增生性玻璃体视网膜病变的治疗的制作方法
【专利说明】増生性玻璃体视网膜病变的治疗
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 要求2013年10月7日提交的美国临时专利申请第61/887,747号的权益；其通过引 用完整地并入本文。
技术领域
[0003] 本文提供了用于通过抑制转化生长因子β活化激酶l(TAK-l)的活性来治疗增生性 玻璃体视网膜病变(PVR)的方法。还提供了用于在所述治疗中使用的药物组合物。
【背景技术】
[0004] 增生性玻璃体视网膜病变(PVR)是发展为在视网膜脱离(RD)时的并发症的结疤过 程，并且它是RD治疗上外科手术失败的最常见原因（Ho等，Br J Ophthalmol 1985,69:584-587) WVR是一种动态过程，其特征在于在脱离的视网膜上形成纤维化组织而阻止视网膜的 复位，并且最终可能引起失明（Lambert等，Seminars in ophthalmology 1995，10:49_52)〇 通常位于视网膜的外细胞层的视网膜色素上皮(RPE)细胞是眼部纤维化疾病发展的最关键 造成因素。在PVR期间，RPE细胞通过被称为上皮间质转化(EMT)的过程转化为成纤维细胞样 细胞(Takahashi等，J Biol Chem 2010,285:4060-4073)。在从上皮细胞转化为间充质细胞 的过程中，它们失去其上皮细胞特征，如极性和特殊的细胞与细胞接触，并获得迀移性间充 质细胞性能(Grisanti等，Invest Ophthalmol Vis Sci 1995,36:391-405)。通过细胞表面 分子的表达、细胞骨架重组和细胞外基质(ECM)成分介导这些过程(Thiery等，Cell 2009， 139:871-890;Kalluri等，J Clin Invest 2009,119:1420-1428)^]^可以被不同的信号分 子如表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)激活，然而转化生长因子i3-l(TGF-0 1)被认为是 EMT 的主要调节因子（Garweg 等，Surv Ophthalmol 2013,58:321_329; Lamouille等，I 2007，178:437-451;Charteris，B;r J 0phthalmoll995,79:953_960)〇
[0005] 已在各种细胞类型中观察到TGF-β介导的EMT，包括晶状体上皮细胞、角膜上皮细 胞以及其他细胞（Saika S，Lab Invest 2006,86:106-115) JGF-β是具有一系列生物学效 应，如细胞生长，分化，通过双刃剑效应、氧化应激和内质网(ER)应激的免疫调节的一种多 功能的细胞因子（Desmouliere等，J Cell Biol 1993，122:103_lll;Yoon等，Oncogene 2005，24:1895-1903)。下游的细胞内信号转导至TGF-β受体复合物由Smads家族经典通路介 导（Zhang等，Cell Res 2009,19:128-139)。近期报告已经证明了丝裂原活化蛋白（MAP)激 酶激酶激酶家族的成员转化生长因子β活化激酶1(TAK1)参与非经典通路中的TGF-iH言号转 导（Mu Y等，Cell Tissue Res 2011，347:ll-20;Yamaguchi等，Science 1995,270:2008_ 2011;Kajino等，J Biol Chem 2007,282:9475-9481)。然而至今为止，TAK1 在RPE细胞信号 转导和介导PVR发展中的作用还未知。TAK1是被TGF-βΙ迅速地活化然后活化其他MAP激酶如 p38的一种丝氨酸/苏氨酸激酶(Ma等，Am J Physiol Renal Physiol 2011，300 :F141〇-1421;Wang等，J Biol Chem 1997,272:22771-22775)。此外，研究表明TAK1 可以通过诱导 Smad7表达以及还通过与Smad蛋白MH2结构域的直接相互作用干扰R-Smad反式激活来调节 Smad信号转导的TGF-β诱导的活化（Brown等，J Cell Biochem 2007,101:9-33) JAK1 除了 调节Smad功能的作用外，在特定的TGF-β 1革El标基因表达的调控中在Smad与TAK1的下游革巴标 如P38MAPK和ATF2之间存在交互对话（cross-talk)(Zhang等，Cell Res 2009,19:128-139; Mu Y等，Cell Tissue Res 2011,347:11-20)。尽管TAK1 活化和TGF-βΙ信号转导相关联，众 所周知TAK1的活化也可以通过各种刺激引起，这些刺激包括:环境压力，促炎性细胞因子如 肿瘤坏死因子a(TNF-c〇、白介素（IL)-l以及脂多糖(LPS) (Conner等，Biochem J 2006，399: 427-434)。活化的TAK1可将信号转导到数个下游信号级联，包括MKK4/7-JNK、MKK3/6-P38MAPK和核因子-kB(NF-kB)诱导激酶（ΝΙΚ)-ΙκΒ激酶（IKK)(Hanada等，Biol Chem 2001， 276:5753-5759)。
