4] (7)Blocking solution: I XBuffer = 1:9 的比例配制 Incubation solution，充 分混匀；
[0615] (8)将样品 2. 4 μ 1 与 57. 6 μ I incubation solution 充分混匀，取 50 μ 1 即 10 μ g 加入到96孔板中，单独加入50 μ I incubation solution作为对照，尽量避免气泡产生，上 样速度要快；
[0616] (9)在室温下孵育2h;
[0617] (10)配制 Buffer solution，将 20X 的 buffer 稀释成为 I Xbuffer 工作液，配 制 Activity solution，即 Activity buffer 8.3ml，DCPIP 83μ1，Succinate 167μ1 和 Ubiquinone 2μ 1 充分混匀；
[0618] (11)将在室温下静置的96孔板翻转过来，去除全部液体；
[0619] (12)每孔加入300 μ I buffer，洗三遍，每次都要倒净全部液体；
[0620] (13)各孔加入40 μ 1的lipid solution,避免产生气泡，室温下孵育30min ;
[0621] (14)不倒掉液体，直接各孔加入200 μ 1的Activity solution,避免产生气泡；
[0622] (14)设置多功能酶标仪的程序，如下：
[0623] Temperature 28 °C Start kinetic 60 miη,丨、丨丨j 1? I mm Read 600.聰 End kinetic
[0624] (15)保存数据，统计分析：
[0625] Rate(mOD/min) = (Absorbance 1-Absorbance 2)/Time(min)
[0626] 5. 7. 19.大鼠肝组织Complex IV活性的测定
[0627] (I)取出-80°C保存的全蛋白，放于冰上，室温下融化，19倍稀释Tube I为 Solution 1 ；
[0628] (2)按照定量结果，将所有样品用Solution 1稀释到5. 5mg/ml，终体积为80 μ 1 稀释之后混匀；
[0629] (3)在已经稀释到5. 5mg/ml的EP管中加入8 μ 1的10Χ detergent,充分混匀，此 时样品的浓度为5mg/ml ;
[0630] (4)将样品放在冰上孵育30min ;
[0631] (5)离心，离心时一定要配平，转速为14000rpm，离心时间为20min，取上清；
[0632] (6)将样品15 μ 1与285 μ I Solution 1充分混匀，取200 μ 1即50 μ g加入到96 孔板中，单独加入200μ1 Solution 1作对照，尽量避免气泡产生，上样速度要快；
[0633] (7)在室温下孵育3h ;
[0634] (8)配制 Assay Solution，即 Reagent C 333 μ 1，Solution 16. 67ml 充分混匀；
[0635] (9)将在室温下静置的96孔板翻转过来，去除全部液体；
[0636] (10)每孔加入300 μ I Solution 1，洗三遍，每次都要倒净全部液体；
[0637] (11)各孔加入 200 μ 1 的 Assay Solution ;
[0638] (12)设置多功能酶标仪的程序，如下：
[0639] Temperature 30 6C Slarl kinetic 120 min, I川隔 I min Read 550 nm End kixietie
[0640] (15)保存数据，统计分析：
[0641] Rate(mOD/min) = (Absorbance 1-Absorbance 2)/Time(min)
[0642] 5. 7. 20.大鼠肝组织Complex V活性的测定
