Virosaine A的哌嗪基和咪唑基衍生物的组合物在抗病毒药物中的应用
【专利摘要】本发明涉及有机合成和药物化学领域，具体涉及组合物及其在制备抗病毒药物上的用途。公开了一种组合物及其制备方法。药理学实验表明，本发明的组合物具有抗病毒作用，具有开发抗病毒药物的价值。
【专利说明】
Vi rosa i ne A的哌嗪基和咪唑基衍生物的组合物在抗病毒药 物中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及有机合成和药物化学领域，具体涉及组合物、制备方法及其用途。
【背景技术】
[0002] 单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex virus，HSV-l)和单纯疱疹病毒2型(Herpes simplex virus，HSV-2)属于疱疹科病毒，HSV-1和HSV-2不仅引起口唇或生殖粘膜疱疹，同 时也是引起脑炎、肝炎、全身严重感染甚至宫内感染的重要病原。
[0003] 呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)主要引起呼吸系统感染， 在婴幼儿、老年以及免疫缺陷人群引起严重肺炎，是人类上呼吸道感染的重要病原之一。
[0004] 甲型流感病毒（Influenza A virus，Flu_A)属于正粘科病毒，在人类和其他生物 每年都有小范围的流行，引起上呼吸系统感染。大流行时，可引起严重呼吸系统感染，甚者 引起肺炎、脑炎甚至死亡。
[0005] 上述三种病毒的治疗目前已有的药物存在毒性大、安全性低的问题，从天然产物 中寻找化合物或先导化合物并进行结构修饰获得其衍生物，从而得到高效低毒的潜在药物 最有重要价值。
[0006] 本发明涉及的化合物I是一个2012年发表（Bing-Xin Zhao et al .， 2012.Virosaines A and B,Two New Birdcage-Shaped Securinega Alkaloids with an Unprecedented Skeleton from Flueggea virosa.Organic Letters 14(2012)3096-3099)的化合物，我们对化合物I进行了结构修饰，获得了两个新的衍生物即化合物III和化 合物IV，并用化合物III和化合物IV制备了组合物，并对该组合物抗病毒活性进行了评价， 其具有抗病毒活性。
【发明内容】
[0007] 本发明公开了一个新的组合物，该组合物由化合物III和化合物IV组成，该组合物 中化合物III和化合物IV的质量百分数分别为20%和80%。
[0009] 本发明公开的组合物可以制成药学上可接受的盐或药学上可接受的载体。
[0010] 药效学实验表明，本发明的组合物具有较好的抗病毒作用。本发明的药学上可接 受的盐具有同样的药效。
[0011]组合物的体外实验表明，组合物具有很强的抗HSV-1、HSV-2、RSV和flu A的活性， 因此本发明的组合物有望被用于制备新型抗病毒药物。
[0012]以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具体实 施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。
【具体实施方式】
[0013] 实施例1化合物Virosaine A的制备
[0014] 化合物Virosaine A(I)的制备方法参照Bing-Xin Zhao等人发表的文献(Bing-Xin Zhao et al.,2012.Virosaines A and B,Two New Birdcage-Shaped Securinega Alkaloids with an Unprecedented Skeleton from Flueggea virosa.Organic Letters 14(2012)3096-3099)的方法 D
[0016] 实施例2Virosaine A的0-溴乙基衍生物（II)的合成
[0017] 将化合物I (235mg，1. OOmmo 1)溶于20mL苯，向溶液中加入四丁基溴化铵（TBAB) (0.088)，1，2-二溴乙烷(3.76(^，20.00臟〇1)和51^的50%氢氧化钠溶液。混合物在35摄氏 度搅拌Shdh之后将反应液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取两次，合并有机相溶液。然后 对有机相溶液依次用水和饱和食盐水洗涤3次，再用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩去除溶 剂得到产物粗品。产物粗品用硅胶柱层析纯化(流动相为:石油醚/丙酮=100:1. 〇，v/V)，收 集棕色集中洗脱带并挥去溶剂即得到化合物II的棕色粉末(26lmg，78% )。
[0018] 4 MMR(500MHz，DMS0-d6)S5.91(s，lH)，4.07(s，lH)，3.81(s，2H)，3.59(s，lH)， 3.43(s，2H)，3.33(s，lH)，2.26(s，lH)，1.58(d，J=9.8Hz，3H)，1.41(s，2H).
