肝脏诱癌剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种肝脏诱癌剂、肝脏诱癌剂的制备方法以及基于肝脏诱癌剂建立原发性肝癌模型的方法。
【背景技术】
[0002]原发性肝癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，在我国其发病率和死亡率均为世界首位，是严重危害健康的重大疾病(The management of hepatocellular carcinoma inA s i a:A guideline combining quantitative and qualitativeevaluat1n.B1sciTrends，2010,6:283-287)。遗憾的是其发生机制尚未完全阐明。因此，深入研究肝癌的发病机制，寻找防治肝癌的有效手段，可更好地服务于人类健康(Adecade’s studies on metastasis of hepatocellular carcinoma.J Cancer Res ClinOncol,2004,130:187-196)o
[0003]要研究肝癌的发生机制，首先要建立与人类肝癌自然发生过程相似的动物模型。常见的肝癌动物模型有:自发性肝癌模型、移植型肝癌模型、转基因肝癌模型以及化学诱发性肝癌模型。自发性肝癌由于发生情况不均，很难在短时间内获得大量类似的肿瘤学材料，且观察时间长，实验耗费较大，故在实际科研工作中较少使用。移植性肝癌模型操作繁杂，成功率依赖于技术的成熟性，因此较难获得;转基因动物肝癌模型制作技术要求极高，价格昂贵，国内开展的尚较少;化学诱发性肝癌模型操作简便，成本低，且能较好的模拟人类肝癌的自然病理过程，制作方法简单，是最常用的建模方法之一(肝癌动物模型的研究进展。世界华人消化杂志，2011,19:1275-1278)。化学诱发型肝癌模型最经典方法的是将二乙基亚硝胺(DEN)溶于水中，给予小鼠自由饮用(Chemoprevent1n by Lipid-soluble TeaPolyphenols in DiethyInitrosamine/Phenobarbital-1nduced Hepatic Pre-cancerLes1n.Anticancer Res ,2014,34:683-693)，这样的缺陷在于给药剂量很难控制，小鼠顺应性差，个体差异大，死亡率高。
[0004]随着纳米技术的快速发展，纳米材料因其具有靶向定位、缓释控释药物、载药量高、提高药物吸收率等优点而在药物传输、癌症治疗、基因治疗等领域得到广泛应用(Codelivery of doxorubicin and curcumin with lipid nanoparticles results inimproved efficacy of chemotherapy in liver cancer.1nternat1nal Journal ofNanomedicine,2015,10:257-270)，但是利用其负面生物效应，在疾病造模领域的应用尚未见报道。
【发明内容】
[0005]为了解决【背景技术】中所存在的技术问题，本发明进而提供了一种稳定性强、耗时短以及致死率低的肝脏诱癌剂、肝脏诱癌剂的制备方法以及基于肝脏诱癌剂建立原发性肝癌模型的方法。
[0006]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0007]一种肝脏诱癌剂，其特征在于:所述肝脏诱癌剂是二乙基亚硝胺(DEN)非水溶液。
[0008]作为优选，本发明所提供的肝脏诱癌剂是DEN油溶液。
[0009]作为优选，本发明所提供的肝脏诱癌剂是DEN麻油溶液。
[0010]作为优选，本发明所提供的肝脏诱癌剂是纳米化的DEN油溶液。
[0011]作为优选，本发明所提供的纳米化的DEN油溶液中的DEN的含量不低于20.625mg.ml—1O
[0012]作为优选，本发明所提供的纳米化的DEN油溶液中的DEN的含量是20.625mg.ml—1-41.25mg/ml—、
[0013]—种用于制备如上所述的肝脏诱癌剂的方法，其特征在于:所述方法包括以下步骤:
[0014]I)将DEN以及蛋黄卵磷脂溶于麻油中，制备得到油相;所述DEN的终浓度是10.97%V/V-21.94%V/V;所述蛋黄卵磷脂的终浓度是6%W/V;
[0015]2)将Tween 80以及甘油溶于超纯水中，制备得到水相;所述Tween 80的终浓度是1.25 % V/V;所述甘油的终浓度是2.81 % V/V;
[0016]3)在60°C恒温水浴的条件下，将步骤I)制备得到的油相滴入步骤2)制备得到的水相中，在1200r/min的条件下搅拌15miη;所述油相与水相的体积比是1:4;
[0017]4)在1000rpm的条件下高剪切2min，最终得到粒径是100nm-200nm的乳化颗粒；
[0018]5)在100bar的条件下高压均质5次即得到纳米化的DEN油溶液。
