一种抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于淡水养殖技术领域，尤其涉及一种抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药及 其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)属于弧菌科、气单胞菌属，是杆状、革兰氏 阴性、有动力的气单胞菌群，在液体培养基中具有极生单鞭毛、兼性厌氧、无芽孢、无荚膜。 生理生化特征为:V试验、氧化酶、硝酸盐还原、明胶液化、吲哚试验、精氨酸双水解、赖氨酸 脱羧酶阳性，能发酵葡萄糖产酸和产气。生长pH值为5.5-9.0，最适生长温度28°C，在低温下 有一定的生长能力，最低生长温度达-0.1°C。普遍存在于淡水、海水、河流、污水、淤泥、土壤 和人类粪便中；也存在各种食品中，例如:蔬菜、鲜奶、鱼、海鲜、火腿、腊肠等各种畜禽肉中。 嗜水气单胞菌(A.hydrophila)具有广泛的致病性，感染动物包括冷血动物(鱼类、两栖类、 爬行类)和恒温动物(禽类及哺乳类），尤其是水生动物最常见的致病菌，给全世界的淡水养 殖业造成惨重的经济损失，具有感染动物种类多、流行范围广、流行季节长等特点，是一种 典型人-兽-鱼共患的致病菌。近年来，人类因感染嗜水气单胞菌(A. hydrophila)而导致腹 泻、食物中毒、继发感染引起蜂窝织炎、脑膜炎、腹膜炎、肠胃炎、败血症和伤□感染等病例 也频繁发生，其致病作用已成为当今公共卫生关注的问题。目前在许多国家已将此菌纳入 腹泻病原菌的常规检测范围，作为食品卫生检验的对象。随着水产养殖集约化程度的提高， 特别是名、特、优养殖品种的迅速发展，水产动物疾病种类日益增多，给养殖业带来了严重 的经济损失。以抗生素为主的药物防治长期使用不仅给水体环境造成了不良影响，而且耐 药菌株的产生也将给人类健康带来一定的威胁。由此，疫苗和免疫增强剂（immune opotentiator)成为水产动物病害防治的首选。免疫增强剂对提高养殖动物非特异性免疫 (nonspecific cimmunit)能力有着其独特的功效，在提高养殖品种的抗病力起到了积极的 作用，已成为水产养殖动物重要的饲料添加剂。特别是在甲壳类养殖品种中，通过免疫增强 剂提高抗病力，已成为生产性防病的有效手段之一。中草药具有来源广泛、价格低廉、环境 污染较低、不易产生耐药性等优点深受人们的普遍认可，中药源免疫增强剂已成为甲壳类 免疫增强剂筛选的重要来源。在我国使用中草药防治疾病已有几千年历史，中草药为我国 传统药物，在抑菌、抗菌和促生长等方面具有重要作用。目前，由于化学药物的滥用，导致了 诸多的问题，如造成了不可逆环境污染、在动植物中蓄积、危害人类的健康和致癌等。然而 中草药是天然有机物，毒副作用小，无蓄积、无残留，减少了对生物的危害，且其成分复杂， 发挥作用时具有多靶点、多机制、多效性等特点，使病原微生物不易对中草药产生耐药性， 提高了抗菌效力，因此，中草药越来越受到人们的关注。
[0003] 近年来随着经济的快速发展，水产养殖业也得到了迅猛的发展，但同时由于集约 化养殖导致了水质恶化，致使水体病原菌大量繁殖，水产养殖动物疾病频发，水产养殖业损 失惨重，同时嗜水气单胞菌引起的病害也造成了大量的损失。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药及其制备方法和应 用，旨在解决近年来随着经济的快速发展，由于集约化养殖导致了水质恶化，致使水体病原 菌大量繁殖，水产养殖动物疾病频发，水产养殖业损失惨重，同时嗜水气单胞菌引起的病害 也造成了大量损失的问题。
[0005] 本发明是这样实现的，一种抑杀嗜水气单胞菌的中草药的制备方法，所述抑杀嗜 水气单胞菌的中草药的制备方法包括以下步骤：
[0006] 将五倍子、地榆和大黄三味中草药置于恒温干燥箱65 ± 5 °C下干燥5h;
[0007] 然后取每味中药各50g粉碎后放人洁净的烧杯中，按1:10重量比例加水浸泡30min 后，煎煮30min，用纱布过滤药液，重复此过程3次；
[0008] 然后合并所得药液，蒸馏浓缩至药液内含原药lg/rnL;
[0009] 最后用高压灭菌锅在121°C灭菌20min后，置冰箱4°C中保存备用。
[0010] 本发明的另一目的在于提供一种抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药，所述抑杀嗜水 气单胞菌的复方中草药包括:五倍子、地榆和大黄，五倍子、地榆和大黄的剂量按重量配比 为5:2:1 〇
[0011] 本发明的另一目的在于提供一种抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药的应用，所述复 方中草药的应用包括：
[0012] 该抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药具有杀菌抑菌的功能，增强鱼类对嗜水气单胞 菌的抵抗能力，降低患病的死亡率，在治疗嗜水气单胞菌引起鱼类的细菌性疾病中的应用。
