裸处软骨3mm X 3mm组织，置于10 %福尔马林溶液中固定；
[0039] 1.5病理学检查
[0040] 软骨组织制作蜡块、切片，经梯度酒精、二甲苯脱水、透明，进行皿染色和甲苯胺蓝 染色，采用骨关节炎评分法对软骨标本进行评分；
[0041] 1.5统计学分析
[0042] 采用SPSS 17.0进行统计分析;计量资料W均数±标准差表示，两组间比较采用t 检验。
[00创 2.结果
[0044] 2.1 -般状态
[0045] 与正常对照组相比，造模动物出现精神不振，活动量及饮食减少，1周~10天后精 神、活动量及饮食逐渐恢复正常；1只动物造模次日出现左后肢明显肿胀，拆卸石膏后重新 石膏固定;全部动物在造模早期未出现明显哨咬现象，均未破坏石膏固定的完整性和有效 性；
[0046] 2.2影像学特点
[0047] 正常对照组关节表面光滑，无骨寶形成，关节间隙正常;单纯OA模型组可见表面模 糊，有骨寶形成，关节间隙狭窄（图2);KelIgren-Lawrence分级对照组全部为0级，OA组n级 3例，虹级5例(表1);
[004引表1兔膝关节X线Ke Ilgren-Lawrence分级
[0化日]2.3大体形态学特点
[0051] 正常对照组无明显关节积液及滑膜增生，关节软骨面光滑，色泽明亮（图3a)"0A组 造模关节出现关节积液、滑膜增厚。软骨改变集中在股骨内侧裸关节面，软骨表面粗糖不 平，颜色灰黄，部分开始出现软骨糜烂、甚至有溃瘍发生（图2b)。膝关节大体评分对照组均 为0分，OA组3例为1分，3例为2分(表2)。
[0052] 表2兔膝关节大体形态学评分
[0化4] 2.4病理学特点
[0055] 正常对照组膝关节软骨切片显示关节面平整，潮线完好，细胞形态正常、排列整 齐，基质均匀（图4a)D〇A组4例呈现2级（图46，如），3例呈现3级（图4(1，图46)表现，1例出现4 级表现（图4f)。正常对照组Mankin病理评分为0分，OA组Mankin病理评分为7.43± 1.20分， 明显高于正常对照组，差异有统计学意义，P<〇. 05。
[0056] 兔OA模型制作方法有多种，最常使用的有关节腔注射法(如瓜蛋白酶注射法）、手 术方法(如膝关节半月板切除和化Ith法)和本发明中采用的机械制动法等。伸直位固定法 是机械制动法的一种，其原理是过伸位固定限制了膝关节的活动，肌肉和关节囊的收缩，对 关节面造成过度压力而引起关节损伤。此造模方法，具有一定的优势和劣势。其优势在于避 免了手术方法和关节腔注射方法制作兔OA对关节内环境的破坏，制作过程更加接近人OA的 自然发展过程，具有简便易于操作、耗材少、家兔适用性好等优点。其劣势在于制作模型过 程中石膏下端哨隧现象非常严重，导致石膏固定不牢甚至脱落。维持膝关节的持续伸直位 是制作兔OA模型的关键因素，石膏的固定不牢或脱落会降低模型的成功率。
[0057] 为避免上述情况的发生，本发明中对伸直位固定法进行改良，造模成功率达到 100%。具体方法是于石膏干硬前在石膏外W环绕方式缠 W细铁丝，铁丝圈间距3~5mm。运 一改良措施有效的减少了兔的哨隧现象和石膏的脱落，维持膝关节持续处于伸直位状态， 增加了模型制作的稳定性和成功率。多数研究未提及此方法的制作成功率，本发明的成功 率为100%，模型制作方法的改良可能是保证成功率100%的重要因素。
[0058] 人OA是一个退行性疾病，其临床特点是影像学可见关节间隙变窄、软骨下骨硬化 和(或)囊性变、关节缘骨寶形成，病理学特点为软骨基质的丢失和软骨细胞的退化。本发明 采用伸直位固定法制作兔OA模型，从影像学、大体形态学及病理学等方面对OA进行了鉴定 及评估，结果证实此方法制作的兔OA特点均符合人膝OA的特点。1、影像学改变:兔OA模型中 X线检查发现了与人OA类似的病变，骨寶形成、关节间隙狭窄，从影像学上证实兔OA模型的 制备成功。2、大体形态学:兔OA模型软骨呈现灰黄色，表面粗糖不平甚至可见局部糜烂，证 实了 OA软骨的破坏。3、软骨基质丢失:软骨采用甲苯胺蓝染色可出现基质异染性，主要是由 于硫酸软骨素的存在，而实验中OA软骨出现明显的失染现象，提示硫酸软骨素的丢失，运与 人OA软骨基质的丢失相符。4、软骨细胞退化:实验中兔OA软骨细胞变形，排列素乱，潮线中 断或消失，均提示软骨细胞的退化，符合人OA的特点。5、软骨细胞调亡:软骨细胞调亡是OA 发病机制中的重要环节，运一理论目前被大多数学者所接受。实验中发现，正常软骨亦存在 有少量的调亡软骨细胞，而OA软骨细胞的调亡比例明显增加，多位于表层及中层，与人OA软 骨细胞的调亡相似。
