去除生物膜的方法

专利名称：去除生物膜的方法
发明的背景本发明涉及其表面易于作为支持生物膜沉积的设备和食品的消毒和去污领域。
现有技术的描述此种设备和/或仪器例如是用于医学领域的设备仪器，如分析仪器和诸如可重复使用的医学装置等任何设备，例如透析发生器以及植入物(眼睛植入物、心脏瓣膜)和假器官。牙科所用设备，甚至粘膜和牙齿本身，无论是天然或是假器官，也易于成为生物膜沉积部位。也可提及的是食品和/或制药业中所用的设备以及空调装置，更常见是任何接触水介质易含有细菌悬浮液的设备。
目前主要的问题是去除附着在设备、仪器和/或粘膜表面的生物物质形成的生物膜，这种生物膜构成持久感染和/或污染的原因。这是因为水介质中任何悬浮的细菌具有粘附其遇到的支持物的性能而形成生物膜。此生物膜是细菌在表面的凝聚，这些细菌由胞外多糖基质包围；生物膜形成是一种自然现象。一旦形成生物膜，很难去除。
目前已提议的抗击生物膜的去污染和/或消毒方法尽管有一定程度的效果，特别是从抗菌观点出发，然而，它们不能去除支持物上的生物膜，从而激励了其再发展，在血液透析的特定情况中，表面留下热原支持物。
在一些仪器或设备中，碳酸钙或碳酸镁形成的积垢也增强了生物膜。
然而，目前使用能增强纯消毒溶液作用的脱钙液处理某些设备不能完全去除此种生物膜，除非使用产品如漂白剂，尽管漂白剂有效抗生物膜作用，但常常可能破坏医学仪器和设备。此外，这些溶液不能用在与组织接触的表面上和/或直接用于粘膜上。
L.F.Jacquelin，Pathologie Biologie，1994年5月，425页提出连续使用酶和酚消毒剂来破坏生物膜。C.Johansen，Applied and Environmental Microbiology，1997年9月，3724页提出使用酶类合如葡糖氧化酶和乳过氧化物酶。WO 01/53010提出去除生物膜的酶方法，包括使用属于糖酶和蛋白酶类的酶，连续使用它们以及结合或单独使用属于生物杀灭剂、螯合剂和其它清洗剂的试剂。同样，EP 1186574提出去除接触水的表面上生物膜的方法，其特征在于它包括采用酶活性原理的清洁剂和用消毒剂清洁以图杀死通过酶混合物作用释放的细菌，但所得结果不令人满意，目前没有方法或产品能去除这些生物膜。
本发明可解决此问题，通过使用一种方法和选择产品，能获得迄今为止从未达到的有效去除水平。
发明概述本发明涉及一种去除生物膜的方法，该方法包括至少同时或连续进行的下列步骤，a)制备一种包含酶混合物的溶液，该酶混合物含至少1种选自蛋白酶类的酶、至少1种选自酯酶类的酶和一种淀粉酶；b)制备含有碱性pH去污剂的溶液；c)将所述溶液通过洗涤或循环应用到待处理表面。
在一种变化中，本发明的方法还包括同时或连续进行的下列步骤d)制备包含能溶解矿物盐沉积的酸的溶液；e)将所述溶液通过洗涤或循环应用到待处理表面。
本发明也涉及-本发明方法中的酶选自蛋白酶类的外肽酶或内肽酶，如胰蛋白酶；-本发明方法中的选自酯酶类的酶，是羧酸酯水解酶如脂肪酶，磷脂酶和/或膦酸二酯酶(phosphonodiesterase)如核糖核酸酶。
-本发明方法中的酶混合物还包括选自甙酶或碳水化合物酶的酶，如葡糖苷酶和半乳糖苷酶；-本发明方法中的酶混合物是胰酶制剂；-本发明方法中的去污剂是含表面活性剂的碱性溶液；-本发明方法中的去污剂是含表面活性剂和季铵的碱性溶液；-本发明方法中的去污剂还包括消毒剂如次氯酸钠或次氯酸钾溶液。
在一种变化中，该方法包括用酸溶液洗涤去除矿物盐沉积的步骤，酸选自柠檬酸、过乙酸、乙醇酸和羟基乙酸。
本发明也涉及用于去除生物膜的试剂盒，该试剂盒包括至少1种酶混合物溶液和至少1种碱性pH去污剂溶液，所述酶混合物含至少1种选自蛋白酶类的酶、至少1种选自酯酶类的酶和一种淀粉酶。
本发明还涉及-本发明试剂盒中的酶选自蛋白酶类的外肽酶或内肽酶，如胰蛋白酶；-本发明试剂盒中的选自酯酶类的酶，是羧酸酯水解酶如脂肪酶，磷脂酶和/或膦酸二酯酶如核糖核酸酶。
-本发明试剂盒中的酶混合物还包括选自甙酶或碳水化合物酶的酶，如葡糖苷酶和半乳糖苷酶；-本发明试剂盒中的酶混合物是胰酶制剂；-本发明试剂盒中的去污剂是含表面活性剂的碱性溶液；-本发明试剂盒中的去污剂是含表面活性剂和季铵的碱性溶液；-本发明的试剂盒还包括消毒剂溶液如次氯酸钠或次氯酸钾溶液；-本发明的试剂盒还包括能溶解矿物盐如碳酸钙沉积的酸性溶液；-本发明试剂盒中的能去除矿物盐沉积的酸溶液中，酸选自柠檬酸、过乙酸、乙醇酸和羟基乙酸。
