一种体内构建组织工程软骨的方法

一种体内构建组织工程软骨的方法
【专利摘要】本发明公开了一种体内构建组织工程软骨的方法,包括如下步骤：耳软骨细胞体外大量扩增培养；复层软骨细胞膜片的制备；制作特殊形态的PCL(三维打印)内核；复层软骨细胞膜片与材料的三明治模式的制备；复合物(膜片+内核)植入动物肌肉内的手术。本发明将三维打印的材料作为内核支架，细胞膜片包裹材料后可以避免支架材料与体内组织直接接触，从而降低支架材料在体内引起的炎症反应，提高体内软骨再生的成功率。另外，通过三维打印，我们可以制作具有各种特殊形态的内核材料并构建出与其对应的组织工程软骨；同时通过调整打印层高，网格密度，走针方式等途径以及膜片叠加层数的不同使所构建的软骨具有不同的力学强度，且能达到较高水平。
【专利说明】
一种体内构建组织工程软骨的方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物组织领域，尤其涉及一种应用复层软骨细胞膜片技术结合PCL内核材料在体内构建具有特殊形态的组织工程软骨的方法。
【背景技术】
[0002]目前，在大动物体内构建大面积且具有一定力学强度的组织工程软骨成为一大难题而无法满足临床上的某些需求，比如:长段气管缺损的修复。近年来组织工程技术的兴起和快速发展为其提供了一条新思路，它采用自体细胞及材料支架预构建出具有特定形状的组织工程化软骨。但现有的构建组织工程软骨的方法由于在有效塑形，力学强度及免疫反应等方面存在诸多问题，所以尚未取得突破性进展。
[0003]现有研究指出，老化的软骨细胞在“细胞堆积”的培养状态下会出现再分化，重新表达软骨细胞特征表型并分泌特征性的软骨外基质。同时有研究报道，单纯利用软骨细胞体外复层培养可以构建片状软骨。由于该方法构建的软骨组织不含支架材料，均为自体成分可以避免非细胞因素在体内引起的炎症反应，所以是一种适用于大动物体内软骨再生的构建方法。但是，由此产生的软骨并无特定形状，同时力学强度较差，往往不能满足应用的要求。
[0004]然而，现已有许多生物材料在形态控制，力学强度及免疫反应等方面具有良好的特性。例如，聚已内酯(PCL)是由ε_己内酯经过开环聚合而成的一种新型聚合物，它不仅具有优良的生物相容性、可降解性及易加工等特点，同时它易塑形，并且力学性能良好，可以通过调整PCL三维打印层高，网格密度及走针方式等途径使其力学强度达到较大水平。通过其与复层软骨细胞膜片叠加的三明治模式形成具有特殊形态的组织工程软骨，可有效的形态控制解决力学强度及免疫反应等方面的问题。

【发明内容】

[0005]本发明的目的在于提供一种体内构建组织工程软骨的方法，用以克服上述技术缺陷。
[0006]为实现上述目的，本发明提供一种体内构建组织工程软骨的方法，具体步骤如下:
[0007]S1、耳软骨细胞体外大量扩增培养:
[0008]S11、无菌条件下切取耳廓软骨，加入3倍体积的0.25%胰蛋白酶，置于37°C恒温水浴振荡器消化30min后，用1mM磷酸盐缓冲液冲洗3遍，沉淀软骨块，除去胰蛋白酶；
[0009]SI 2、加入0.15%Π型胶原酶，以软骨细胞培养液配成相应浓度，0.22微米针式滤器过滤，置于37°C恒温水浴振荡器内消化6?8h，直至大部分软骨块被消化后，获得消化液；
[0010]S13、将所得的消化液用100微米细胞滤网过滤，1500r/min，离心5min，沉淀的细胞用含10%胎牛血清和I %三抗的高糖达尔伯克改良伊格尔培养基重悬后，以台盼蓝染色计数，并检查软骨细胞活力；
[0011]S14、在倒置显微镜下用血细胞计数器计数后调整细胞密度至lxlOVcm2的浓度接种在10mm培养皿上，在37°C，5 %⑶2，饱和湿度条件下，用软骨细胞培养液培养扩增，待软骨细胞生长至70 % -80 %融合时进行传代；
[0012]S2、复层软骨细胞膜片的制备:
[0013]S21、在原代细胞接种时留取3-4个培养皿以3.0 X 104/cm2细胞密度接种软骨细胞，这些培养皿的细胞作为基础皿，以软骨组织培养液在37°C，5%⑶2，饱和湿度条件下培养，3天后首次换液，以后隔日换液，直到构建复层软骨细胞膜片；