[0643] (I)取出-80°C保存的全蛋白，放于冰上，室温下融化，19倍稀释TUBE I为 SOLUTION 1 ；
[0644] (2)按照定量结果，将所有样品用SOLUTION IPBS稀释到5. 5mg/ml，终体积为 80 μ 1稀释之后混勾；
[0645] (3)在已经稀释到5. 5mg/ml的EP管中加入8 μ 1的IOX detergent,充分混匀，此 时样品的浓度为5mg/ml ;
[0646] (4)将样品放在冰上孵育30min ;
[0647] (5)离心，离心时一定要配平，转速为14000rpm，离心时间为20min，取上清；
[0648] (8)将样品 4. 8 μ 1 与 55. 2 μ I incubation solution 充分混匀，取 50 μ 1 即 20 μ g 加入到96孔板中，单独加入50 μ I SOLUTION 1作对照，尽量避免气泡产生，上样速度要快；
[0649] (9)在室温下孵育3h ;
[0650] (10)将在室温下静置的96孔板翻转过来，去除全部液体；
[0651] (12)每孔加入300 μ I SOLUTION 1，洗三遍，每次都要倒净全部液体；
[0652] (13)各孔加入40 μ 1的LIPID MIX，避免产生气泡，室温下孵育45min ;
[0653] (14)不倒掉液体，直接各孔加入200 μ 1的REAGENT MIX，避免产生气泡；
[0654] (14)设置多功能酶标仪的程序，如下：
[0655] Tcmpcraiurc 30 uC Start kinetic 120 min：, 001? I min Read 34() nm End kinetic
[0656] (15)保存数据，统计分析：
[0657] Rate(mOD/min) = (Absorbance 1-Absorbance 2)/Time(min)
[0658] 5. 7. 21·大鼠肝组织NAD+/NADH的测定
[0659] (I)再灌注120min后，取灌流后的肝组织迅速用滤纸吸干表面的水滴，放入冻存 管，拧紧盖子后放入液氮，30min后从液氮中取出冻存管，放入-80°C保存；
[0660] (2)将存放于-80°C冰箱中的肝脏组织取出，放在冰上，使组织在冰上解冻，将大 概200mg组织用剪子剪碎，放在锡纸中包好；
[0661] (3)将组织用锡纸包好后，做好组别标记，投入液氮中，时间不可过短，大约 20min ；
[0662] (4)将组织从液氮中取出，砸碎，将粉碎的组织在没有融化之前转移到离心管中， 称重,取约 20 mg组织，用 PBS 洗后，加入 400 μ I NADH/NAD Extraction Buffer ;
[0663] (5)将超声仪的功率调节到AMP 40%，进行超声3次，每次超声5s，中间间隔15s ;
[0664] (6)离心，离心时一定要配平，转速为14000rpm，离心时间为5min，取上清，此为 NADt样品；
[0665] (7)打开水浴锅，设定为60°C，达到温度后，取200 μ 1(6)中的样品，60°C水浴 30min ；
[0666] (8)将样品迅速放置冰上，并不断旋转，避免沉淀产生，此为NADH样品；
[0667] (9)按照要求准备 NADH 标准品，NAD Cycling Enzyme Mix，NADH Developer，NAD Cycling Mix ；
[0668] (10)按照设计的顺序加入50 μ I标准品，NADt样品及NADH样品；
[0669] (11)每孔加入100 μ I NAD Cycling Mix，充分混匀，室温反应5min，使NAD转化 为熟DH ;
[0670] (12)每孔加入10 μ I NADH Developer，室温反应l-4h，在OD值为450nm处读数， 读数除以蛋白浓度；
[0671] (13)[NADt] = (Corrected absorbance-y-intercept)/Slope