所述酶混合物优选以0.1-10％重量/体积之间的浓度使用；去污剂优选以0.1-30％体积/体积之间的浓度使用；当后者还包括消毒剂时，消毒剂优选以0.01-2％的浓度加入。
发明方法含酶混合物溶液的应用时间在5分钟至1小时之间，取决于生物膜类型、溶液的新旧和材料；此种应用优选在室温和40℃之间的温度进行，优选37℃。
含有碱性pH去污剂的溶液的应用时间不同，从5分钟到24小时，温度在室温和90℃之间，取决于生物膜类型和被处理材料。
本发明也涉及用于去除生物膜的组合物，其特征在于它包含酶混合物和碱性pH去污剂，所述酶混合物含至少1种选自蛋白酶类的酶、至少1种选自酯酶类的酶和一种淀粉酶。
更具体说，本发明的组合物特征是该酶混合物是胰酶制剂。
在本发明的一个变化中，所述溶液包含该酶混合物，所述溶液含有来自单一溶液的去污剂；本发明也涉及用于去除生物膜的组合物，该方法包括酶混合物和碱性pH去污剂，所述酶混合物含至少1种选自蛋白酶类的酶、至少1种选自酯酶类的酶和一种淀粉酶。
在一个特定实施方案中，本发明方法中的去污剂是含表面活性剂的中性溶液或酸性溶液；在此变化中，当去污剂是酸性溶液时且水垢现象很严重时，能溶解矿物盐而不需另外步骤。
较佳实施方案的描述术语“生物膜”理解为指一批在支持物上生长的微生物，特别是细菌、病毒、寄生虫和真菌。此种生物膜可生长，微生物则分泌含胞外多糖的胞外聚合物基质，会形成称为“粘质”或“糖萼(glycocalix)”的生物膜和以胶状形式沉积在壁表面上。
术语“胰酶制剂”理解为指胰脏提取物，含有胰腺的所有消化酶特别是蛋白水解酶或蛋白酶以及水解酶，特别是酯酶，如脂肪酶、淀粉酶和核糖核酸酶、和胰蛋白酶。参见欧洲药典中给出的定义。
术语“去污剂”理解为指任何产品，其组成特别设计用于产生去垢现象，它包括作为主要成分的表面制剂，该表面制剂是表面活性剂，任选含有有其它成分(各种辅佐剂、增强剂、填料和添加剂)。表面活性剂是化学化合物，当引入液体时会降低其表面张力，具有增加润湿性的效果。
术语“碱性pH”理解为指pH大于7的水溶液，本发明中优选pH大于或等于9。
术语“去除生物膜”理解为指从支持物上脱去生物膜。
本发明的方法有效性用如下所述实验测试。
测试该方法在5类生物膜上完成此实验；生物膜1、2、3和5用模拟血液透析发生器的体外模型获得-生物膜1富含营养物，用于加速生长(3天)、中等厚度(约105CFU/cm2)，粘质很丰富；-生物膜2不富含营养物，生长超过1个月，相当于在透析发生器中实际遇到的情况(约103CFU/cm2)，水垢结晶很丰富；-生物膜3富含营养物，用于加速生长(5天)、厚(约109CFU/cm2)，粘质很丰富；-生物膜4血液透析管道运输水的样本，取自中央，覆盖约103CFU/cm2的生物膜，生长超过1年；
-生物膜5富含营养物，用于加速生长，在“预防”模型中生长超过3周。
体外模型的产生250ml反应容器充满未消毒的透析液，通过用未消毒渗滤水稀释消毒的无热原的血液透析浓缩剂(Clearflex，购自Bieffe Medical)制成，在实验室中连续产生的，该渗滤水含有恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和栖稻黄色单胞菌(Flavimonas orizibitans)。
污染介质在硅胶管回路的闭合圈中循环，硅胶管长1.5米内径5mm，蠕动泵流速为500ml/分钟。所有管道和反应容器高压灭菌器中121℃预先灭菌30分钟。因此，水中细菌天然污染的透析液是微生物的唯一来源。
整个系统通过加热板维持于37℃的温度，反应容器置于加热板上。
在生物膜1、3和5的情况中，通过加入稀释50倍的LB培养基细菌生长因而产生生物膜加速，即LB培养基稀释5倍并用相当于透析液1/10的水流加满。透析液和培养基满载流速用蠕动泵调节，分别为5和0.5ml/分钟。