[0014]S22、其余原代细胞生长至70-80 %融合后传代，传代后的细胞用软骨细胞培养液培养，直至传至P3代软骨细胞；
[0015]S23、将P3代细胞消化，离心，重悬，以8X105/cm2浓度接种于之前留取的基础皿上，以软骨组织培养液培养，隔天换液;培养4周后，于培养皿中揭起一直径10mm的复层软骨细胞膜片；
[0016]S3、制作具有特殊形态的PCL内核及内支撑:
[0017]S31、将PCL颗粒材料以热熔融沉积快速成型技术结合三维电脑打印技术制成的具有特殊形态的材料支架，得到PCL内核;可通过调整内核材料的三维打印层高，网格密度，走针方式等途径改变内核的力学强度。
[0018]S32、将PCL颗粒材料以热熔融沉积快速成型技术结合三维电脑打印技术制成的无孔的具有特殊形态的支架，得到内支撑；
[0019]S4、复层软骨细胞膜片与内核材料的三明治模式复合物的制备:
[0020]采用复层软骨细胞膜片、内核材料、复层软骨细胞膜片的模式做成具有特殊形态的膜片/材料复合物，并在周边用缝线将三层固定；
[0021]S5、复合物植入动物肌肉的手术:
[0022]在将膜片/内核材料复合物植入到动物肌肉环境时，先分离出一块带血供的薄层筋膜组织包裹内支撑，再将体外构建的复合物附于其上。
[0023]进一步，在上述步骤S1.3及步骤S2.2中，所述的软骨细胞培养液配方为:在高糖DMEM培养液(Hyclone ,Thermo ,U.S.A)基础上再加入 10% 的胎牛血清(Hyclone ,Thermo ,U.S.A) ,Antib1tic soIut1n(Hyclone ,Thermo ,U.S.A) lml/lOOml，以及2ng/mlbFGF。
[0024]进一步，在上述步骤S2.1及步骤S2.3中，所述的软骨组织培养液配方为:在高糖DMEM的配方为:在高糖DMEM培养液(Hyclone，Thermo，U.S.Α)基础上再加入10 %的胎牛血清(Hyclone,Thermo,U.S.A),Antib1tic soIut1n(Hyclone,Thermo,U.S.A)lml/100ml，以及lOng/ml TGF-βΙ。
[0025]进一步，在上述步骤S1.1中，无菌条件下切取耳廓软骨，仔细剥离表面的软骨膜，剪成ImmX ImmX Imm大小的组织块，氯霉素冲洗液冲洗3遍。
[0026]进一步，在上述步骤S2.3中，将P3代细胞以8 X 105/cm2浓度接种于高密度培养的原代细胞上，以软骨组织培养液培养4周后即可构建出复层软骨细胞膜片。
[0027]进一步，在上述步骤S3中，制备的PCL内核网格间距2mm，层高0.1mm，可通过调整三维电脑打印的设置，控制内核具体形状，同时改变内核网格的层高，网格间距，走针方式。PCL内支撑管为三维打印的无孔材料支架，用做体内移植时作为组织工程软骨的内支撑。
[0028]进一步，在上述步骤S5中，复合物植入时用氯氨酮(5mg/kg)和速眠新(0.05-lml/kg)肌注麻醉，气管插管固定。行颈部正中切口切开颈前皮肤，解剖出一块带血供的薄层筋膜组织包裹内支撑，再将体外构建的具有特殊形态的复合物用PBS漂洗3遍以去除血清成分，之后附于其上。解剖同侧颈阔肌，将肌肉附于复合物表面，再用6-0可吸收缝线对合肌肉两侧缘将复合物包裹入内，仔细止血后逐层缝合关闭切口，8周后取材。术后待麻醉苏醒，拔除气管插管，情况平稳后送回饲养室密切观察，术后三天内肌注青霉素。
[0029]在另一优选例中，所述的生物可降解内核材料除了可用聚羟基乙酸(PGA)之外，还包括药学上可接受的、生物相容性良好的可降解材料，可选自下组:聚乳酸(PLA)、PLGA、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、透明质酸、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、脱细胞基质，及这些成分的各种组合等。
[0030]与现有技术相比较本发明的有益效果在于:本发明应用带PCL内核的软骨复层细胞膜片可以在体内构建具有特殊形态的组织工程软骨，既可降低支架材料在体内引起的炎症反应，同时对体内构建的组织工程软骨可以进行有效的塑形。另外，它提高了构建软骨的生物力学强度，足以满足气管支撑功能来对抗气管缺损修复术后的各种应力。
