咖啡酸在制备治疗肝微循环障碍和肝损伤药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种药物新用途，特别涉及咖啡酸在制备治疗肝微循环障碍和肝损伤 药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 肝缺血再灌注损伤：肝脏移植、肝部分切除手术、处理严重的肝脏外伤时，都需要 暂时性阻断肝血流，重新恢复血液供应后，可造成肝的缺血再灌注损伤。
[0003] 良好的血液循环是组织细胞获得充足的氧供和营养物质并排出代谢产物的根本 保证。各种原因造成组织器官血液灌流量减少时发生缺血性损伤，而恢复血液灌流后，细胞 功能代谢及结构破坏反而加重，这种缺血组织或器官重获血流灌注或氧供后对组织和器官 所产生的损伤作用称为缺血-再灌注损伤（ischemia reperfusion injury)。肝脏移植、肝 部分切除手术、处理严重的肝脏外伤时，都需要暂时性阻断肝血流，重新恢复血液供应后， 可造成肝的缺血再灌注损伤（hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI)。肝缺血再 灌注时，肝脏组织细胞发生一系列代谢、结构和功能的损伤，会引起肝微循环及肝损伤，甚 至导致肝功能衰竭，是影响疾病预后、手术成败和病人存活的主要因素之一。
[0004] 肝脏缺血再灌注的起始靶点之一是微循环的损害，内皮损伤破坏了微循环完整 性，导致血流减少，这种紊乱反过来又启动肝继发性缺血性损伤。在肝脏缺血再灌注过程 中肝窦内皮细胞（SEC)和巨噬细胞产生大量强效血管收缩物质，如ET-1，与肝星形细胞表 面的内皮素受体结合使肝窦区收缩导致微循环障碍。
[0005] 肝脏缺血再灌注还能够引起肝细胞线粒体呼吸链的异常，导致ATP产生减少和过 氧化物产生增多，还可引起细胞内NADPH氧化酶亚基P41和P47的膜转位，活化NADPH氧化 酶，产生过氧化物。ATP含量降低可以导致肝细胞内细胞骨架断裂，过氧化物产生增多可诱 导细胞凋亡，可活化细胞内多种信号途径，如FN κ B信号传导途径，诱导促炎性因子的产生 和细胞粘附分子的表达，促炎性因子的产生进一步诱导肝损伤，细胞粘附分子的表达可诱 导白细胞粘附于肝窦、肝中心静脉，影响肝的微循环，加重肝损伤。缺血再灌注引起的肝脏 微循环障碍和肝细胞损伤腹部外科手术，肝手术、肝移植后经常发生的肝损伤，但是目前 缺少有效的治疗方法。
[0006] 咖啡酸（Caffeic acid，CA)是丹参的水溶性有效成分之一，其分子结构式如下：
[0007]
[0008] 以往的研究证实了 CA可通过改善细胞黏附分子、整合素表达以及TLR4信号通路 的激活改善脂抵抗素刺激引起的单核细胞与内皮细胞的黏附；有抑制N-formyImethionyI -Ieucylphenylalanine (fMLP)刺激的人中性粒细胞产生ROS以及低密度脂蛋白的氧化的 作用；CA还可通过降低IL-6, IL-I β，TNF- α和MCP-I炎性因子的释放及mRNA表达，上调 谷胱甘肽氧化酶，过氧化物歧化酶和过氧化氢酶的mRNA的表达，保护糖尿病大鼠的心脏组 织；CA能够抑制氧化的低密度脂蛋白引起的培养的人内皮细胞凋亡；CA能够通过Bcl-2非 依赖的机制抑制氧化应激引起的人外周血单核细胞的凋亡；CA通过抑制Racl蛋白的表达 及活性，降低NADPH氧化酶的活性，轻氧化应激损伤，保护血管紧张素刺激的动脉血管平滑 肌细胞；CA还能够抑制体外抑制PKC的活性；CA能够激活大鼠骨骼肌细胞AMPK，刺激胰岛 素非依赖的葡萄糖转运；CA对高同型半胱氨酸诱导的小鼠软脑膜细静脉白细胞滚动和粘 附有抑制作用，该作用与其抑制Src/PI3K/Akt信号通路介导的白细胞粘附分子CDlla，b/ ⑶18的表达相关。CA能改善I/R引起的肠损伤；CA能够通过改善缺血后神经功能障碍和 神经元减少，改善脑萎缩，脑梗死以及星状细胞增殖，减少白三烯的产生，从而改善局灶性 脑缺血后脑损伤；咖啡酸能够保护大鼠脑组织的线粒体，减轻intrastriatal quinolinic acid诱导的脑氧化损伤。CA还能够抑制人肝炎病毒B的复制，改善镍引起的大鼠肝脏的氧 化损伤，改善扑热息痛以及CCL4引起的肝细胞损伤。