[0019] 13C 匪R(125MHz，DMS0-d6)Sl71.81(s),106.71(s)，79.95(s)，74.33(s),69.81 (s),66.68(s),44.21(s),35.56(s),33.28(s),25.85(s),21.88(s).
[0020] HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd for Ci4Hi7BrN〇4:342.0341 ；found 342.0343.
[0022] 实施例3 Virosaine A的0_(哌嗪基）乙基衍生物（III)的合成
[0023] 将化合物II(17lmg，0.5mmo 1)溶于20mL乙腈当中，向其中加入无水碳酸钾(690mg， 5.0mmol)，碘化钾（168mg，1 .Ommol)和无水哌嗪（3446mg，40mmol)，混合物加热回流3h。反应 结束后将反应液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有机相。依次用水和饱和食盐 水洗涤合并之后的有机相，再用无水硫酸钠干燥，减压浓缩去除溶剂得到产物粗品。产物粗 品用硅胶柱层析纯化(流动相为:石油醚/丙酮= 100: l.〇，v/v)，收集棕色集中洗脱带并挥 去溶剂即得到化合物III的淡棕色固体(123.2mg，71 % )。
[0024] MMR(500MHz，DMS0-d6)S5.90(s，lH)，4.04(s，lH)，3.59(s，lH)，3.50(s，2H)， 3.40(d，J=65.9Hz，lH)，2.64(s，4H)，2.54(s，2H)，2.31(s，4H)，2.22(s，lH)，1.62(s，2H)， 1.56(s，lH)，1.43(s，2H)，0.97(s，lH).
[0025] 13C NMR(125MHz，DMS0-d6)Sl71.84(s)，106.72(s)，79.94(s)，74.33(s)，66.72(d， J=9.2Hz),54.45(s),54.16(s),45.25(s),44.20(s),35.56(s),25.86(s),21.87(s).
[0026] HRMS(ESI):m/z[M+H].calcd for Ci8H26N3〇4:348.1923;found:348.1927。
[0029] 实施例4Virosaine A的0_(咪唑基）乙基衍生物（IV)的合成
[0030] 将化合物II(17lmg，0.5mmo 1)溶于25mL乙腈当中，向其中加入无水碳酸钾(690mg， 5 ? Ommo 1)，碘化钾（2 5 2mg，1 ? 5mmo 1)和咪唑（8 7 Omg，1 Ommo 1)，混合物加热回流2h。反应结束 后将反应液倒入25mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取3次，合并有机相。依次用水和饱和食盐 水洗涤合并之后的有机相，再用无水硫酸钠干燥，减压浓缩去除溶剂得到产物粗品。产物粗 品用硅胶柱层析纯化(流动相为:石油醚/丙酮= 100:0.3，v/v)，收集棕色集中洗脱带并挥 去溶剂即得到化合物IV的淡棕色固体(144. lmg，71 % )。
[0031] XH NMR(500MHz,DMS0-d6)87.86(s,lH),7.12(s,lH),6.71(s,lH),5.99(s,lH), 4.09(s,lH),3.89(d,J=16.4Hz,2H),3.80(s,2H),3.58(s,lH),3.35(s,lH),2.31(s,lH), 1.68(s,lH),1.58(s,2H),1.44(s,2H).
[0032] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)13C 匪R(125MHz，Common 匪R Solvents)Sl71.82(s), 139.64(s),128.67(s),119.31(s),106.70(s),79.92(s),74.31(s),67.61(s),66.66(s), 44.20(s),43.75(s),35.52(s),25.85(s),21.86(s).