[0059] 综上所述，采用改良伸直位固定法7周可成功制作兔OA模型，其影像学及病理学特 点与人OA相似，是研究OA的理想模型，也是研究软骨细胞调亡及OA防治的重要手段。
[0060] W上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用W限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型的方法，其特征在于，该改良伸直位固 定法制作兔骨关节炎模型的方法石膏干硬前在石膏外以环绕方式缠以细铁丝，铁丝圈间距 3 ~5mm; 具体包括:适应性喂养1周后，将兔毛剪短至0.5cm，左后肢膝关节完全屈曲，用管型石 膏固定于过屈位，长度从髋关节远端2cm至踝关节上缘2cm，石膏干硬前在石膏外以环绕方 式缠以细铁丝，铁丝圈间距3~5mm，待石膏干硬后，再将兔放回兔笼，造模过程中观察家兔 状态、双腿活动情况、造模肢体改变，发现有肢端明显肿胀、张力性水泡或溃烂感染及石膏 松脱、咬损严重现象，则卸掉重打，固定7周成模。2. 如权利要求1所述的改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型的方法，其特征在于，该 改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型的方法还包括:影像学检查，于第7周末行左膝关节 正位片DR摄影;具体方法:OA组提前拆卸石膏；拍摄时以黑色布袋套住动物头部，将左下肢 伸直后安抚动物，快速进行DR摄影;按X线Kel lgren-Lawrence分级标准进行分级。3. 如权利要求1所述的改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型的方法，其特征在于，该 改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型的方法还包括:取材； 于DR摄影后处死全部动物;处死及取材方法：3%戊巴比妥钠按30mg/kg耳缘静脉注射 麻醉动物，打开左膝关节腔，切断交叉韧带，肉眼观察并记录关节软骨整体变化情况，并观 察股骨内髁、股骨外髁，并进行分级。4. 如权利要求1所述的改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型的方法，其特征在于，该 改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型的方法还包括:病理学检查软骨组织制作蜡块、切 片，经梯度酒精、二甲苯脱水、透明，进行HE染色和甲苯胺蓝染色，采用Mankin骨关节炎评分 法对软骨标本进行评分。
【专利摘要】本发明公开了一种改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型的方法，石膏干硬前在石膏外以环绕方式缠以细铁丝，铁丝圈间距3～5mm；具体包括：适应性喂养1周后将兔毛剪短至0.5cm，左后肢膝关节完全屈曲，用管型石膏固定于过屈位，长度从髋关节远端2cm至踝关节上缘2cm，石膏干硬前在石膏外以环绕方式缠以细铁丝，铁丝圈间距3～5mm，待石膏干硬后，再将兔放回兔笼，造模过程中观察家兔状态、双腿活动情况、造模肢体改变，发现有肢端明显肿胀、张力性水泡或溃烂感染及石膏松脱、咬损严重现象，则立即卸掉重打，固定7周成模。本发明的方法简单，操作方便，提高了制作兔骨关节炎模型的效率。
【IPC分类】A61K49/00, A61D3/00
【公开号】CN105662634
【申请号】CN201610025035
【发明人】刘洪彦, 郑毅
【申请人】首都医科大学附属北京朝阳医院
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年1月15日