[0009] 目前，尚未见咖啡酸能否抑制肝缺血再灌注后肝脏微循环障碍、减轻肝组织损伤 的报道；特别是咖啡酸对缺血再灌注引起的肝微循环障碍和肝损伤过程中发挥重要作用的 肝组织线粒体呼吸链，及其调节蛋白Srt3是否有干预作用；对肝细胞内NADPH氧化酶亚基 P41和P47的膜转位是否有干预作用；对脏脏微循环障碍、对肝细胞损伤中扮演重要角色的 肝细胞凋亡、对肝细胞内的细胞骨架损伤等是否有干预作用等尚未见报道。
[0010] 本发明通过研究咖啡酸对肝缺血再灌注大鼠肝脏微循环和肝脏超微结构的观察、 肝脏表面血流量的测定，通过流式细胞仪检测外周血粒细胞粘附分子CDllb、CD18的表达， 测定外周血 ALT，AST，TNF-a，IL-I β，MCP-I，测定大鼠肝脏细胞 TNF-a、IL-I β、MCP-I、 ΜΡ0、TACE的活性，测定Caspase 8、MDA、8-OHdG、Η202/过氧化酶、过氧化氢酶、SOD、谷胱甘 肽还原酶、谷胱甘肽氧化酶、Complex I、II、IV、V的活性，测定NAD+/NADH及DNA提取等多 方面实验研究，从而观察咖啡酸是通过何种途径发挥改善肝缺血再灌注引起的肝微循环障 碍和肝损伤作用的。
【发明内容】
[0011] 本发明涉及咖啡酸的新应用。
[0012] 为此，本发明提供咖啡酸在制备改善肝脏微循环障碍或减轻肝损伤药物的应用。
[0013] 本发明所述的应用，其特征在于：所述的肝脏微循环障碍或肝损伤是由于肝缺血 再灌注损伤引起的。
[0014] 本发明所述的应用，其特征在于，所述的改善肝缺血再灌注引起的肝脏微循环或 肝损伤是指改善缺血再灌注肝表面血流量。
[0015] 本发明所述的应用，其特征在于：所述的改善肝缺血再灌注引起的肝脏微循环或 肝损伤是指改善缺血再灌注后大鼠小叶间静脉、中心静脉肝窦开放数；小叶间静脉、中心静 脉红细胞流速。
[0016] 本发明所述的应用，其特征在于：所述的改善肝缺血再灌注引起的肝脏微循环或 减轻肝损伤是指改善缺血再灌注后大鼠白细胞聚集。
[0017] 本发明所述的应用，其特征在于：所述的改善肝缺血再灌注引起的肝脏微循环或 减轻肝损伤是指抑制AMPK α磷酸化及PKC δ膜转位，抑制NADPH亚基P41和P47的膜转位。
[0018] 本发明所述的应用，其特征在于：所述的改善肝缺血再灌注引起的肝脏微循环或 减轻肝损伤是抑制或减少过氧化物的产生，所述的过氧化物来源于NADPH、线粒体损伤。
[0019] 本发明所述的应用，其特征在于：所述的改善肝缺血再灌注引起的肝脏微循环或 减轻肝损伤是指抑制缺血再灌注引起的肝细胞凋亡。
[0020] 本发明所述的应用，其特征在于：所述的改善肝缺血再灌注引起的肝脏微循环或 减轻肝损伤是指减轻缺血再灌注引起的肝细胞内细胞骨架的损伤。
[0021] 本发明所述的应用，其特征在于，所述的咖啡因是缺血再灌注前给药。
[0022] 本发明咖啡酸适宜以药物组合物的形式给药。这类组合物可以以常规方式与一种 或多种生理上可接受的载体或赋形剂混合使用。若有可能在治疗上将本发明的咖啡酸作为 原料药给药，优选活性成分直接作为药物制剂。在与其他成分相容和对其服药者无害的意 义上，载体必须是药学上可接受的。
[0023] 本发明的药物组合物，在使用时可以根据需要制备成药物制剂形式，如口服制剂 形式，注射剂形式，阴道或肛门栓剂形式等
[0024] 本发明的药物组合物在制备成药物制剂时，根据需要可以加入要学上可接受的载 体。
[0025] 本发明的药物组合物，根据需要可以含有药物可接受的载体，其中咖啡酸或其药 学上可接受的盐、溶剂化物和可水解的酯作为药物活性成分，其在制剂中所占重量百分比 可以是0. 1-99. 9%，其余为药物可接受的载体。本发明的药物制剂，以单位剂量形式存在， 所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶，颗粒 剂每袋，注射剂的每支等。
[0026] 本发明的药物组合物可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、 薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸 剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴 剂、滴丸剂、贴剂。