[0672] [NADH] = (Corrected absorbance-y-intercept)/Slope
[0673] NAD/NADH = (NADt-NADH)/NADH
[0674] 5. 8蛋白质印迹分析
[0675] 5. 8. I.肝组织全蛋白的提取
[0676] (1)再灌注120min后，取灌流后的肝组织迅速用滤纸吸干表面的水滴，放入冻存 管，拧紧盖子后放入液氮，30min后从液氮中取出冻存管，放入-80°C保存；
[0677] (2)将存放于-80°C冰箱中的肝脏组织取出，放在冰上，使组织在冰上解冻，将大 概200mg组织用剪子剪碎，放在锡纸中包好；
[0678] (3)将组织用锡纸包好后，做好组别标记，投入液氮中，时间不可过短，大约 20min ；
[0679] (4)在组织在液氮中的这段时间中，配制溶液的裂解液，10XRIPA裂解液按照 1:100加入Cocktail蛋白酶抑制剂；
[0680] (5)将组织从液氮中取出，砸碎，将粉碎的组织在没有融化之前转移到离心管中， 称重；
[0681] (6)按照Ig组织中加入20ml的裂解液，放置在冰上，进行充分裂解；
[0682] (7)称取0· 0174g的DMSF，溶解于Iml的异丙醇中，混匀；
[0683] (8)按照Ig组织中加入100 μ 1的DMSF，并进行超声；
[0684] (9)将超声仪的功率调节到AMP 40%，进行超声5次，每次超声8s，中间间隔15s ;
[0685] (10)离心，离心时一定要配平，转速为13000rpm,离心时间为30min ;
[0686] (11)取上清10 μ 1用来蛋白定量；取上清100 μ 1，分装多份-80°c保存；取上清 1〇〇μ 1，加入5X上样缓冲液25μ 1，在沸水中煮沸20min。放入-80°C保存。
[0687] 5. 8. 2.肝组织膜蛋白和浆蛋白的提取
[0688] (1)用胞核-胞浆-胞膜制备试剂盒分组分提取组织蛋白；
[0689] (2)再灌注120min后，取灌流后的肝组织迅速用滤纸吸干表面的水滴，放入冻存 管，拧紧盖子后放入液氮，30min后从液氮中取出冻存管，放入-80°C保存；
[0690] (3)将存放于-80°C冰箱中的肝脏组织取出，放在冰上，使组织在冰上解冻，将大 概200mg组织用剪子剪碎，放在锡纸中包好；
[0691] (4)将组织用锡纸包好后，做好组别标记，投入液氮中，时间不可过短，大约 20min ；
[0692] (5)将组织从液氮中取出，砸碎，将粉碎的组织在没有融化之前转移到离心管中， 称重；
[0693] (6)加入I. 6ml CER试剂，按照1:100加入Cocktail蛋白酶抑制剂；
[0694] (7)将超声仪的功率调节到AMP 40%，进行超声5次，每次超声8s，中间间隔15s ;
[0695] (8)离心，离心时一定要配平，转速为800g，离心时间为5min，离心后取上清，丢弃 沉淀；
[0696] (9)估计上清液体积，立即加入1/10积量的MER与上清液混合，冰浴5min ;
[0697] (10) 4°C离心，用最大转速 13000rpm，离心 30min ;
[0698] (11)取出上清液转移到新的EP管中，此为胞浆组分；
[0699] (12)沉淀为胞膜组分，含细胞膜和细胞内质膜的混合物。再次瞬时离心除尽液 体；
[0700] (13)沉淀中加入与MER相同体积的Suspension Buffer重悬细膜，混匀；
[0701 ] (14)取浆蛋白100 μ 1，加入5 X上样缓冲液25 μ 1，根据膜蛋白的量加入1/4体积 的5Χ上样缓冲液，在沸水中煮沸20min，放入-80°C保存。
[0702] (15)取浆蛋白进行蛋白定量。
[0703] 5. 8. 3.肝组织核蛋白和浆蛋白的提取
[0704] (1)用NE-PER核浆蛋白制备试剂盒分组分提取组织蛋白；
