二倍稀释法对提取物进行梯度稀释，稀释成7个2倍系列浓度， 然后在盛有1.9mL肉汤培养基的试管中分别加入IOOul稀释后的药液，最后一管加入IOOul 的蒸馏水作空白对照，最后加入细菌悬液，使细菌浓度达到106CFU/mL。37 °C培养24h，625nm 测定吸光值，无菌生长的试管中的药物浓度即为该药物的最小抑菌浓度(MIC)，试验重复3 次。最后加入细菌悬液，使细菌终浓度达到106CFU/mL。在37 °C下培养24h，625nm测定吸光 值，无菌生长的试管中的最小提取物浓度即为该提取物的最小抑菌浓度（M i n i mum Inhibitory Concentration，MIC)。试验重复三次。
[0037] 2.复方中草药的筛选和配比
[0038]通过琼脂扩散法和二倍稀释法共同初次筛选出抑菌效果较好的中草药，利用正交 t值法和药物之间的交互作用，对初次筛选出的中草药进一步进行筛选和复方配比，步骤 为，主要药物分析、辅助药物分析和剂量分析。
[0039] 2.1主要药物分析
[0040]主要药物分析采用正交t值法(表1)，即将筛选出来的中草药每种作为一个因素， 分别编制代号为ABCDE等，每种中草药均设两个水平，设水平1为添加，水平2为不添加。剂量 水平均采用1: 1: 1:1: 1。试验选用L12(211)正交t值表进行试验安排，各组通过二倍稀释法 测定最小抑菌浓度(MIC)，以其为试验指标，每组3个重复，数据越小，抑菌效果越好。
[0041 ] 表1正交t值法LI 2 (211)的组方原则
[0043] 2.2辅助药物交互作用分析
[0044] 利用琼脂扩散法，采用药物之间的交互作用进行辅助药物分析，以抑菌圈直径为 试验指标。具体方法为用灭菌后的打孔器(直径为5.85mm)在每个平板上打4个孔，一孔以 50uL灭菌生理盐水为阴性对照，另外3孔分别加入50uL两种单味中草药原液。设3个平行重 复。将平板置于28 °C培养箱中培养24h，观察结果。
[0045] 2.3剂量配比分析
[0046] 各因素确定后，即采用正交t值法进行剂量配比分析，每组3个重复，以抑菌圈直径 为检测指标。
[0047] 3.不同剂量复方中草药对异育银鲫生长的影响
[0048] 3.1称取已确定好的3种中草药复方，按五倍子:地榆:大黄=5: 2:1的比例进行配 置。配置好后，以5%的投饵率计算，称取合适的饲料，然后采用喷洒的方法将药液均匀的附 在饲料上，然后置于干燥箱中，在65°C干燥24h以配用。饲料为成都天龙饲料公司生产的鲤 鱼成鱼膨化饲料。
[0049] 试验用鱼异育银鲫(Carassais auratus gibebio)，体重为（136.33±15.94)g。经 过预试验，设置1个对照组(0%复方)和4个试验组(复方中草药添加量为0.5%、1 %、2%和 4%)，每组3个重复，每个重复20尾，2天换水1次。养殖过程中，采用加热棒进行控温，控制水 温在23 ± 1.6°C，换水时，先放出1/3的水，然后将水注满，等待5min，再放掉1/2水，注满水 后，等待5min，最后再放掉所用的水，再将水缸注满。试验期间，采用定时投喂，每天早晚各 投喂1次饲料，投喂量为3%，早上9:00,下午16:00。在养殖过程中，每15天，抽取一定数量的 鱼进行称重，逐渐增加投喂量。
[0050] 3.2在60天的养殖试验结束后，进行体长、体重和去内脏重的测定。相关指标的计 算方法：
[0051 ]增重率（％ ) = [(试验末鱼体重-初始体重)/初始体重]*100%
[0052] 特定生长率SGR( % ) = [ (In试验末鱼体重-In初始体重)/试验天数]*100%
[0053] 丰满度（％ )=[试验末鱼体重/试验末鱼体长3]*100%
[0054]内脏比（％ )=[试验末鱼体内脏重/试验末鱼体重]*100%
[0055] 3.3攻毒试验
[0056]养殖试验结束后，剩余的试验鱼全部用于攻毒试验。试验方法采用xie (2008 )、卢 春霞(2011)等报道的方法。将两次活化的菌株用无菌生理盐水稀释，保持终浓度为108CFU/ ml。注射量为0.2mL/尾，观察鱼死亡情况，观察1周，统计死亡率。
[0057] 死亡率（％ )=死亡数/鱼总数*100%
[0058] 免疫保护率（％ ) = 100%*(对照组死亡率-试验组死亡率)/对照组死亡率
[0059] 4.不同剂量复方中草药对异育银鲫酶活性的影响
[0060] 4.1称取已确定好的3种中草药复方，按五倍子:地榆:大黄=5: 2:1的比例进行配 置。配置好后，以5%的投饵率计算，称取合适的饲料，然后采用喷洒的方法将药液均匀的附 在饲料上，然后置于干燥箱中，在65°C干燥24h以配用。饲料为成都天龙饲料公司生产的鲤 鱼成鱼膨化饲料。
[0061 ] 经过预试验，设置1个对照组(0 %复方）和4个试验组（添加量为0.5 %、1 %、2 %和 4%)，每组3个重复，每个重复20尾，2天换水1次。养殖过程中，采用加热棒进行控温，控制水 温在23 ± 1.6°C，换水时，先放出1/3的水，然后将水注满，等待5min，再放掉1/2水，注满水 后，等待5min，最后再放掉所用的水，再将水缸注满。试验期间，采用定时投喂，每天早晚各 投喂1次饲料，投喂量为3%，早上9:00,下午16:00。在养殖过程中，每15天，抽取一定数量的 鱼进行称重，逐渐增加投喂量。