[0027] 本发明的药物组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充 剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。
[0028] 适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包 括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬 脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。可通过混合，填充，压片等常用 的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的 那些组合物中。
[0029] 口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂， 或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含 有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基 纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉 伯胶；非水性载体（它们可以包括食用油），例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性 酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需 要，可含有常规的香味剂或着色剂。
[0030] 对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体 和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载 体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉 剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这 种组合物冰冻，并在真空下将水除去。
[0031] 本发明的药物组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载 体，所述药物可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐 酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素 C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋 酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、 麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及 其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性 剂、聚乙二醇、环糊精、β -环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。
[0032] 本发明的药物制剂在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服三次，每次 1-20剂，如：1-20袋或粒或片，每剂lmg-1000mg。
[0033] 本发明提供的药物，用于成人治疗的剂量通常将在0.02 - 5000mg每天的范围，优 选I -1500mg每天。所需剂量可以是单一的剂量或多次的计量，按适当的间隔给药，例如每 天两次、三次、四次或更多。根据本发明的制剂可以含有〇. 1 -99%的活性成分，对片剂和胶 囊剂优选30 - 95 %，液体制剂优选3 - 50 %。
[0034] 以下通过实验数据进一步说明本发明的有益效果：
[0035] 本发明所述的咖啡酸的新应用是通过以下实验证明的：
[0036](一）实验仪器