[0019]—种基于如上所述的肝脏诱癌剂的建立原发性肝癌模型的方法，其特征在于:所述方法包括以下步骤:
[0020]I)选用6-8周龄SPF级雄性昆明KM小鼠，体重18_22g，饲养适应环境I周；
[0021]2)每周按雄性昆明KM小鼠的体重经口给予前述的肝脏诱癌剂，连续造模20周，建立小鼠原发性肝癌模型；
[0022]3)模型鉴定。
[0023]作为优选，当步骤2)中采用肝脏诱癌剂是DEN麻油溶液时，所述步骤2)中按雄性昆明KM小鼠的体重经口给予如前所述的肝脏诱癌剂的给药剂量是16.5mg/kg;给药频率是每周I次、3次或7次。
[0024]作为优选，当步骤2)中采用的肝脏诱癌剂是纳米化的DEN油溶液时，所述步骤2)中按雄性昆明KM小鼠的体重经口给予如前所述的肝脏诱癌剂的给药剂量是8.25mg/kg;给药频率是每周I次。
[0025]与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果:
[0026]本发明涉及一种肝脏诱癌剂、制备方法以及基于肝脏诱癌剂的建立小鼠原发性肝癌模型的方法，选用6-8周龄SPF级雄性KM小鼠，每周按体重经口给予诱癌剂DEN，连续造模20周，建立小鼠原发性肝癌模型。本发明通过改变DEN剂型及给药频率，成功建立小鼠原发性肝癌模型，该模型具有模型制作成功率高、造模过程中动物死亡率低，高剂量DEN麻油(I次/周)组小鼠的死亡率为25%，存活12只小鼠中有5只肉眼可见肿瘤结节，肝癌发生率为31.25% ;光镜下观察发现，DEN水溶及高剂量DEN麻油组小鼠，明显可见具有被膜形成的结节灶，细胞排列结构紊乱，大小、形态各异，染色质明显增粗，胞质丰富，可见病理性核分裂像，分化较差的肝细胞内可见巨核，表明细胞异型性明显;低剂量DEN麻油组出现肝细胞变性坏死、炎细胞浸润、大量空泡脂肪变性，而DEN纳米微乳组则明显可见具有被膜形成的结节灶，细胞大小、形态不一，细胞核形态不规则，可见瘤巨细胞，核分裂像明显。本方法简单易行，造模实验周期短，可建立理想的肝癌动物模型；将DEN纳米化后，能增强DEN对肝脏的损伤作用，提供了一种更短时间内建立原发性肝癌动物模型的理论基础。本发明通过将DEN溶于麻油经口给药增加了小鼠服药的顺应性，克服了 DEN水溶造模小鼠之间的个体差异;在二十周时，DEN水溶组及经口高剂量组小鼠肉眼均可见肿瘤结节，但I次/周经口给药组小鼠死亡率最低，即长期低频给药能大大降低造模过程中的死亡率。使用DEN油溶液建立原发性肝癌模型具有以下优势:①稳定性强;②操作简方便;③动物顺应性增加，死亡率降低。基于目前纳米技术的发展，本发明采用纳米化DEN长期低频给药。研究发现，与较低剂量DEN油溶液给药对照，利用纳米制剂靶向和缓释的原理使纳米化的DEN对肝脏的损伤增强。
【附图说明】
[0027]图1A为造模过程中在第O、5、1、15、20周时各组小鼠体重变化示意图；
[0028]图1B是造模过程中第20周时各组小鼠体重变化示意图；
[0029]图2为实施例1_3中诱癌过程中小鼠死亡率不意图；
[0030]图3为实施例1-3中二十周时各组小鼠肝脏肉眼观照片；
[0031]图4为实施例4中二十周时各组小鼠肝脏组织病理学观照片。
【具体实施方式】
[0032]下面将结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明。应理解，以下内容不应以任何方式对本发明的保护范围加以限制。
[0033]针对上述常用的肝癌动物模型建立中的稳定性差、耗时长、死亡率高等问题，本发明的第一个目的在于提供了一种建立小鼠原发性肝癌模型的优化方法。
[0034]本发明的第二个目的在于提供了长期低频诱导原发性肝癌模型的方法，改善传统化学诱导肝癌模型的死亡率高等问题。
[0035]本发明的第三个目的在于提供了纳米化DEN(nano-DEN)作为一种更好的原发性肝癌诱导剂的理论基础。
[0036]本发明的发明构思如下:
[0037]化学诱导型肝癌模型是研究肝癌最好的模型之一，DEN是迄今应用最广泛的一种化学诱导型肝癌模型制剂(Molecular pathology of early stage chemically inducedhepatocaricinogenes.Pathol Int，2009，59:605-622)。并且亚硝胺类化合物普遍存在于谷物、牛奶、干酪、烟酒、熏肉、烤肉、海鱼、罐装食品以及饮水中(食物中N-亚硝基化合物与肿瘤关系的研究进展.中华肿瘤防治杂志，2008，15:151-155)。传统造模方法将DEN溶于水中，给予小鼠自由饮用，但是往往实验周期比较长，个体差异大，且死亡率高(化学性药物诱发肝癌模型的研究进展.医学研究杂志，2009,38:12-14)。实验过程中，由于多种条件的限制，尤其是实践方面，死亡率方面的制约，亟需优化出更好、更快的造模方法。
[0038]为了更好地模拟人们可能因长期接触环境中有毒、有害化学物质，以及长期服用肝毒性药物造成肝脏损伤甚至肝癌的情况，本实验设立了低剂量DEN麻油组及nano-DEN