[0062] 4.2在给药后的第60天进行采样，每个重复取鱼2尾，解剖时，取出鱼的鳃、肌肉和 肝脏组织以后，滴加生理盐水保持样品的鲜活，称重时，先用生理盐水润洗，洗净后，用滤纸 吸干再称重，使其重量为〇. 2-0.3g左右，然后放入4ml离心管中，将离心管放入冰浴中，加入 1:10的生理盐水，利用匀浆器研磨，研磨到基本没有颗粒状或成块状物质为准，研磨时，使 其浸没在冰浴中，以避免酶类失活。研磨完成后，放入冷冻离心机离心，完成后，放入4°C冰 箱待用。血液的采集则采用注射器进行尾静脉采血，采完后，放入事先准备好的抗凝管中， 编号，放入4°C冰箱保存待用。
[0063] 4.3酶活性的测定
[0064] GOT、GPT、SOD、MDA、CAT、ACP、AKP、LDH和MDH活性的测定严格按照南京建成试剂盒 说明书的操作方法进行测定，蛋白质的测定采用考马斯亮蓝法。
[0065] 5.结果
[0066] 5.1从30种中草药中，初步筛选出了五倍子、地榆、大黄、黄芩、黄连、甘草和槟榔等 7中中草药，五倍子和黄连对其为极敏药物，地榆、大黄、黄芩、甘草和槟榔等中草药为高敏 药物；
[0067] 通过正交t值法得出了主要药物为五倍子；
[0068] 通过辅助药物之间的联合作用确定了辅助药物为地榆和大黄；
[0069] 通过剂量分析确定了五倍子、地榆和大黄的剂量配比为5:2:1。
[0070] 5.2在60天试验期内，随着添加量的增大，增重率、SGR、丰满度、内脏比出现先升后 缓慢降低的趋势，最大值均出现在1 %组，分别为59.81 %、0.77 %、1.58和13.66 %。
[0071 ] 5.3在60天的试验期内，随着添加量的逐渐增大，肝脏、肌肉和鳃组织的GOT、GPT、 S0D、MDA、CAT和LDH活性基本均出现上升的趋势，肝脏和肌肉的ACP和AKP活性基本保持不 变，血液的则基本出现上升的趋势，肝脏MDH出现下降的趋势，肌肉和鳃组织则基本出现上 升的趋势；
[0072]随着添加量的逐渐增大，酶活性值也越大的趋势；
[0073] GOT和GPT活性大小顺序基本均为肝脏 > 血液 > 肌肉 > 鳃;肝脏、肌肉和鳃组织的 SOD活性大小相差不大，MDA活性大小顺序基本为血液 > 鳃 > 肝脏 > 肌肉，CAT活性大小顺序 基本为肝脏>鳃>血液>肌肉;ACP和AKP活性大小顺序基本均为鳃>肝脏>肌肉；LDH活性 大小顺序基本为肌肉 > 肝脏 > 鳃，MDH活性大小顺序基本为肝脏 > 肌肉、鳃。
【主权项】
1. 一种抑杀嗜水气单胞菌的中草药制备方法，其特征在于，所述抑杀嗜水气单胞菌中 草药制备方法包括以下步骤： 步骤一、将五倍子、地榆和大黄三味中草药置于恒温干燥箱65 ± 5 °C下干燥5h; 步骤二、然后取每味中药各50g粉碎后放人洁净的烧杯中，按1:10重量比例加水浸泡 30min后，煎煮30min，用纱布过滤药液，重复此过程3次； 步骤三、然后合并所得药液，蒸馏浓缩至药液内含原药lg/mL; 步骤四、最后用高压灭菌锅在121°C灭菌20min后，置冰箱4°C中保存备用。2. -种如权利要求1所述的抑杀嗜水气单胞菌中草药制备方法制备的抑杀嗜水气单胞 菌的复方中草药，其特征在于，所述抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药包括:五倍子、地榆和 大黄三味中草药;所述五倍子、地榆和大黄的剂量按重量配比为5:2:1。3. -种如权利要求2所述的抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药的应用，其特征在于，所述 抑杀嗜水气单胞菌的中草药具有杀菌抑菌的功能，增强鱼类对嗜水气单胞菌的抵抗能力， 降低患病的死亡率。4. 一种如权利要求3所述抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药的应用，其特征在于，在治疗 嗜水气单胞菌引起鱼类的细菌性疾病中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药及其制备方法和应用，包括：五倍子、地榆和大黄，五倍子、地榆和大黄的剂量按重量配比为5:2:1。同时本发明公开了一种抑杀嗜水气单胞菌的中草药制备方法和应用。本发明合理地开发利用中草药资源，在水产动物养殖中，不仅对动物的营养和促生长以及提高防病抗病能力具有重大意义，同时也符合水产养殖可持续发展的要求；为了减少病害对水产养殖业造成的损失，找到有较强效果、毒副作用小的药物进行防治变得尤为重要，本发明以嗜水气单胞菌为研究对象，筛选出对其有较好抑菌作用的复方中草药，从而为水产动物病害学和嗜水气单胞菌引起的鱼类细菌性疾病防治实践提供参考依据。
【IPC分类】A61K35/64, A61K36/739, A61P31/04
【公开号】CN105708926
【申请号】CN201610058206
【发明人】郑永华, 唐洪玉, 胡文达
【申请人】西南大学
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2016年1月28日