[0031]本发明拟采用的PCL内核在构建管状等特殊形态的软骨具有显著优势:(1斤(^作为内核起支架作用，可以避免支架材料与体内组织直接接触，降低支架材料在体内引起的炎症反应，提高体内软骨再生的成功率。(2)软骨在体内的成熟的过程中，PCL材料能不断降解，可避免硬质材料长期存在可能引起的不良反应；(3)该支架在常规加热(约60°C)加压的条件下可通过模具精确塑形，冷却到室温或体温后形态维持不变，显然有利于形态精确控制及维持；(4)该支架可通过三维打印制备，网孔大小，网格厚度、走针方式等关键参数均可精确调控。
[0032]本发明拟采用的复层软骨细胞膜片技术在体外构建的软骨组织不含支架材料，可以避免非细胞因素在体内引起的炎症反应，提高体内软骨再生的成功率。此外，该技术中可将软骨细胞大量扩增培养，对原代软骨细胞，即自体软骨组织的需求量明显降低。
[0033]本发明构建出的具有确定形态且足够生物力学强度的组织工程软骨，以满足临床上对组织工程软骨的各种需求，这为组织工程气管等向临床应用转化探索新的思路与方法。
【附图说明】
[0034]图1为复合物(膜片+内核)制备过程；
[0035]图中，A，B为管状PCL内核的正面观及侧面观;C为体外培养四周的复层软骨细胞膜片;D，E，F为复合物的正面观，侧面观及底面观。
【具体实施方式】
[0036]为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0037]软骨形成细胞
[0038]本发明中软骨形成细胞的来源没有特别限制，可以是人或动物的软骨细胞，可来源于关节软骨、肋软骨、耳软骨、鼻中隔软骨、气管软骨等各种软骨组织;也可以是具有软骨分化潜能的人或动物其它种类细胞，可来源于骨髓、脂肪、肌肉、皮肤等组织。一种优选的来源是来自人或动物的耳软骨或关节软骨。
[0039]分离获得软骨细胞的方法是文献多次报道的公认方法。一种优选的方法是全麻或局麻下无菌切取软骨组织，经磷酸缓冲液(PBS)清洗后，加入3倍软骨体积的胶原酶溶液(浓度一般在0.5-3mg/ml，以PBS或培养液配制)，37°C恒温振荡消化4_20小时(依软骨组织的来源及消化进展程度而定)，过滤收集软骨细胞悬液，离心、洗涤、台盼蓝染色、显微镜下计数，原代软骨细胞活力一般应在80%以上。将干细胞诱导分化成软骨细胞的方法也是本领域常规的方法。
[0040]软骨细胞的培养、传代方法和培养液也是本领域中熟知的。一种优选的方法是将软骨细胞在C02培养箱内培养。合适的培养液包括(但并不限于):I )F-12培养基或DMEM培养基+5%-20%胎牛血清;2)F-12培养基或DMEM培养基+5%-20%自体(或异体)人血清；3)F-12/DMEM培养基(1:1)+2%-20%胎牛血清或人血清。一类特别优选的软骨细胞是体外分离培养的原代-第3代的软骨细胞。此时的软骨细胞功能和活力均良好，具有很强的软骨形成能力，经免疫细胞化学染色证明有II型胶原表达，RT-PCR及原位杂交检测证明有II型胶原及蛋白聚糖(aggrecan)mRNA的表达。
[0041]生物可降解内核材料
[0042]可用于构建本发明组织工程化软骨的材料是医学上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于):
[0043](a)可降解性合成高分子材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、PLGA、聚羟基丁酸(PHB)、聚酸酐(口015^]1117(114(168)、聚偶磷氮(。015^1108。113261168)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烧(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、透明质酸、聚对二氧六环酮(po Iyd1xanone)等；