[0037] 倒置荧光显微镜（TE2000-E，Nikon,东京，日本）；超敏感摄像机（USS-301，UNIQ vision，Santa Clara，CA，美国）；彩色摄像机（JK-TU53H，Toshiba，东京，日本）；高速 CCD 摄像系统（Fastcam-ultima APX model 120k，PH0TR0N,美国）；图像合成器（SP_460color quad processor, SUNSP0,日本）；时间视频显示器（VTG-55B，F0R-A，日本）；视频分配器 (VDA-106, Olympus，日本）；监视器（2118A，TCL，中国）；DVD刻录机（DVR-R25, Malata, 中国）；激光多普勒血流灌注成像仪PeriScan PIM3:PeriScan PIM3System;PERIMED,瑞 典；冷光源（SJ8038HA2，SAN JUN，中国）；正立显微镜（BH-2,01ympus，日本）；彩色摄像头 (Digital sight DS-5M-U1，Nikon，日本）；加热毯（ME 04008, FHC BowDOINHAM，美国）；微 量注射泵（ALC-IP，上海奥利特生物科技有限公司，中国）；全自动切片机（RM2255, LEICA， 德国）；恒温水浴（Hff · SY11-K1，北京市长风仪器仪表公司，中国）；离心机（centrifuge 5471R，EPPEND0RF，中国）；分析天平（Sartorius AG,德国）；pH 计（Beckman，美国）；微量 高速离心机（Heraeus，美国）；高速离心机（Beckman,美国）；电热鼓风干燥箱（重庆实验设 备厂） ；-80°C低温冰箱（SANYO,日本）；蛋白质电泳及转膜系统（Bio-Rad，美国）；倒置显微 镜（Olympus,日本）；激光扫描共聚焦显微镜（TCS SP5, Leica, Mannheim,德国）；显微成像 系统（冷泉港，美国）；多功能酶标仪（Bio-Rad，美国）；流式细胞仪（FACS Calibur，BD，美 国）；透射电子显微镜（JEM-1400PluS，JE0L，东京，日本）；扫描电子显微镜（JSM-5600LV， JEOL,东京，日本）；Biacore T200Biosensor (Biacore, GE Healthcare Life Sciences, Sweden)〇
[0038] (二）实验动物
[0039] 体重为200 土 20g的雄性Spragu-Dawley(SD)大鼠，购于北京大学医学部动物中 心，合格证号：SCXK(京）2006 - 0008。动物饲养在温度为22±2°C，湿度为40±5%的条件 下，自由饮食、饮水，12小时光照/黑暗交替。动物于实验前12小时，禁食自由饮水。实验 操作规程按北京大学动物研究委员会指南执行。实验草案获北京大学医学部实验动物伦理 委员会批准（LA2010-001)。
[0040] (三）药品及试剂
[0041] 咖啡酸：Sigma，美国；乌拉坦：中国上海天莲精细化工有限公司；罗丹明 6G(Rhodamine-6G), TEMED，丁酸钠：Sigma，美国；RIPA 裂解液，I. 5mol/L Tris-Cl (pH 8. 8)，0. 5mo 1/L Tri s-Cl (pH 6. 8)，30 %丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液，十二烷基梭酸钠 (SDS)，5 X凝胶上样缓冲液、全蛋白提取试剂盒；胞核-胞浆-胞膜制备试剂盒：普利莱，北 京，中国；NE-PER 核楽蛋白提取试剂盒：Thermo Scientific，Fremont, CA,美国；Ammonium persulfata(APS) :Amresco,美国：BCA蛋白定量试剂盒：Pierce,美国；牛血清白蛋白 (BSA):华美生物，北京，中国；脱脂奶粉：Meijer，美国；PVDF膜：Zerbrechlich-Fragile， 德国；PBS粉剂（北京中杉金桥生物技术有限公司）；EDTA抗原修复缓冲液（50X)(北京中 杉金桥生物技术有限公司）；DAB显色试剂盒（20X)(北京中杉金桥生物技术有限公司）； 髓过氧化物酶（MPO)抗体：Thermo Scientific, Fremont, CA,美国；原位凋亡检测试剂盒： Roche, Basel,瑞士；鬼笔环肤：life technologies, Carlsbad, California,美国；Hoechst 33342 ：Invitrogen, St.Louis, MO,美国；Dylight 488-labeled rabbit anti-goat IgG and Dylight 549-labeled goat anti-rabbit IgG ：KPL,Gaithersburg, MD,美 国；25%戊二醛：Ted Pella,加利福尼亚州，美国；包埋剂SPI-pon 812，DDSA，NMA， DMP-30:Westchester，New York，美国；Protein A Sepharose CL-4B 和 PBS-P+bufTer:GE Healthcare Life Sciences, London,英国；Active human Sirt3full length protein ： Abeam, Cambridge, MA,美国；其他普通化学试剂均为分析纯试剂，购自中国化学药品公司。
[0042] ALT, AST 活性分析试剂盒：Sigma，美国；TNF- a，IL-I β，MCP-I :R&D Systems, Minneapolis，Minn,美国；MDA，MPO 检测试剂盒：Huanya Biomedicine Technology，北京， 中国；QIAamp DNA 提取小试剂盒：QIAGEN，德国；SensoLyte'j):. 520TACE(a-Secretase)活 性分析试剂盒（突光）：Fremont，California,美国；0xiSelect?DNA氧化损伤ELISA试 剂盒（8-OHdG定量），H202/过氧化酶分析试剂盒（荧光）：Cell Biolabs，San Diego， California,美国；过氧化氢酶分析试剂盒，SOD分析试剂盒，谷胱甘肽还原酶分析试剂 盒，谷胱甘肽氧化酶分析试剂盒：Cayman Chemical company, Ann Arbor, Michigan,美国： Caspase 8分析试剂盒，Complex I，II，IV，V活性检测试剂盒，NAD+/NADH分析试剂盒： Abeam, Cambridge, MA,美国。
[0043] CDllb，CD18 抗体：BD Biosciences，Pharmingen，San Diego, CA,美国；ICAM-1， E-selectin，TLR4, p47ph°x，p40ph°x，p22 ph°x，NF-K B p65, Na+-K+-ATP 酶抗体，兔抗 IgG : Santa Cruz, Santa Cruz, CA,美国；I κ B-α，P-I κ B α , Src,P_src, Histone 3, Bax, Bcl~2, Cleaved Caspase-3,Cleaved Caspase-9,PKC δ ,AMPK,P-AMPK,Racl,Sirt3,SDHA,NDUFA9, MnSOD，Acetylated-Lysine，β -actin ：Cell Signaling Technology，Beverly，MA，USA ; p67ph°x，gp91ph°x抗体：Abeam，Cambridge，MA，美国。
[0044] (四）大鼠肝脏I/R模型的建立和给药方法
[0045] 大鼠用2%乌拉坦（2. Og/kg)肌肉注射麻醉，麻醉后胸腹部剃毛。左股静脉插管， 用碘伏，酒精分别消毒胸腹部后，腹部横切口，用止血钳夹持肌肉减少出血，暴露肝脏。使用 动脉夹，夹闭肝门区血管30min，建立肝脏全缺血模型；解除夹闭，再灌注120min。依据随机 数字表将SD大鼠分为6组（每组6只）：
[0046] 咖啡酸溶解在生理盐水（NS)中，现用现配，根据预实验结果，剂量为15mg/kg/h， 速度为I. 8ml/h，在假手术或者缺血前半小时给予生理盐水或者咖啡酸：
[0047] l.NS+Sham组：大鼠只穿线不结扎，股静脉连续滴入生理盐水（NS);
[0048] 2. CA+Sham组：大鼠只穿线不结扎，股静脉连续滴入咖啡酸（CA);
[0049] 3. NS+I/R组：大鼠门管区血管结扎30min，解除夹闭，再灌注120min，股静脉连续 滴入生理盐水；
[0050] 4. CA+I/R组：大鼠门管区血管结扎30min，解除夹闭，再灌注120min，股静脉连续 滴入咖啡酸。
[0051] (五）实验方法
[0052] 5. 1微循环观察
