古日古木-13促进肝再生的应用及作用机制评价方法
【专利摘要】本发明提供古日古木?13在促进肝再生上的应用及其作用机制的评价方法，(1)将实验鼠分为分为12组；(2)对PH手术组的小鼠进行70％肝大部切除术，假手术组采用剖腹探查术，空白对照组不进行处理；(3)对所有实验动物按分组给古日古木高、中、低剂量试剂和溶剂，每天1次；(4)灌胃第1、3、5、7、9天分别断头取血，完整切取肝脏称重；(5)取一小部分肝称重，用盐水匀浆，测SOD、MDA、NO，另取部分肝组织福尔马林固定后，HE染色进行组织病理学检测；(6)检测血请中各种生化指标、细胞因子表达情况、计算肝指数、观察小鼠肝脏细胞的增殖、凋亡和分化。本发明的有益效果是丰富了古日古木的药用价值。
【专利说明】
古曰古木-13促进肝再生的应用及作用机制评价方法
技术领域
[0001]本发明属于医药技术领域，尤其是涉及一种古日古木-13促进肝再生的应用及作用机制评价方法。
【背景技术】
[0002]古日古木-13(别名红花清肝十三味丸)是蒙医传统药方，出自《中华人民共和国卫生部药品标准》(蒙药分册)。本药气香，味苦、涩，性凉，由红花、丁香、莲子、麦冬、木香、诃子、川楝子、栀子、紫檀香、麝香、水牛角浓缩粉、牛黄、银朱组成。具有清热、解毒、凉血之功效。该药对各种肝热症、配毒症及肝功减退都有作用，尤以血热引起的眼病为甚，亦对“亚玛病”之肾伤、尿频有效。目前，对蒙药古日古木-13研究主要集中在酒精性肝病、病毒性肝炎、胆汁淤积性肝炎、高血压病、药物性肝损伤、急性肝损伤伤、老年性高血脂等病，而对肝再生的研究鲜有报道。
[0003]本发明拟通过对小鼠进行肝大部分切除术从而建立动物模型，分别给予实验动物高、中、低剂量蒙药古日古木-13，一周后检测血中各种生化指标、细胞因子的表达情况、计算肝指数、观察动物肝脏细胞的增殖、凋亡和分化的指标，并对对动物的肝脏进行油红O染色；同时分别用不同剂量的蒙药古日古木-13处理肝癌细胞HepG2，观察其对细胞增殖、分化和凋亡的影响。
【发明内容】
[0004]本发明通过动物实验和细胞实验两个方面，探讨蒙药古日古木-13对肝再生的影响及可能机制，为蒙药古日古木-13的进一步药用开发开拓新的途径，为丰富肝再生的理论及临床上肝衰竭的治疗提供新的思路。
[0005]本发明的技术方案是:
[0006]古日古木-13在促进肝再生上的应用。
[0007]本发明的另一方面还包括古日古木-13影响肝再生作用机制的评价方法，包括以下步骤:动物实验:(l)C57BL/6小鼠60只，雌雄各半，实验室适应性喂养5d后，随机分为12组，每组5只，分为PH手术-古日古木高剂量组，PH手术-古日古木中剂量组，PH手术-古日古木低剂量组，PH手术-溶剂对照组，假手术-古日古木高剂量组，假手术-古日古木中剂量组，假手术-古日古木低剂量组，假手术-溶剂对照组，和空白对照-古日古木高剂量组，空白对照-古日古木中剂量组，空白对照-古日古木低剂量组，空白对照-溶剂对照组；
[0008](2)对PH手术组的小鼠进行经典的70%肝大部切除术，假手术组采用剖腹探查术，空白对照组不进行手术处理；
[0009](3)待小鼠苏醒恢复后对所有实验动物按分组给古日古木高、中、低剂量试剂和溶剂，每天I次；
[0010](4)灌胃第1、3、5、7、9天五个时间点后分别断头取血，并完整切取小鼠肝脏并称重；[0011 ] (5)取一小部分肝称重，用-4°c的盐水匀浆，按说明书的方法测S0D、MDA、N0。另取部分肝组织用10%福尔马林固定后，HE染色进行组织病理学检测；