[0044]( b )天然可降解材料，例如胶原(c ο 11 a g e η )、明胶(g e I a t i η )、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸盐以及各种脱细胞基质等；
[0045](C)上述材料的共聚物或复合型材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合材料，以及固体材料与可注射性材料的复合材料。
[0046]优选的医学上可接受的生物可降解材料是固体材料或固体、液体复合材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、胶原等。当材料为固体型材料时，可以直接将材料预制成需要的大小与形状，也可以通过计算机辅助及快速成型技术定制的模型对材料进行精确的塑性。
[0047]实施例
[0048]S1、羊耳软骨细胞分离与培养；
[0049]S1.1、无菌切取山羊约2cmX 2cm大小的耳软骨片，将其剪碎成Imm3软骨块，用氯霉素溶液反复冲洗后加入3倍体积的0.25%胰蛋白酶，置于37°C恒温水浴振荡器消化30min，以去除软骨组织外的纤维结缔组织，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3遍，沉淀软骨块，除去膜蛋白酶；
[0050]S1.2、加入0.15%Π型胶原酶，以软骨细胞培养液配成相应浓度，0.22微米针式滤器过滤，立即使用，置于37°C恒温水浴振荡器内消化6?8h;
[0051]S1.3、直至大部分软骨块被消化后，获得的消化液用100微米细胞滤网过滤，1500r/min，离心5min，沉淀的细胞用含10%胎牛血清和1%三抗的高糖达尔伯克改良伊格尔培养基重悬，所得细胞以台盼蓝染色计数，并检查软骨细胞活力，在倒置显微镜下用血细胞计数器计数后调整细胞密度至lxl04/cm2的浓度接种在10mm培养皿上，在37°C，5%C02，饱和湿度条件下，用软骨细胞培养液培养扩增，待软骨细胞生长至70%-80%融合时进行传代(图一A、B)；
[0052]S2、复层软骨细胞膜片的制备
[0053]S2.1、在原代细胞接种时留取3-4个培养皿(10mm)以3.0 X 104/cm2细胞密度接种软骨细胞，这些培养皿的细胞作为基础皿，以软骨组织培养液37 °C，5 % C02，饱和湿度条件下培养，3天后首次换液，以后隔日换液，直到构建复层软骨细胞膜片；
[0054]S2.2其余原代细胞生长近70-80%融合后传代，传代后的细胞用软骨细胞培养液培养，直至传至P3代软骨细胞；
[0055]S2.3、将P3代细胞消化，离心，重悬，以8 X 1Vcm2浓度接种于之前留取的基础皿上，以软骨组织培养液培养，隔天换液;培养4周后，于培养皿中揭起一直径10mm的复层软骨细胞膜片(图1中的C);
[0056]S3、制作管状PCL内核及内支撑管;PCL内核是PCL颗粒材料以热熔融沉积快速成型技术结合三维电脑打印技术制成的网格状多孔管状支架，可通过调整内核材料的三维打印层高，网格密度，走针方式等途径改变内核的力学强度。PCL内支撑管为同样方法制备的无孔的管状支架。
[0057]S4、复层软骨细胞膜片与管状材料的三明治模式复合物的制备;采用复层软骨细胞膜片、管状材料、复层软骨细胞膜片的模式做成管状膜片/材料复合物，并在周边用缝线将三层固定(图1中的D，E，F);
[0058]S5、以PCL管作为内支撑管，将管状膜片/PCL复合物植入到羊气管旁肌肉内的手术;在将管状膜片/PCL内核材料复合物植入到动物颈部肌肉环境时，先分离出一块带血供的薄层筋膜组织包裹内支撑管，再将体外构建的管状复合物附于其上。8周后取材进行相关检测评估。
[0059]结果表明，大体观可见已经形成管状软骨，且其内外表面均为瓷白色，均质成熟软骨。组织学检测HE染色显示，形成的软骨组织均匀分布陷窝样结构，并且并未出现明显的炎症细胞浸润。力学强度检测结果证明，其可达到较大水平。