[0705] (2)再灌注120min后，取灌流后的肝组织迅速用滤纸吸干表面的水滴，放入冻存 管，拧紧盖子后放入液氮，30min后从液氮中取出冻存管，放入-80°C保存；
[0706] (3)将存放于-80°C冰箱中的肝脏组织取出，放在冰上，使组织在冰上解冻，将大 概200mg组织用剪子剪碎，放在锡纸中包好；
[0707] (4)将组织用锡纸包好后，做好组别标记，投入液氮中，时间不可过短，大约 20min ；
[0708] (5)将组织从液氮中取出，砸碎，将粉碎的组织在没有融化之前转移到离心管中， 称重；
[0709] (6)加入2ml CER I试剂，按照1:100加入Cocktail蛋白酶抑制剂；
[0710] (7)将超声仪的功率调节到AMP 40%，进行超声5次，每次超声8s，中间间隔15s ;
[0711] (8) Vortex 混匀 15s，冰上放置 IOmin ;
[0712] (9)加入 CER II，CER I /CER II = 100X2 μ 1/5. 5 μ 1，Vortex 混匀 5s，冰上放置 Imin ；
[0713] (IO)Vortex 混匀 5s，4°C离心，16000g，5min ;
[0714] (11)取上清，上清为浆蛋白；
[0715] (12)将沉淀加入 NER，CER I :NER = 2 :1 ;
[0716] (13)Vortex 混匀 15s，共 4 次，每次间隔 IOmin ;
[0717] (14)4°C 离心，16000g，10min，取上清，为核蛋白；
[0718] (15)取浆蛋白100 μ 1，加入5X上样缓冲液25 μ 1，根据膜蛋白的量加入1/4体积 的5Χ上样缓冲液，在沸水中煮沸20min，放入-80°C保存。
[0719] 5. 8. 4.蛋白浓度的测定
[0720] (1)称取BSA加入三蒸水中，完全溶解成2. 0mg/ml的蛋白标准品，用三蒸水稀释为 I. 0mg/ml>0. 5mg/ml>0. 25mg/ml>0. 125mg/ml ；
[0721] (2)稀释样品，心脏组织一般稀释20倍，终体积为100μ 1，即5μ I的样品中加入 95 μ 1的三蒸水；
[0722] (3)按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B (50:1)配制适量BCA工作液，充分 混匀；
[0723] (4)在各个样品的管中都加入200μ 1的蛋白定量液，混匀，放入37°C温箱中 20min,打开酶标仪预热；
[0724] (5) 96孔板的各孔加入200 μ 1孵育后的溶液；
[0725] (6)在酶标仪560nm处测定。根据标准曲线计算出蛋白浓度。
[0726] 5. 8. 3.免疫共沉淀
[0727] (1)再灌注120min后，取灌流后的肝组织迅速用滤纸吸干表面的水滴，放入冻存 管，拧紧盖子后放入液氮，30min后从液氮中取出冻存管，放入-80°C保存；
[0728] (2)将存放于-80°C冰箱中的肝脏组织取出，放在冰上，使组织在冰上解冻，将大 概200mg组织用剪子剪碎，放在锡纸中包好；
[0729] (3)将组织用锡纸包好后，做好组别标记，投入液氮中，时间不可过短，大约 20min ；
[0730] (4)在组织在液氮中的这段时间中，配制溶液的裂解液，10XRIPA裂解液按照 1:100加入Cocktail蛋白酶抑制剂，1:10加入丁酸钠；
[0731] (5)将组织从液氮中取出，砸碎，将粉碎的组织在没有融化之前转移到离心管中， 称重；
[0732] (6)按照Ig组织中加入20ml的裂解液，放置在冰上，进行充分裂解；
[0733] (7)将超声仪的功率调节到AMP 40%，进行超声5次，每次超声8s，中间间隔15s ;
[0734] (8)离心，离心时一定要配平，转速为13000rpm,离心时间为30min ;
