0059]动物:受试SPF级昆明KM雄性小鼠64只(由湖北省实验动物研究中心提供)，体重18-22g，自由饮水饮食，饲养间室温保持在25±1°C，明暗周期为12小时。
[0060]诱癌剂的配制:取0.5mI (即470mg)的DEN原液加至10.894ml麻油中，即41.25mg.ml—1的DEN麻油溶液。
[0061]1、原发性肝癌模型的建立
[0062]选用昆明KM小鼠预饲养适应环境一周后，随机均分为4组，每组16只小鼠:正常组，常规自由饮水;经口高剂量7次组，按体重经口给予16.5mg/kg( S卩4μ1.10g—O的DEN麻油溶液(7次/周)；经口高剂量3次组，按体重经口给予16.5mg/kg(S卩4μ1.10g—1)的DEN麻油溶液(3次/周)；经口高剂量I次组，每天按体重经口给予16.5mg/kg( S卩4μ1.10g—O的DEN麻油溶液(I次/周)。连续造模20周后，各组剩余小鼠脱白处死，打开腹腔，取肝脏。
[0063]2、小鼠行为学及肝脏大体观
[0064]每天观察小鼠精神状态，饮食状况，被毛变化，并每周称重，记录每组小鼠死亡数；造模20周后，观察各组剩余小鼠肝脏的形态、颜色、质地和肝表面肉眼可见的癌结节数;计算小鼠存活率，存活率=每组存活的小鼠数/各组小鼠总数X 100%;肝癌发生率=每组发生肝癌的小鼠数/各组小鼠总数X 100%。
[0065]3、实验结果
[0066]正常组小鼠活泼好动、反应灵活、皮毛光泽，其余各组小鼠均出现不同程度毛色枯燥、发黄、无光泽、行动迟缓，且随着给药频率和给药剂量的增加，小鼠症状加重。高剂量DEN麻油组小鼠体重均明显低于正常组小鼠。各组体重变化，见图1。小鼠的死亡率详见图2所示。造模过程中，正常组未出现小鼠死亡，未发现原发性肝癌的发生，见图3(a)。20周时，高剂量DEN麻油(7次/周)组小鼠死亡率为75%，存活4只小鼠均有肉眼可见肿瘤结节，见图3(d)，肝癌发生率为25% ο高剂量DEN麻油(3次/周)组小鼠的死亡率为37.5%,存活10只小鼠中有5只肉眼可见肿瘤结节，见图3(e)，有I只小鼠虽未见肉眼肿瘤结节，但镜下可见肿瘤结节，肝癌发生率为37.5%。高剂量DEN麻油(I次/周)组小鼠的死亡率为25%，存活12只小鼠中有5只肉眼可见肿瘤结节，见图3(f)，肝癌发生率为31.25%。各组死亡小鼠大体检查则见其肝脏肿大、颜色偏黄，部分可见边缘发黑，未见肿瘤发生。
[0067]实施例3经口给予纳米化DEN麻油溶液优化的小鼠原发性肝癌模型建立方法
[0068]动物:受试SPF级昆明KM雄性小鼠64只(由湖北省实验动物研究中心提供)，体重18-22g，自由饮水饮食，饲养间室温保持在25±1°C，明暗周期为12小时。
[0069]诱癌剂的配制:
[0070](I)低剂量DEN麻油溶液:取0.25ml (即235mg)的DEN原液加至11.144ml麻油中，即20.625mg.ml—1 的DEN麻油溶液；
[0071 ] (2) Nano-DEN及纳米载体:将DEN以及蛋黄卵磷脂溶于麻油中制备得到油相，DEN的终浓度是10.97%￥/￥，蛋黄卵磷脂的终浓度是6%1/￥。将1^的11 80以及甘油溶于超纯水中制备得到水相，Tween 80的终浓度是1.25 % V/V，甘油的终浓度是2.81 % V/V。在60°C恒温水浴的条件下，将油相滴入水相中，在1200r/min的条件下搅拌15min，油相与水相的体积比是1: 4。在1000rpm的条件下高剪切2miη，最终得到粒径是100nm-200nm的乳化颗粒，在100bar的条件下高压均质5次即得到纳米化的DEN油溶液(nano-DEN)，nano-DEN中DEN的终浓度是20.625m