[0060]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种体内构建组织工程软骨的方法，其特征在于，包括如下步骤: 51、耳软骨细胞体外大量扩增培养: S11、无菌条件下切取耳廓软骨，加入3倍体积的0.25%胰蛋白酶，置于37°C恒温水浴振荡器消化30min后，用1mM磷酸盐缓冲液冲洗3遍，沉淀软骨块，除去胰蛋白酶； SI2、加入0.15%Π型胶原酶，以软骨细胞培养液配成相应浓度，0.22微米针式滤器过滤，置于37°C恒温水浴振荡器内消化6?8h，直至大部分软骨块被消化后，获得消化液； 513、将所得的消化液用100微米细胞滤网过滤，1500r/miη，离心5miη，沉淀的细胞用含10%胎牛血清和1%三抗的高糖达尔伯克改良伊格尔培养基重悬后，以台盼蓝染色计数，并检查软骨细胞活力； 514、在倒置显微镜下用血细胞计数器计数后调整细胞密度至lX104/cm2的浓度接种在10mm培养皿上，在37°C，5 %⑶2，饱和湿度条件下，用软骨细胞培养液培养扩增，待软骨细胞生长至70 % -80 %融合时进行传代； 52、复层软骨细胞膜片的制备: 521、在原代细胞接种时留取3-4个培养皿以3.0X 104/cm2细胞密度接种软骨细胞，以软骨组织培养液在37°C，5%⑶2，饱和湿度条件下培养，3天后首次换液，以后隔日换液，直到构建复层软骨细胞膜片； 522、其余原代细胞生长至70-80%融合后传代，传代后的细胞用软骨细胞培养液培养，直至传至P3代软骨细胞； 523、将P3代软骨细胞消化，离心，重悬，以8X 105/cm2浓度接种于之前留取的基础皿上，以软骨组织培养液培养，隔天换液;培养4周后，于培养皿中揭起一直径10mm的复层软骨细胞膜片； 53、制作具有特殊形态的PCL内核及内支撑管: 531、将PCL颗粒材料以热熔融沉积快速成型技术结合三维电脑打印技术制成的具有特殊形态的材料支架，得到PCL内核； 532、将PCL颗粒材料以热熔融沉积快速成型技术结合三维电脑打印技术制成无孔的具有特殊形态的支架，得到内支撑管； 54、复层软骨细胞膜片与内核材料的三明治模式复合物的制备: 采用复层软骨细胞膜片、内核材料、复层软骨细胞膜片的模式做成具有特殊形态的膜片/材料复合物，并在周边用缝线将三层固定； 55、复合物植入动物肌肉的手术: 在将具有特殊形态的膜片/内核材料复合物植入到动物肌肉环境时，先分离出一块带血供的薄层筋膜组织包裹内支撑，再将体外构建的复合物附于其上。2.根据权利要求1所述的一种体内构建组织工程软骨的方法，其特征在于，所述的软骨细胞培养液配方为:在高糖DMEM培养液基础上再加入10%的胎牛血清，Antib1ti csolut1n lml/100ml，以及2ng/mlbFGF03.根据权利要求1所述的一种体内构建组织工程软骨的方法，其特征在于，所述的软骨组织培养液配方为:在高糖DMEM培养液基础上再加入10%的胎牛血清，Antib1ti csolut1nlml/lOOml，以及 10ng/ml TGF-βΙ。4.根据权利要求1所述的一种体内构建组织工程软骨的方法，其特征在于，在上述步骤S1.1中，无菌条件下切取耳廓软骨，仔细剥离表面的软骨膜，剪成ImmX ImmX Imm大小的组织块，氯霉素冲洗液冲洗3遍。5.根据权利要求1所述的一种体内构建组织工程软骨的方法，其特征在于，在上述步骤S2.3中，将P3代细胞以8 X 105/cm2浓度接种于高密度培养的原代细胞上，以软骨组织培养液培养4周后即可构建出复层软骨细胞膜片。6.根据权利要求1所述的一种体内构建组织工程软骨的方法，其特征在于，在上述步骤S3中，制备的PCL内核的网格间距2mm，层高0.Immο7.根据权利要求1所述的一种体内构建组织工程软骨的方法，其特征在于，所述步骤S5中，复合物植入时用5mg/kg的氯氨酮和0.05-lml/kg的速眠新肌注麻醉后，通过气管插管固定。
【文档编号】A61L27/50GK105854085SQ201610261335
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月25日
【发明人】曹谊林, 周广东, 李丹, 殷宗琦, 刘浥, 刘豫
【申请人】上海国睿生命科技有限公司