[0735] (9)取上清10 μ 1用来蛋白定量；取上清根据蛋白定量的结果，分装蛋白lmg，并用 之前的裂解液10倍稀释，分装稀释多份_80°C保存；每个样品分装250 μ g，分装多份，-80°C 保存；
[0736] (10)取出四组分装样品包括各个组别，各Img及各250 μ g :在Img的各组中加入 抗体SDHA，NDUFA9,或MnSOD 2 μ 1，将各250 μ g的四个样品混合，然后加入5 μ I IgG，充分 混匀后放入4°C摇床，并不时拿出样品，迅速Vortex后放回摇床；
[0737] (11)准备珠子：取适量Protein A，放入15ml离心管中，加入IOml左右三蒸水，轻 轻混匀后放入4°C，过夜；
[0738] (12)洗Protein A :将（11)中的离心管4°C离心，lOOOrpm，Imin,吸出三蒸水，加 入11111?83，离心，1000印111，11^11，吸出？83，加入11111?83，重复三次，最后一次吸出？83后， 估计Protein A的体积，加入等量PBS，混匀后放入4°C备用；
[0739] (13)在（11)中的样品中各加入20μ 1或30μ 1的处理过的Protein A，充分混匀 后，放入4°C摇床2h。注意，取Protein A之前，需将Protein A与PBS充分混匀；
[0740] (14)配裂解液，配方同（4);配IX上样缓冲液；打开电磁炉煮水至沸腾；
[0741] (15)将（11)中的样品4°C离心，1000rpm，lmin，轻轻吸掉上清，各加750μ 1的裂 解液,4°C离心，lOOOrpm，lmin，轻轻吸掉上清，再重复两次，最后一次一定要吸干净液体；
[0742] (16)沉淀加入50 μ I IX上样缓冲液，Vortex Imin,沸水中煮5min ;
[0743] (17)4°C离心，12000rpm，15min后备用上样，注意配胶同普通免疫印迹实验，上样 品时注意：一块胶用来做目的蛋白，各取15μ 1混有IX上样缓冲液的样品，一块胶用来做 乙酰化，各取35 μ 1混有I X上样缓冲液的样品，按顺序加入样品，吸取液体时要吸上清，不 要吸沉淀。之后的操作同普通免疫印迹实验，进行电泳，转膜，封闭，加一抗，加二抗，曝光， 洗片子，扫描，统计。
[0744] 5. 8. 5.制胶及上样
[0745] (1)配制8%、10%、12% SDS-PAGE分离胶，混匀后注入边条厚度为I. 5mm的两块 洁净玻璃板间，注意不要有气泡，其上加一薄层异丙醇，室温下静置至凝聚；
[0746] (2)待分离胶完全聚合后，吸干异丙醇层，并用三蒸水洗干净异丙醇层，灌入5 % 浓缩胶，插入加样梳，室温下静置。待胶完全凝固后，拔出梳子，用电泳缓冲液冲洗加样孔数 次；
[0747] (3)安装好电泳槽，灌注电泳缓冲液，将处理好的样品按照预定的顺序加入加样孔 中。
[0748] 5. 8. 6.电泳、转膜及染色
[0749] (1)接通凝胶电泳仪的电源，初始电压80V ;
[0750] (2)溴酚蓝染料的前缘进入分离胶上缘后提高电压至120V，继续电泳直至溴酚蓝 泳出分离胶的下缘；
[0751] (3)电泳结束后，取下PAGE胶浸泡于转移缓冲液中；
[0752] (4)取与胶同样大小的PVDF膜行甲醇活化，连同滤纸和海绵浸泡于转移缓冲液中 10分钟以上待用；
[0753] (5)用夹心法在塑料夹板中依次把海绵、三层滤纸、PVDF膜、凝胶、三层滤纸和海 绵放好，赶净各层之间的气泡；
[0754] (6)将塑料夹板放入电转槽，以凝胶靠近负极，PVDF膜靠近正极，最后用碎冰覆 盖电转槽，200mA恒流转膜2-3小时；
[0755] (7)将PVDF膜浸泡于丽春红染液中，振摇染色10分钟；
[0756] (8)蛋白质条带出现后，用去离子水冲洗PVDF膜上的丽春红底色；
[0757] (9)按照蛋白Marker估计目的蛋白的大概位置，剪取相应部位的PVDF膜。
[0758] 5. 8. 7.免疫检测
[0759] (1)将PVDF膜置于封闭液中，室温下轻摇1小时；