[0012](6)检测血请中各种生化指标、细胞因子的表达情况、计算肝指数、观察小鼠肝脏细胞的增殖、凋亡和分化的情况；
[0013]细胞实验:同时分别用不同剂量的蒙药古日古木-13处理肝癌细胞HepG2，观察其对细胞增殖、分化和凋亡的影响。
【附图说明】
[0014]图1a-图1g，利用所有实验数据统计 ALT，AST，GLU，TG，CHOL，HDL，LDL。
[0015]图2a-图2g，除去蓝色底纹(极端值)和黑鼠值后ALT，AST，GLU，TG，CHOL，HDL，LDL的统计结果
【具体实施方式】
[0016]下面结合附图对本发明做详细说明。
[0017]1、实验动物分组与处理
[0018]C57BL/6小鼠60只，雌雄各半，实验室适应性喂养5d后，随机分为12组，每组5只，分为PH手术-古日古木高剂量组，PH手术-古日古木中剂量组，PH手术-古日古木低剂量组，PH手术-溶剂对照组，假手术-古日古木高剂量组，假手术-古日古木中剂量组，假手术-古日古木低剂量组，假手术-溶剂对照组，和空白对照-古日古木高剂量组，空白对照-古日古木中剂量组，空白对照-古日古木低剂量组，空白对照-溶剂对照组，古日古木高、中、低剂量组分别为1600mg/(kg.d—工)，800mg/(kg.d—工)，400mg/(kg.d—工)。对所有实验动物按分组给古日古木高、中、低剂量试剂和溶剂，每天I次，共灌胃7天。
[0019]然后对PH手术组的小鼠进行经典的70%肝大部切除术，假手术组采用剖腹探查术，空白对照组不进行手术处理，待小鼠苏醒恢复后对所有实验动物按分组给古日古木高、中、低剂量试剂和溶剂，每天I次，灌胃第1、3、5、7、9天五个时间点后分别断头取血，并完整切取小鼠肝脏并称重。取一小部分肝称重，用-4°C的盐水匀浆，按说明书的方法测S0D、MDA、NO。另取部分肝组织用10%福尔马林固定后，HE染色进行组织病理学检测。检测血请中各种生化指标、细胞因子的表达情况、计算肝指数、观察小鼠肝脏细胞的增殖、凋亡和分化的情况。
[0020]2、肝大部切除术
[0021]PH手术组小鼠饥饿过夜，用体重计称重，并标记。用Iml无菌空针抽取4%水合氯醛溶液，按8yl/g在腹腔内注射，小鼠完全麻醉倒后(约l-3min)，采取仰卧位，将其固定于操作台上，注意观察小鼠胸廓起伏情况，以此来判断其呼吸及心跳情况。麻醉后用用小剪刀或脱毛剂去除小鼠胸部至下腹部毛发，安尔碘消毒腹部三次，后一次消毒范围应小于前一次强力碘消毒区域，消毒好的小鼠从剑突下做横行正中切口，切口长约l-2cm，充分显露肝脏，剪开镰状韧带至下腔静脉前方。挤出小鼠肝脏，用棉签抬起左外叶，剪开肝脏脏面的肝胃韧带和部分肝左侧冠状韧带，此时肝左外叶基本游离。取I号丝线置于肝脏脏面，绕过左外叶，在肝脏膈面尽量靠近根部结扎，剪下肝左外叶。同时抬起肝左中叶和右中叶，从脏面绕过I号丝线，在肝脏膈面靠近根部处结扎，剪下这两叶。这样就达到了肝脏大部切除(近70 % )。用棉签清除腹腔内出血，查看无活动性出血后，用O号丝线分别缝合腹膜和腹壁。用酒精棉球擦去小鼠切口处血液，防止小鼠咬破切口处缝线。术后将PH实验组小鼠放回鼠笼，并置于灯光下促进小鼠苏醒。保持室内温度于25°C-30°C，并给与自由进食水，观察小鼠的存活状态。