在生物膜5的情况中，模型以下列方式修饰使富含培养基的未消毒透析液流经与聚丙烯联接器连接在一起的硅胶管区段流动4小时。每4小时，断开管道并集装到消毒系统中(见下)。处理后，再连接管道使污染培养基恢复循环流动4小时。将平行试验的未经消毒的对照管道加入循环中。因此，每天能完成2次血液透析，每次因消毒而中断。透析过夜和在周末时，该系统在最后一次消毒后停止运行管道在室温保持空置。运转该系统直到对照管道产生了成熟的生物膜。
测试的产品和组合物测试了属于6个不同家族的17种产品。这些产品的列表在表I中给出。单独或组合评估这些产品。因此，在生物膜1上完成了全部60种组合的筛选；在生物膜2上评估了9种组合；最后，在生物膜3、4和5上测试了所选的最佳组合。
表I测试产品列表
取样将覆盖生物膜1、2和3的管道切成5cm长度的区段。为在生物膜1和2上筛选，通过抽签(drawing lots)选出待研究的各区段用各种处理之一种处理。从硅胶管圈随机取对照样本保持不作处理。
样本处理待处理的管道区段连接于以下结构的下降段，该结构由2个管道-(1个上升另1个下降)、蠕动泵和水浴(在高于20℃的温度进行处理)组成。要在“再循环”模式中测试的产品溶解于100ml烧瓶并用蠕动泵以500ml/分钟的速度推动液在管道中封闭循环流动，持续时间对应于表II给出的接触时间。将要在“静态”模式中测试的产品溶解于100ml烧瓶并用蠕动泵推动，直到充满管道；然后关掉泵使，产品静止停留所需接触时间。每次对给定产品处理后，用渗滤水冲洗管道样品5分钟。
评估处理效果的方法采用3种基本参数评估处理的效果覆盖区域的减少；可培养细菌数量的减少；内毒素水平的减少。
在生物膜1和2上的筛选仅考虑第1个参数。随后深入评估采用的最佳组合对细菌死亡率和内毒素消除的效果。
定量测定覆盖区域的方法染色对照和处理的生物膜-用0.25％结晶紫溶液；-或用Baclight荧光染料溶液(Syto 9和碘化丙锭)。活细菌呈现绿色，而死亡细菌表现为黄或红色。
将染色生物膜覆盖的硅胶管样品置于载玻片上在光学显微镜下观察，显微镜连接照相机和“Scion Images”图像分析软件。因此，折摄了同一样品的若干(6到10张)照片，用图像分析软件定量评估染色区域计算出每样品的平均覆盖面积。将此平均值与未处理对照样品的覆盖区域比较计算出覆盖面积减少的百分比。
此外，为了作更精确的检测，在激光共焦显微镜下观察最有效组合处理的样品。
定量测定可培养细菌的方法用机械刮刀，确保完整、一致和可重复性分离。该刮刀由动力螺丝刀组成，使螺丝刀末端固定有可火焰消毒的不锈钢抹刀。通过在管道腔内旋转抹刀，生物物质将推到无菌管的底部。无菌水流可促进此作用。然后用注射器针头分离任何细菌集聚体。通过计算所得细菌悬浮液接种在R2A琼脂上室温培养7天后的CFU测定可培养细菌的数量。
更精确地，证明在平板培养后未污染的样本充分过滤且滤膜在R2A琼脂上室温培养7天。
内毒素测定方法通过标准化的参考试验定量测定了分离得到的(见上)细菌悬浮液中的细菌内毒素，即动力学显色LAL试验(Charles River Endosafe)。
对生物膜1和2的研究结果在生物膜1和2上的筛选结果见表II和III。
表II在生物膜1上的筛选
+＝混合物；和＝连续应用表III在生物膜2上的筛选
这些筛选试验后采用的组合是能最佳去除2种生物膜的组合，即下列“组合K”产品A＝胰酶制剂，Sigma出售的实验室反应物猪胰脏提取物，即酶混合物，含脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、胰蛋白酶、核糖核酸酶等(参见欧洲药典)。
产品B＝柠檬酸在消毒透析发生器的具体例子中，此产品作用为脱钙剂，可去除栓理细菌的水垢结晶，并促进生物膜粘附于底座。
产品C＝RBS，发泡碱性去污剂溶液，Chemical Products出售，表现出杀菌、杀病毒和杀真菌性能，含表面活性剂和季铵(消毒剂)。
定性和定量测定数据组合K作用之前和之后的生物膜1和2照片能目测定量该组合的作用。
表IV给出组合K作用之前和之后测量的诸参数值。
表IV评估组合K对生物膜1和2的效果的定量数据表IVa)生物膜1
表IVb)生物膜2
测定RBS的MIC由于此组合的抗菌能力是由RBS提供的，在构成该受检生物膜的微生物上测定其最小抑制浓度。