[0760] (2)将PVDF膜封入塑料袋中，加入由封闭液稀释的一抗，去除所有的气泡，4°C摇 动过夜；
[0761] (3)以 TBST 洗膜，10 分钟 X 3 次；
[0762] (4)将PVDF膜封入塑料袋中，加入由封闭液稀释的碱性磷酸酶标记的相应二抗， 去除所有的气泡，室温摇动1-1. 5小时；
[0763] (5)以 TBST 洗膜，15 分钟 X 3 次。
[0764] 5. 8. 7.化学发光与曝光
[0765] (1)将化学发光试剂盒ECL(普利莱，北京，中国）中的两种试剂各取1ml，按1:1 的比例混合，将膜在纸上轻点，以部分去除TBST，将配好的ECL滴到膜的正面及反面，在暗 室中摇动膜，使液体混匀，孵育3分钟；
[0766] (2)将所有条带，放入普利莱避光片盒中曝光，放入2-3张胶片，压紧盖子；(3) 取出胶片，带有显色条带的X光片进行扫描，使用KODAK曝光系统（KODAK Medical X-Ray Processor)进行检测。每个条带的相对强度通过其对应的β-actin进行归一化，并用用 图像分析软件Bio -Rad Quantity One software (Bio-Rad, California, USA)进行半定量分 析，统计以β-actin的值为基础值，所用结果为三次重复实验的结果。
[0767] 5. 9表面等离子共振
[0768] 5. 9. 1.溶液配制
[0769] (1)缓冲液（IL)
[0770] 表21. SPR缓冲液配制
[0771] 名称 ：质量/体积 终浓度 HEPES 2.383 g 0.01 M NaCi 8.7664 g 0.15 M EDTA.2Na L000 g 3 niM Surlactani ?20 500 μL 0,005%
[0772]
[0773] 用三蒸水定容到1L，滴定pH值到7. 4,溶液配好之后用0. 2 μ m的滤膜过滤到无菌 的干净瓶子中；
[0774] (2)乙酸钠
[0775] 用三蒸水配制IOmM的乙酸钠溶液，用冰醋酸配制不同pH(4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、 7. 0)的乙酸钠溶液；
[0776] (3)乙醇胺
[0777] 配制IM乙醇胺溶液，HCl滴定到pH = 8. 0。
[0778] 5. 9. 2.实验步骤
[0779] (1)将 CM5 芯片放入表面等离子共振仪 BIAcore T200 (GE Healthcare, Buckingha mshire, United Kingdom)中；
[0780] (2)实验开始之前要检查管子是不是堵住了，全部的通道都选中，在Injection之 后会出现一个上升的曲线，Injection和与上升起始点之间的延迟大概在Is左右,如果管 道堵住了，延迟的时间就会延长；
[0781] ⑶测试适合pH值的Buffer,打开软件之后选择Run Sensor快捷键，等基线稳定 之后，将Sirt3蛋白用pH 4. 0的Buffer稀释，1 μ 1溶于100 μ 1的Buffer。选择Injection 大概5 μ 1，流速为10 μ 1/min ;
[0782] (4)将 Sirt3 蛋白用 pH 4· 5 的 Buffer 稀释，1 μ 1 溶于 100 μ 1 的 Buffer。选择 Injection 大概 5 μ 1，流速为 10 μ 1/min ;
[0783] (5)将 Sirt3 蛋白用 pH 5· 0 的 Buffer 稀释，I μ I 溶于 100 μ I 的 Buffer。选择 Injection大概5 μ 1，流速为10 μ 1/min。Injection之后观察，要求：
[0784] 1)曲线上去又下来；
[0785] 2)曲线上升的值最高；
[0786] 3)在上升值一样高的情况下选择pH值较大得buffer ;选择pH 4.