[0033] HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for Ci7H2〇N3〇4:330.1454;found:330.1458。
[0035]实施例5组合物抗病毒活性
[0036](一)实验例:组合物对疱疹病毒的作用研究：
[0037] (1)细胞株与病毒株：
[0038] 人胚肾细胞(HEK293，为HSV-1、HSV-2病毒敏感细胞)购自美国Clontech公司；单纯 疱疹病毒1型(HSV-1)Sm44株、单纯疱症病毒2型(HSV-2)333株引自中国⑶C病毒病研究所。 [0039] (2)细胞毒性测定：
[0040] 组合物的制备：将研磨之后过200目网的20mg化合物III的粉末和研磨之后过200 目网的80mg化合物IV的粉末装入带盖的小管中并用涡轮搅拌仪混合即得到100mg组合物， 使用时用水溶解这l〇〇mg的组合物即得到组合物的溶液。
[0041]参照文献(汪受传，王霖，陈超等，清肺口服液含药血清对病毒抑制作用的实验研 究，南京中医药大学学报，2008;24(1):25~27)的方法，将各样品以2倍比做系列稀释（2<) -5)，然后按稀释顺序横向接种于96板孔中的HEK293上，每孔100uL，每稀释度纵向重复3孔 (A、B、C行），平行设微孔板D的1~6孔为细胞对照，7~12孔不接种细胞为空白对照，显微镜 下每日观察CPE，连续观察7d，中性红染色，在540nm波长测定0D值，将实验组与细胞对照组 0D值相比计算细胞存活率，用Reed-Muench方法计算药物半数细胞中毒浓度(TD 50)。
[0042] (3)抑毒试验：
[0043]参照文献(汪受传，王霖，陈超等，清肺口服液含药血清对病毒抑制作用的实验研 究，南京中医药大学学报，2008; 24( 1): 25~27)的方法，将样品按稀释顺序(2^3>14)横向接 种于96板孔中的单层细胞上，每孔100uL，每稀释度纵向重复4孔，微孔板的A、B、C行加含100 个TCID 5Q的病毒100uL作为试验组，D行补充等容量细胞维持液为不同浓度药物对照，平行设 F行作为病毒对照，E行的1~12作为细胞对照。37 °C、5 %⑶2培养，每日观察CPE，连续观察 4d。病毒对照出现90%以上CPE时，加1 %中性红染色，用酶标仪在波长540nm波长读取A值， 各组A值去除病毒对照组A值，将各试验组与细胞对照组A值相比，获得细胞存活率，用Reed-Muench方法计算半数抑毒浓度（IC 5Q)，最终将TD5Q和IC5Q相比获得抑毒指数(TI)。
[0044] (4)结果：
[0045]①样品TD5Q的测定:对照组细胞显微镜下观察贴壁生长致密、形态良好。组合物、化 合物 III 和化合物 IV 的 TD5Q 在 HEK293 分别为 2-2'34、2-2'16、2-2' 29。
[0046]②抑毒实验:对照组细胞贴壁致密、形态良好。镜下观察发现，HSV-1、HSV-2病毒对 照组分别在第3d、3d出现90%以上的CPE，HSV 1和HSV 2在HEK293CPE则以肿胀、多细胞融合 (HSV 1致多个细胞融和成大泡，而HSV 2致融合为小泡）、变圆、脱落为主要特征。
[0047]而组合物抑毒试验各组细胞，按照组合物样品稀释梯度，梯度规律出现CPE: HSV 1-HEK293在第10稀释度之前、HSV 2-HEK293组在第9稀释度之前细胞完全被保护，之后出现 CPE，CPE随样品浓度减少逐渐加重。
[0048]而化合物III和化合物IV处理组在浓度范围内才观察到抑制病毒的效应。 [0049] 将上述实验板用1%中性红染色、用酶标仪测450nmA值，各组A值减掉病毒对照组A 值后，各实验组A值与细胞对照组A值相比获得IC 5Q，IC5Q与TD5Q相比获得组合物的TI:抑制 HSV-1、HSV-2在HEK293细胞发生CPE，IC 5Q分别为2-11 ?76、2-11 ?14，TI分别为685 ? 0、445 ? 7。化合 物III的TI:对应的IC5Q分别为2i95、24' 68，TI分别为3.5、5.7。化合物1￥的11:对应的1(：50分 别为2- 4'72、2-4'88，TI 分别为5 ? 4、6 ? 0。
[0050]结论：组合物具有显著的抗疱疹科病毒（包括HSV-UHEV-2)的作用，而且安全性 高，因此组合物在治疗疱疹病毒感染疾病中具有广泛的应用背景。化合物III和化合物IV不 具有显著的抗疱疹科病毒(包括HSV-l、HEV-2)的作用，而且安全性极低，因此化合物III和 化合物IV在治疗疱疹病毒感染疾病中没有应用背景。
[0051 ](二)实验例:组合物对呼吸道合胞病毒(RSV)的作用研究