制备污染的新鲜透析液(用未灭菌的含上述微生物的渗透水制备，)与LB培养基的混合物，比例为50/50 v/v。通过级联稀释产生浓度为100％、50％、10％、5％、1％、0.5％和0.1％的RBS溶液，随后在3ml污染混合物中各加入30μl这些溶液之一。室温培养12小时后，计算R2A琼脂上各测试RBS浓度的CFU。
MIC定义为能抑制微生物生长的最低浓度。结果见表V。
表V测定RBS的MIC
为了安全，选择采用稀释形式的RBS溶液以获得1.5的MIC。
采用的初始操作0.5％/pH7.3胰酶制剂制备100ml500mg胰酶制剂粉末+1g粉末状PBS(磷酸缓冲盐水)缓冲剂(Sigma)，稀释于100ml血液透析水(HDW)中。
使该溶液在管道中37℃封闭循环流动5分钟，流速500ml/分钟。
冲洗用HDW以500ml/分钟在开放环路中冲洗5分钟。
3％pH2.2柠檬酸制备100ml将3g粉末状柠檬酸(Merck)溶于100ml HDW中。
使该溶液在管道中20℃封闭循环流动5分钟，流速500ml/分钟。
冲洗用HDW以500ml/分钟在开放环路中冲洗5分钟。
7％/pH10 RBS制备100ml7ml浓缩溶液+566mg粉末状碳酸钠+388mg粉末状碳酸氢钠，用HDW稀释至100ml。
使该溶液在管道中20℃封闭循环流动30分钟，流速500ml/分钟。
冲洗用HDW以500ml/分钟在开放环路中冲洗5分钟。
对生物膜3和4的研究结果上述初始形式的组合K遗留了一些细胞粘附在生物膜3和4，特则厚或老龄生物膜上。为去除这种生物膜，开发了“富集配方”的组合K。
“富集”配方1％/pH7.3胰酶制剂制备100ml1g胰酶制剂粉末+1g粉末状PBS(磷酸缓冲盐水)缓冲剂(Sigma)，稀释于100ml血液透析水(HDW)中。
使该溶液在管道中37℃封闭循环流动5分钟，流速500ml/分钟。
冲洗用HDW以500ml/分钟在开放环路中冲洗5分钟。
5％pH2.2柠檬酸制备100ml5g粉末状柠檬酸(Merck)于100ml HDW中。
溶液在管道中20℃闭合循环流动30分钟，流速为500ml/分钟。
冲洗用HDW以500ml/分钟在开放环路中冲洗5分钟。
15％/pH10 RBS制备100ml15ml浓缩溶液加566mg粉末状碳酸钠+388mg粉末状碳酸氢钠+6ml 5.2％浓度的漂白剂(次氯酸钠终浓度0.3％)，用HDW稀释至100ml。
使该溶液在管道中20℃封闭循环流动过夜，流速500ml/分钟。
冲洗用HDW以500ml/分钟在开放环路中冲洗5分钟。
定性和定量测定数据富集组合K作用之前和之后的生物膜4的照片可目测定量本发明方法的效果。
表VI给出富集组合K对生物膜4作用之前和之后测得的诸参数值。
表VI评估富集组合K对生物膜4的效果的定量测定数据表IVa)生物膜1
对生物膜5的研究结果一种含粘质主细菌内毒素非常丰富的完全覆盖样品表面(30平方英寸)的很厚(大于3×109CFU/cm2)生物膜生长于未处理对照样品的表面，而每4小时用未富集组合K(初始公式)处理的样品表面只沉积了一点粘附的死细胞。
该定量测定数据见表VII。
表VII组合K对生物膜5的效果
对照生物膜和处理样品的照片得以证实本发明方法的效果。
可将本发明的方法、试剂盒和组合物用于血液透析设备管道中回路以抵抗军团杆菌病，例如在热水管道回路和空调系统和冷却塔中，在农产品业，在气候控制室或限制大气室，用于清洁牙科设备、可重复使用和不能高压灭菌的医学仪器。
在液体流动设备中，可用本发明的方法将溶液或几种溶液同时或连续导入需要去除生物膜的回路中，使所述溶液循环流动足够时间以去除生物膜，必要时接着进行清除和冲洗。
对于处理表面，工作台面和假器官，可通过连续或同时应用或浸入本发明的溶液或几种溶液，必要时接着进行冲洗来实施本发明的方法。
权利要求
1.一种去除生物膜的方法，其特征在于，所述方法包括至少下列同时或连续进行的步骤a)制备一种含酶混合物的溶液，该酶混合物含至少1种选自蛋白酶类的酶、至少1种选自酯酶类的酶和1种淀粉酶；b)制备含有碱性pH去污剂的溶液；c)将所述溶液通过洗涤或循环应用到待处理表面。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括下列同时或连续进行的步骤d)制备包含能溶解矿物盐沉积的酸的溶液，酸；e)将所述溶液通过洗涤或循环应用到待处理表面。