[0053] 5. I. 1.观察小叶间静脉、中心静脉的肝窦开放数，白细胞粘附滚动及红细胞流速
[0054] (1)麻醉：20%乌拉坦，100g/ml，大鼠右下肢肌肉麻醉，麻醉后胸腹部剃毛；
[0055] (2)启动设备：打开水浴锅、电脑、恒温箱、倒置荧光显微镜、图像合成器、视频分 配器、监视器、时间视频显示器、DVD刻录机、预热观察板（须清洗干净），准备注射泵（调整 速度及其他参数）；
[0056] (3)左股静脉插管：用来注射罗达明6G及给予液体；
[0057] (4)暴露肝脏：先用碘伏消毒胸腹部，后酒精消毒胸腹部一遍，范围略小于碘伏 消毒范围；剑突下皮肤横切口，肌肉层沿腹白线剪一纵向小口，避免出血，两把止血钳横向 夹持一边肌肉各15s后再剪开止血钳中间肌肉，再同样方法剪开另一边肌肉，暴露肝脏；
[0058] (5)观察前处理：使用细线扎紧剑突后剪掉剑突，小心剪断镰状韧带，避免刺破横 膈膜；将老鼠侧卧于观察板上，用棉签轻轻将肝脏左叶翻出，置于树脂玻璃观察孔的正中 间，不能使用镊子，防止出血，翻出肝叶后趁势剪断肝胃韧带；将一片大小适宜的脱脂棉放 在肝脏的胃肠侧，滴加适量的37°C生理盐水湿润脱脂棉，包住肝脏胃肠侧、胃肠；另一片大 小适宜、用适量的37°C生理盐水湿润的脱脂棉放在肝脏的横膈膜侧，轻轻压住肝脏，减弱呼 吸引起的肝脏波动；另一片大小适宜、用适量的37°C生理盐水湿润的脱脂棉放在肝脏的上 侦牝压住前两片脱脂棉，固定肝脏；
[0059] (6)将观察板和大鼠一起置于配有37°C恒温装置的倒置生物显微镜载物台上，表 面连续滴加 37°C生理盐水；
[0060] (7)肝脏微循环动态的观察：先观察肝脏大体血流状况，血流状态较好，无明显 肝窦水肿者可继续观察；左股静脉注射罗达明6G 0. 5ml，打开汞灯，高速摄影仪，Imin后 观察白细胞粘附，选择无白细胞粘附的中心静脉、小叶间静脉，直径约20-45 μ m之间，在 400 μ mX320 μ m视野内没有白细胞在小叶间静脉和中心静脉上粘附的区域进行观察；录 制荧光下、高速、彩色CCD下中心静脉、小叶间静脉图像。
[0061] (8)缺血再灌注模型的建立：基础观察IOmin后，肝脏血流较好、无明显白细胞粘 附者可入组，使用动脉夹，夹闭肝门区血管30min，建立肝脏全缺血模型；解除夹闭，将肝叶 重新放置于观察板，显微镜下找到原目标；在再灌注30、60、90、120min时观察和记录微循 环，操作在_3min - 3min内完成，按照荧光、高速、彩色CCD顺序录制中心静脉、小叶间静脉 图像。
[0062] 5. 2肝脏表面血流量的测定
[0063] 大鼠开胸，将肝脏完全暴露，用激光多普勒血流灌注成像仪PeriScan PIM3 (PeriScan PIM3System ;PER頂ED, Sweden)对大鼠肝左叶血流量进行检测，记录在 缺血前（Baseline)，及再灌注120min时2cmX2cm范围肝脏表面血流量，每个时间点测 量3次。扫描头始终位于平行于肝脏表面上方18cm的位置，扫描深度均为0.5mm。用 LDPIwin3. I (PeriScan P頂3System ;PER頂ED, Sweden)对图像进行测量和数据评估，取3次 测量。以I/R前的肝表面灌注量为基础值，计算肝左叶灌注量的变化率。
[0064] 5. 3组织形态学染色
[0065] 5. 3. 1.石蜡切片制备
[0066] (1)再灌注120min后，用微量注射泵灌注生理盐水冲洗肝脏速度为10ml/min，共 20ml ；
[0067] (2)剪下肝左叶下缘肝脏，置于新配制的4%的多聚甲醛溶液固定48h，在固定的 过程中注意要经常震荡，固定的容积比是20-30倍；
[0068] (3)固定后的肝脏进行修剪，用刀片将大块肝脏沿横切面平行切开，使肝脏厚度约 低于5mm ;
[0069] (4)将肝脏表面的甲醛用滤纸沾干，三蒸水清洗，清洗时间为12h，清洗过程要经 常震荡，在6h左右更换一次三蒸水；
[0070] (5)经过70%酒精、80%酒精脱水24h、95%酒精脱水12K100%酒精脱水2-3h，在 脱水过程中要不断震荡；
[0071] (6)脱水结束之后，用滤纸将肝脏表面的酒精擦干，将组织进入二甲苯中，透明时 间为10-30min，透明过程中要随时观察组织的透明程度；
[0072] (7)浸蜡的电热鼓风干燥箱温度定为60°C，提前5_6h打开，使蜡融化。用滤纸将 表面的二甲苯擦干