[0052] (1)组合物、化合物III和化合物IV的配置:将药物溶于细胞维持液(含2 %新生牛 血清的MEM，GIBIC0公司产品）中备用。
[0053] (2)细胞株与病毒株：
[0054] 人胚肾细胞(HEK293，RSV病毒敏感细胞)购自美国Clontech公司；呼吸道合胞病毒 (RSV)Long株引自中国⑶C病毒病研究所。
[0055] (3)细胞毒性测定：
[0056]参照文献(汪受传，王霖，陈超等，清肺口服液含药血清对呼吸道合胞病毒抑制作 用的实验研究，南京中医药大学学报，2008;24(1):25~27)的方法，将样品以2倍比做系列 稀释(2°^6)，然后按稀释顺序横向接种于96板孔中的HEK293上，每孔100uL，每稀释度纵向 重复3孔(A、B、C行），平行设微孔板D的1~6孔为细胞对照，7~12孔不接种细胞为空白对照， 显微镜下每日观察CPE，连续观察7d，中性红染色，在540nm波长测定0D值，将实验组与细胞 对照组0D值相比计算细胞存活率，用Reed-Muench方法计算药物半数细胞中毒浓度(TD 50)。 [0057] (4)抑毒试验：
[0058]参照文献(汪受传，王霖，陈超等，清肺口服液含药血清对呼吸道合胞病毒抑制作 用的实验研究，南京中医药大学学报，2008;24(1):25~27)的方法，将样品按稀释顺序(2 _2一 13)横向接种于96板孔中的单层细胞上，每孔100uL，每稀释度纵向重复4孔，微孔板的A、 B、C行加含100个TCID5Q的病毒100uL作为试验组，D行补充等容量细胞维持液为不同浓度药 物对照，平行设F行作为病毒对照，E行的1~12作为细胞对照。37°C、5%⑶2培养，每日观察 〇卩￡，连续观察4(1。病毒对照出现90%以上0?￡时，加1%中性红染色，用酶标仪在波长54〇11111 波长读取A值，各组A值去除病毒对照组A值，将各试验组与细胞对照组A值相比，获得细胞存 活率，用Reed-Muench方法计算半数抑毒浓度（IC 5Q)，最终将TD5Q和IC5Q相比获得抑毒指数 (TI)。
[0059] (5)结果：
[0060] ①样品TD5Q的测定:对照组细胞显微镜下观察贴壁生长致密、形态良好。组合物、化 合物III和化合物IV对HEK293的TD 5Q分别为T2'27、2^13、2<'65。
[0061 ]②抑毒实验:对照组细胞贴壁致密、形态良好。镜下观察发现，RSV病毒对照组在第 2d出现90%以上的CPE，RSV在HEK293CPE以折光性增强、变圆、脱落、破碎为主要特征。
[0062]而组合物抑毒试验各组细胞，按照样品稀释梯度，梯度规律出现CPE:
[0063] RSV-HEK293试验组细胞在第9稀释度之前，细胞完全被保护，之后出现CPE，CPE随 样品浓度减少逐渐加重。
[0064]而化合物III和化合物IV处理组在浓度范围内才观察到抑制病毒的效应。 [0065] 将上述实验板用1 %中性红染色、用酶标仪测450nmA值，各组A值减掉病毒对照组A 值后，各实验组A值与细胞对照组A值相比获得IC5Q，IC 5Q与TD5Q相比获得TI:组合物抑制RSV 在 HEK293细胞发生 CPE，IC5Q 为2-11 ?94，TI 为 814.6;化合物III 的 IC5Q 为2-4'36，TI 为4.7;化合物 1￥的比5()为2-4.15，1'1为2.8。
[0066]结论:组合物具有显著的抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV的作用，可以用来制备 抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV药物。化合物III和化合物IV无显著的抗副粘科病毒呼吸 道合胞病毒RSV的作用，不可以用来制备抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV药物。
[0067](三)实验例:组合物对甲型流感病毒的作用研究：
[0068] (1)细胞株与病毒株:狗肾细胞(MDCK，流感病毒敏感细胞）引自中国CDC病毒病研 究所;流感病毒甲型(Flu A) 1995. All: 32094地方株引自中国CDC病毒病研究所。
[0069] (2)细胞毒性测定：
[0070]参照文献(汪受传，王霖，陈超等，清肺口服液含药血清对病毒抑制作用的实验研 究，南京中医药大学学报，2008;24(1): 25~27)的方法，将各样品以2倍比做系列稀释（2 4-5)，然后按稀释顺序横向接种于96板孔中的MDCK上，每孔100uL，每稀释度纵向重复3孔 (A、B、C行），平行设微孔板D的1~6孔为细胞对照，7~12孔不接种细胞为空白对照，显微镜 下每日观察CPE，连续观察7d，中性红染色，在540nm波长测定0D值，将实验组与细胞对照组 0D值相比计算细胞存活率，用Reed-Muench方法计算药物半数细胞中毒浓度(TD 50)。