3.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述酶选自蛋白酶类的外肽酶或内肽酶，如胰蛋白酶。
4.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述酶选自酯酶类的羧酸酯水解酶如脂肪酶，磷脂酶和/或膦酸二酯酶，如核糖核酸酶。
5.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述酶混合物还包括选自甙酶或碳水化合物酶的酶，如葡糖苷酶和半乳糖苷酶。
6.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述酶混合物是胰酶制剂。
7.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述去污剂是含表面活性剂的碱性溶液。
8.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述去污剂是含表面活性剂和季铵的碱性溶液。
9.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述去污剂溶液还包括消毒剂如次氯酸钠或次氯酸钾溶液。
10.如权利要求2所述的方法，其中去除矿物盐沉积的酸选自柠檬酸、过乙酸、乙醇酸和羟基乙酸。
11.一种用于去除生物膜的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括至少1种酶混合物溶液和至少1种具碱性pH的去污剂溶液，所述酶混合物含至少1种选自蛋白酶类的酶、至少1种选自酯酶类的酶和一种淀粉酶。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，选自蛋白酶类的酶选自外肽酶或内肽酶，如胰蛋白酶。
13.如权利要求11或12所述的试剂盒，其中选自酯酶类的酶是羧酸酯水解酶如脂肪酶，磷脂酶和/或膦酸二酯酶，如核糖核酸酶。
14.如权利要求11-13中任一项所述的试剂盒，其中，所述酶混合物还包括选自甙酶或碳水化合物酶的酶，如葡糖苷酶和半乳糖苷酶。
15.如权利要求11-14中任一项所述的试剂盒，其中，所述酶混合物是胰酶制剂。
16.如权利要求11-15中任一项所述的试剂盒，其中，所述去污剂是含表面活性剂的碱性溶液。
17.如权利要求11-15中任一项所述的试剂盒，其中，所述去污剂是含表面活性剂和季铵的碱性溶液。
18.权利要求11-17中任一项所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括消毒剂溶液，如次氯酸钠或次氯酸钾溶液。
19.权利要求11-18中任一项所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括能溶解矿物盐如碳酸钙沉淀的酸的溶液。。
20.如权利要求19所述的试剂盒，其中，所述酸选自柠檬酸、过乙酸、乙醇酸和羟基乙酸。
21.一种用于去除生物膜的组合物，其特征在于，所述组合物包括酶混合物和具碱性pH的去污剂，所述酶混合物含至少1种选自蛋白酶类的酶、至少1种选自酯酶类的酶和1种淀粉酶。
22.如权利要求21所述的组合物，其中，所述酶混合物是胰酶制剂。
全文摘要
本发明涉及去除生物膜的方法，该方法包括至少同时或连续进行的下列步骤a)制备一种酶混合物的溶液，该酶混合物含至少1种选自蛋白酶类的酶、至少1种选自酯酶类的酶和1种淀粉酶；b)制备包含碱性pH去污剂的溶液，；c)将所述溶液通过洗涤或循环应用到待处理表面。本发明也涉及用于去除生物膜的试剂盒，该试剂盒包括上面定义的溶液和含所述溶液的组合物。
文档编号C11D11/00GK1708578SQ200380102321
公开日2005年12月14日 申请日期2003年10月30日 优先权日2002年10月31日
发明者K·马里恩 申请人:蒂里·桑切斯, 卡林·玛里昂