[0006] 用于RD控制的目前可用的外科手术的选择是充气性视网膜固定术、巩膜扣带术、 玻璃体切除术和睫状体平坦部玻璃体切除术(PPV)。尽管PVR主要是手术上的控制，并且其 在技术上有巨大的进步，但是在1988至2003年间的PVR患者数量仍旧保持相似。对于PVR该 高发病率可能的解释可以解释为没有防止使用玻璃体切除术发生的一定程度的细胞粘附 和病理学变化的能力。因此，继续需要开发出能够实现RD的较好治疗效果的PVR疗法。
【发明内容】
[0007] 本文公开了 TAK1在RPE细胞中介导TGF-m诱导的EMT的观察结果。本发现使得能够 开发用于治疗PVR的药物组合物及其使用方法。
[0008] 因此，本文提供了一种用于在对象中预防或治疗增生性玻璃体视网膜病变(PVR) 的药物组合物，其包含转化生长因子β活化激酶1 (TAK-1)的活化或激酶活性中至少一种的 抑制剂。还描述了用于抑制或预防RPE细胞中的ΕΜΤ的类似配制的组合物。
[0009] 本文还描述了用于在对象中预防或治疗增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的方法， 其包括向有此需要的对象施用治疗上有效量的转化生长因子β活化激酶l(TAK-l)的活化或 激酶活性中至少一种的抑制剂，从而预防或治疗PVR。
[0010]此外，描述了用于在对象中抑制视网膜色素上皮细胞中的上皮间质转化(EMT)的 方法，其包括向有此需要的对象施用治疗上有效量的转化生长因子β活化激酶l(TAK-l)的 活化或激酶活性中至少一种的抑制剂，从而预防或治疗PVR。
[0011]根据参照附图进行的下列详细描述，前述和其他的目的、特征以及优点会变得更 加明显。
【附图说明】
[0012] 图1显示在RPE细胞中TAK1在TGF-m刺激下被活化。RPE细胞用TGF-m (2.5ng/ml) 处理指定的时间或不处理。然后用磷酸化-Thr 187TAK1抗体(绿)和DAPI (蓝)对细胞进行免 疫染色。示出三次独立实验的代表性照片。对于所有图像，比例尺为1〇μπι。
[0013] 图2显示在TGF-β刺激下的RPE细胞中ΤΑΚ1调控EMT表现型。图2Α:将RPE细胞血清饥 饿16小时，用5Z-7-〇xozeaenol (ΙμΜ)预处理或不处理1小时。然后细胞用TGF-βΙ (2.5ng/ml) 处理24小时，并且用α-SMA抗体(红）和DAPI (蓝)进行免疫染色。三次独立实验的代表性照 片。图2B:将RPE细胞血清饥饿16小时，然后用丝裂霉素 C(10ng/ml)处理3小时。其后，细胞用 5Z-7-〇xozeaenol(lyM)或二甲亚砜(DMS0)预处理1小时。在此过程后，在细胞单层中实施 刮划，并且用TGF-01(2.5ng/ml)补充无血清培养基或不补充。在指定时间对划痕拍照记录 (上图），并且使用Image-J软件测量它们的宽度。柱状图（下图）说明每一时间点剩余间隙相 对于初始间隙宽度的百分比，其基于三次独立的实验。柱状条为平均值土 SD。图2C:将RPE细 胞血清饥饿16小时，然后用5Z-7-〇xozeaenol(lyM)、SB431542(10yM)或DMSO预处理1小时。 然后用含有或不含有TGF-βΙ (2.5ng/ml)的无血清培养基替代培养基，并在24小时后收集不 同处理的上清液。通过明胶酶谱检测处理总MMP-9活性(上图），并通过Quantity One? 1-D 分析软件计算带强度值。示出显示在不同处理中MMP-9分泌水平的柱状图（下图）。
[0014] 图3显示TGF-β通过TAK1调控RPE细胞的形态学和转录变化。图3A:将RPE细胞接种 于纤连蛋白涂覆的盖玻片上，并血清饥饿16小时，用5Z-7-〇xozeaenol (ΙμΜ)或SB431542( 10 μΜ)或DMS0预处理1小时，然后用或不用TGF-βΙ处理2天。处理后，用罗丹明-鬼笔环肽(肌动 蛋白纤维-绿)和DAPI(蓝)对细胞进行染色，并通过共聚焦显微镜可视化。细胞大小用白色 箭头指示。比例尺：20μΜ。图3B:血清饥饿的RPE细胞用5Z-7-〇xozeaenol (ΙμΜ)或DMS0预处理 1小时，并如图3Α暴露于TGF-β。在每一时间点提取总RNA并进行qPCR。在6小时、16小时和24 小时后测定CTGF的转录水平。柱状条代表在相同样品中相对于GAPDH mRNA的特定mRNA的 量。所有实验都重复进行三次。示出来自两个独立实验的代表性柱状图。图3C:接种RPE细胞 并如图3A进行处理。处理后，用E-钙黏着蛋白抗体(绿)和DAPI(蓝)对细胞进行免疫染色。示 出两个独立实验的代表性照片。
[0015]图4显示TAK1的抑制消除了 TGF-M言号级联的活化。图4A :用或不用5Z-7-oxozeaenol(ΙμΜ)预处理血清饥饿的RPE细胞1小时，然后用TGF-0(2.5ng/ml)处理指定