[0013] 我国拥有丰富的中草药资源，中草药以低残留、对人体健康无害、高效安全，符合 目前倍受关注的健康养殖的要求。因此，合理地开发利用中草药资源，在水产动物养殖中， 不仅对动物的营养和促生长以及提高防病抗病能力具有重大意义，同时也符合水产养殖可 持续发展的要求;为了减少病害对水产养殖业造成的损失，找到有较强效果、毒副作用小的 药物进行防治变得尤为重要。因此，本发明以嗜水气单胞菌为研究对象，筛选出对其有较好 抑菌作用的复方中草药，从而为水产动物病害学和嗜水气单胞菌引起的鱼类细菌性疾病防 治实践提供参考依据。
【附图说明】
[0014] 图1是本发明实施例提供的抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药制备方法流程图。
【具体实施方式】
[0015] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0016] 本发明以嗜水气单胞菌为研究对象，通过琼脂扩散法，从30种中草药中，初步筛选 出了五倍子、地榆、大黄、黄芩、黄连、甘草和槟榔等7种中草药;通过正交t值法得出了主要 药物为五倍子;通过辅助药物之间的联合作用确定了辅助药物为地榆和大黄;通过剂量分 析确定了五倍子、地榆和大黄的剂量配比为5:2:1。
[0017] 以（136.33 ± 15.94)g的异育银鲫为研究对象，采用养殖试验的方法，在60天试验 期内，随着添加量的增大，增重率、SGR、丰满度、内脏比出现先升后缓慢降低的趋势，最大值 均出现在1% 组，分别为 59.81%、0.77%、1.58和13.66%。以601'、6卩1'、500、]\?^、〇厶1'、厶〇？、 AKP、LDH和MDH活性为检测指标，在60天的试验期内，随着添加量的逐渐增大，肝脏、肌肉和 鳃组织的GOT、GPT、S0D、MDA、CAT和LDH活性基本均出现上升的趋势，肝脏和肌肉的ACP和AKP 活性基本保持不变，血液的则基本出现上升的趋势，肝脏MDH出现下降的趋势，肌肉和鳃组 织则基本出现上升的趋势;基本呈现添加量越大，酶活性值越大的趋势;GOT和GPT活性大小 顺序基本均为肝脏> 血液 > 肌肉 >鲍;肝脏、肌肉和鳃组织的SOD活性大小相差不大，MDA活 性大小顺序基本为血液 > 鳃 > 肝脏 > 肌肉，CAT活性大小顺序基本为肝脏 > 鳃 > 血液 > 肌 肉;ACP和AKP活性大小顺序基本均为鳃 > 肝脏 > 肌肉;LDH活性大小顺序基本为肌肉 > 肝脏 >鳃，MDH活性大小顺序基本为肝脏 > 肌肉、鳃。
[0018] 下面结合附图对本发明作详细描述。
[0019] -种抑杀嗜水气单胞菌的中草药的制备方法，所述抑杀嗜水气单胞菌的中草药的 制备方法包括以下步骤：
[0020] SlOl:将五倍子、地榆和大黄三味中草药置于恒温干燥箱65±5°C下干燥5h;
[0021] S10 2 :取每味中药各5 0 g粉碎后放人洁净的烧杯中，按1: 10重量比例加水浸泡 30min后，煎煮30min，用纱布过滤药液，重复此过程3次；
[0022] Sl 03:合并所得药液，蒸馏浓缩至药液内含原药lg/mL;
[0023] S104:用高压灭菌锅在121°C灭菌20min后，置冰箱4°C中保存备用。
[0024] 本发明提供一种所述抑杀嗜水气单胞菌的中草药制备方法制备的抑杀嗜水气单 胞菌的复方中草药，所述抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药包括:五倍子、地榆和大黄，五倍 子、地榆和大黄的剂量按重量配比为5:2:1。
[0025] 本发明提供一种抑杀嗜水气单胞菌的复方中草药的应用，所述抑杀嗜水气单胞菌 的复方中草药的应用包括：
[0026] 该抑杀嗜水气单胞菌的中草药中的五倍子、地榆和大黄组合的组合物具有杀菌抑 菌的功能，增强鱼类对嗜水气单胞菌的抵抗能力，降低患病的死亡率，其特征在于，在治疗 嗜水气单胞菌引起鱼类的细菌性疾病中的应用。
[0027] 下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。
[0028] 1.单方中草药的筛选
[0029] 1.1中草药提取液的制备
[0030] 中草药提取采用煎煮的方法:将购置回来的30种中草药置于恒温干燥箱65( ±5) °C下干燥5h(生姜和大蒜则先切碎，然后在此温度下干燥2d)，然后取每味中药各50g粉碎后 放人洁净的烧杯中，按1:10比例加水浸泡30min后，煎煮30min，用纱布过滤药液，重复此过 程3次，然后合并所得药液，蒸馏浓缩至药液内含原药lg/mL，最后用高压灭菌锅灭菌（121 °C，20min)后，置冰箱4°C中保存备用。
[0031] 1.2菌悬液的制备
[0032]将菌株活化，用接种针在固体培养基上划线，在28°C培养24h后，挑取单个菌落，接 种到液体培养基上震荡培养12-16h。采用麦氏比浊法将菌液用液体培养基稀释到合适浓 度，本试验中菌液浓度为I X I〇8CFU/mL。
[0033] 1.3琼脂扩散法
[0034] 固体培养基平板直径约90.00mm，培养基厚度约3.60mm，平板上加 IOOuL菌液(约1 X 107CFU/ml)，涂抹均匀。然后用打孔器(直径为5. OOmm)在平板上打孔，每个平板上打5个 孔，每种药物做5个重复，然后加入30ul(lg/ml)药液，最后放入28°C培养箱中培养24h，观察 并测量抑菌圈直径，抑菌圈2 20mm，极敏;15-19mm，高敏;10-15mm，中敏;IOmm以下，低敏。
[0035] 1.4二倍稀释法
[0036] 用LB液体培养基以