[0022]3、剖腹探查假手术组
[0023]假手术组(剖腹探查术组)小鼠饥饿过夜，用体重计称重，并标记。用Iml无菌空针抽取4%水合氯醛溶液，按8yl/g在腹腔内注射，小鼠完全麻醉倒后(约l-3min)，采取仰卧位，将其固定于操作台上，注意观察小鼠胸廓起伏情况，以此来判断其呼吸及心跳情况。用小剪刀或脱毛剂去除小鼠胸部至下腹部毛发，安尔碘消毒腹部三次，后一次消毒范围应小于前一次强力碘消毒区域。消毒好的小鼠从剑突下做横行正中切口，切口长约l-2cm，充分显露肝脏，。再将小鼠肝脏重新放回小鼠腹腔内，注意观察有无出血情况的发生。用O号丝线分别缝合腹膜和腹壁。用酒精棉球擦去小鼠切口处血液，防止小鼠咬破切口处缝线。术后将假手术组小鼠放回鼠笼，并置于灯光下促进小鼠苏醒。保持室内温度于25°C-30°C，并给与自由进食水，观察小鼠的存活状态。
[0024]4、生化指标的检测
[0025]取得的血液在3500r/min，离心1min，血清测ALT，AST，总蛋白和白蛋白；取一小部分肝称重，用_4°C的盐水匀浆，按说明书的方法测S0D、MDA、N0。另取部分肝组织用10%福尔马林固定后，HE染色进行组织病理学检测。
[0026]5、统计学分析
[0027]如图1a-图lg，图2a_图2g所示，采用SPSS22.0统计软件进行分析。计量资料以均数土标准差表示，ALT，AST，GLU，TG，CHOL，HDL，LDL等定量差异比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
[0028]以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
【主权项】
1.古日古木-13在促进肝再生上的应用。2.古日古木-13影响肝再生作用机制的评价方法，其特征在于:包括以下步骤:动物实验:(I )C57BL/6小鼠60只，雌雄各半，实验室适应性喂养5d后，随机分为12组，每组5只，分为PH手术-古日古木高剂量组，PH手术-古日古木中剂量组，PH手术-古日古木低剂量组，PH手术-溶剂对照组，假手术-古日古木高剂量组，假手术-古日古木中剂量组，假手术-古日古木低剂量组，假手术-溶剂对照组，和空白对照-古日古木高剂量组，空白对照-古日古木中剂量组，空白对照-古日古木低剂量组，空白对照-溶剂对照组； (2)对PH手术组的小鼠进行经典的70%肝大部切除术，假手术组采用剖腹探查术，空白对照组不进行手术处理； (3)待小鼠苏醒恢复后对所有实验动物按分组给古日古木高、中、低剂量试剂和溶剂，每天I次； (4)灌胃第1、3、5、7、9天五个时间点后分别断头取血，并完整切取小鼠肝脏并称重； (5)取一小部分肝称重，用-4°C的盐水匀浆，按说明书的方法测SOD、MDA、NO，另取部分肝组织用10%福尔马林固定后，HE染色进行组织病理学检测； (6)检测血请中各种生化指标、细胞因子的表达情况、计算肝指数、观察小鼠肝脏细胞的增殖、凋亡和分化的情况； 细胞实验:同时分别用不同剂量的蒙药古日古木-13处理肝癌细胞HepG2，观察其对细胞增殖、分化和凋亡的影响。
【文档编号】A61K35/32GK105998616SQ201610447439
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】张海峰, 边浩
【申请人】张海峰