[0071] (3)抑毒试验：
[0072]参照文献(汪受传，王霖，陈超等，清肺口服液含药血清对病毒抑制作用的实验研 究，南京中医药大学学报，2008; 24( 1): 25~27)的方法，将样品按稀释顺序横向接种于96板 孔中的单层细胞上，每孔100uL，每稀释度纵向重复4孔，微孔板的A、B、C行加含100个TCID 50 的病毒100uL作为试验组，D行补充等容量细胞维持液为不同浓度药物对照，平行设F行作为 病毒对照，E行的1~12作为细胞对照。37 °C、5 % C02培养，每日观察CPE，连续观察4d。病毒对 照出现90 %以上CPE时，加1 %中性红染色，用酶标仪在波长540nm波长读取A值，各组A值去 除病毒对照组A值，将各试验组与细胞对照组A值相比，获得细胞存活率，用Reed-Muench方 法计算半数抑毒浓度（IC 5Q)，最终将TD5Q和IC5Q相比获得抑毒指数(TI)。
[0073] ⑷结果：
[0074]①样品TD5Q的测定:对照组细胞显微镜下观察贴壁生长致密、形态良好。组合物、化 合物III和化合物IV对的TD5Q在MDCK分别为2-3 ?19、2-2 ?83、2-2 ?65。
[0075] ②抑毒实验:对照组细胞贴壁致密、形态良好。镜下观察发现，Flu A在MDCK CPE以 折光性增强、坏死、破碎为主要特征。
[0076]而组合物抑毒试验各组细胞，按照样品稀释梯度，梯度规律出现CPE :FluA_MDCK组 细胞在第8稀释度之前细胞完全被保护，之后出现CPE，CPE随样品浓度减少逐渐加重。
[0077]而化合物III和化合物IV处理组在浓度范围内才观察到抑制病毒的效应。 [0078]将上述实验板用1 %中性红染色、用酶标仪测450nm的A值，各组A值减掉病毒对照 组A值后，各实验组A值与细胞对照组A值相比获得IC5Q，IC 5Q与TD5Q相比获得TI:组合物抑制 Flu A在MDCK细胞发生CPE，IC5Q为2-n'74，TI为374.8 ;化合物111的1(：5()为2-4'32，1'1为2.8 ;化 合物^的扣印为]-4'16，!！*〗』。
[0079] 结论:组合物对甲型流感病毒具有很强的抑制作用，而且安全，因此组合物在治疗 甲型流感病毒感染疾病中具有广泛的应用背景。化合物III和化合物IV对甲型流感病毒没 有显著的抑制作用，而且安全性极低，因此化合物III和化合物IV在治疗甲型流感病毒感染 疾病中没有应用背景。
[0080] 实施例6本发明所涉及组合物片剂的制备
[0081] 取2克组合物，加入制备片剂的常规辅料18克，混匀，常规压片机制成100片。
[0082] 实施例7本发明所涉及组合物胶囊的制备
[0083]取2克组合物，加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉18克，混匀，装胶囊制成100粒。
【主权项】
1. 一种组合物，其特征为该组合物由化合物III和化合物IV组成，该组合物中化合物 III和化合物IV的质量百分数分别为20%和80%，2. 如权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征为:将化合物III的粉末和化合物IV 的粉末按照质量百分数分别为20%和80%充分混合。3. -种如权利要求1所述的组合物在抗病毒药物中的应用。4. 如权利要求3所述的组合物在抗病毒药物中的应用，其特征在于:所述病毒为甲型流 感病毒。5. 如权利要求3所述的组合物在抗病毒药物中的应用，其特征在于:所述病毒为单纯疱 疹病毒。6. 如权利要求3所述的组合物在抗病毒药物中的应用，其特征在于:所述病毒为呼吸道 合胞病毒。7. 如权利要求5所述的组合物在抗病毒药物中的应用，其特征在于:所述单纯疱疹病毒 为单纯疱疹病毒1型或者单纯疱症病毒2型。8. 如权利要求7所述的组合物在抗病毒药物中的应用，其特征在于:所述单纯疱疹病毒 1型为单纯疱疹病毒1型的Sm44株。9.如权利要求7所述的组合物在抗病毒药物中的应用，其特征在于:所述单纯疱疹病毒 2型为单纯疱症病毒2型333株。
【文档编号】A61K31/439GK105853425SQ201610274881
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】蒋登旭
【申请人】镇江玛珂荛生物医药科技有限公司