碱性蛋白酶变体的制作方法

专利名称：碱性蛋白酶变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及碱性蛋白酶变体，其为可混合到液体洗涤剂中的有用酶，以及涉及编码该碱性蛋白酶变体的基因。
背景技术：
长久以来，蛋白酶被用于大量工业产品，包括洗涤剂(例如，衣物洗涤剂)、纤维改良剂(fiber-modifying agent)、皮革处理剂、化妆品、洗浴剂、食品改良剂和药物。其中，工业上最大量生产的是用于洗涤剂的蛋白酶。迄今已知的该类蛋白酶的例子包括 Alcalase 、Savinase (Novozymes)、Maxacal (Genencor)、Blap (Henkel)禾口 KAP (Kao Corporation)ο将蛋白酶混合到衣物洗涤剂中以赋予该洗涤剂将主要由蛋白质构成且沉积在衣物上的污渍降解成低分子量产物的能力，从而通过表面活性剂促进该降解产物的溶解性。 然而，实际上，该沉积的污渍是包括除蛋白质以外的很多例如皮脂来源的脂质和固体颗粒的有机和无机成分的复合污渍。因此，对于能对这样的复合污渍表现出极佳清洁力的洗涤剂一直有持续的需求。考虑到上述课题，本发明人之前发现数个具有大约43，000分子量的碱性蛋白酶， 其甚至在高浓度脂肪酸的存在下都能保持充分的酪蛋白降解活性，且表现出对于含有蛋白质和皮脂的复合污渍的极佳清洁力；并且发明人之前提交了关于碱性蛋白酶的专利申请 (专利文献1)。这些碱性蛋白酶和传统已知的枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)在分子量、初级结构和酶学特征方面不同，其中，该传统已知的枯草杆菌蛋白酶是从属于芽孢杆菌属的细菌中得到的并且对氧化剂具有极强抗性的丝氨酸蛋白酶。建议将这些碱性蛋白酶分类到新的枯草杆菌蛋白酶亚族中(非专利文献1)。同时，洗涤剂可按照其形态而分为粉末洗涤剂和液体洗涤剂。有利地，液体洗涤剂比粉末洗涤剂具有更高的溶解性，且其原液可以直接施用到污渍上。虽然液体洗涤剂具有粉末洗涤剂所不具有的优点，但公知液体洗涤剂在加入例如蛋白酶这样的酶时的稳定性方面遇到技术难题，而粉末洗涤剂没有该问题。一般而言，因为液体洗涤剂储藏在室温中，酶 (蛋白质)容易变性。此外，液体洗涤剂含有表面活性剂、脂肪酸、溶剂等，且其PH落于弱碱性范围内。如此的条件对于酶而言是非常严苛的。而且，作为蛋白水解酶的蛋白酶所经历的自我消化非常成问题，进一步降低了酶在液体洗涤剂中的储存稳定性。为了解决如上所述的技术问题，已公知添加酶稳定剂，例如钙离子、硼砂、硼酸、硼化合物、羧酸(例如，蚁酸)、或多元醇。已经进行了一些以抑制蛋白酶活性为基础的研究来解决自消化问题。具体地，已经报道了通过使用4-取代苯基硼酸(专利文献幻或某种肽醛和硼组合物(专利文献幻对蛋白酶活性进行可逆抑制来稳定蛋白酶的方法。也报道了经葡聚糖修饰的蛋白酶可增强蛋白酶在包含表面活性剂的水溶液中的稳定性(非专利文献2)。然而，由于酶稳定剂(例如，钙离子或硼酸)的添加而产生的蛋白酶稳定作用是不
4充足的，且抑制效果依据蛋白酶的类型而不同。而且，该制剂的使用增加了生产成本。因此， 不认为该对策是是解决液体洗涤剂相关问题的最好方案。酶的化学修饰也造成生产成本方面的问题。一般地，液体洗涤剂中添加有表面活性剂、碱剂、抗-再沉积剂、溶剂、香料、荧光染料等。在这些添加物中，表面活性剂最严重地破坏了酶稳定性。典型地，阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂会一起使用。虽然非离子表面活性剂不会在很大程度上对酶造成损伤，却认为阴离子表面活性剂在很大程度上损伤酶，因为阴离子表面活性剂通过其疏水部分进入酶并且破坏酶的疏水相互作用，并捕集稳定酶的二价金属离子(例如，钙离子)(非专利文献幻。因此，酶对阴离子表面活性剂的抗性的增加是对增强酶在液体洗涤剂中的稳定性的非常重要的因素。在源自于KP43 [芽孢杆菌属KSM-KP43 (FERM BP-6532)]的碱性蛋白酶中，已知其相对于母碱性蛋白酶活性的特定活性通过如下方式来增强用组氨酸残基取代在氨基酸序列位点15的氨基酸残基；用苏氨酸或谷氨酰胺残基取代氨基酸序列位点16的氨基酸残基 (专利文献4)；用脯氨酸残基取代在氨基酸序列位点65的氨基酸残基(专利文献幻；或者用天冬氨酸残基取代氨基酸序列位点66的氨基酸残基(专利文献6)。然而，对于能够增强源自于KP43的碱性蛋白酶在液体洗涤剂中的稳定性而不减少特异活性的碱性蛋白酶变体还是未知的。专利文献1 :W0 99/18218小册子专利文献2 JP-A-Hl 1-507680专利文献3 JP-A-2000-506933专利文献4 JP-A-2004-305176专利文献5 JP-A-2004-000122专利文献6 JP-A-2002-218989非专利文献 1 Saeki et al. ,Biochem. Biophys. Res. Commun.，279，313—319，2000非专利文献 2 =Cosmetics & Toiletries magazine, 111，p. 79—88，1996非专利文献 3 :Detergent Enzyme :A Challenge ！ In Handbook of Detergents Part A, New York,p.639-690，1999

发明内容
本发明涉及一种碱性蛋白酶变体，其源自于由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成的或由与其具有90%或更高一致性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶，其中，一个或多个选自于所述SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列的(a)位点6、(b)位点15、(c)位点16、(d)位点65、(e)位点66、(f)位点82、(g)位点83、(h)位点204、⑴位点319和(j)位点337， 或其对应位点的氨基酸残基用下列氨基酸残基取代(a)或其对应位点色氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、或组氨酸；(b)或其对应位点谷氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、半胱氨酸、色氨酸、丙氨酸、或苯丙氨酸；(c)或其对应位点甲硫氨酸、谷氨酸、精氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、组氨酸、天冬氨酸、或半胱氨酸；(d)或其对应位点色氨酸；(e)或其对应位点组氨酸、色氨酸、丝氨酸、或亮氨酸；(f)或其对应位点丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、或天冬酰胺；(g)或其对应位点丙氨酸、丝氨酸、或半胱氨酸；(h)或其对应位点谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、组氨酸、异亮氨酸、色氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、或精氨酸；(i)或其对应位点色氨酸、缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、 组氨酸、或丝氨酸；和(j)或其对应位点精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、组氨酸、 丙氨酸、半胱氨酸、或缬氨酸。本发明也涉及编码碱性蛋白酶变体的基因。
本发明也涉及包括该基因的重组载体。本发明也涉及包括该重组载体的转化菌株。本发明也涉及包括该碱性蛋白酶变体的洗涤剂组合物。本发明也涉及用于增强碱性蛋白酶在液体洗涤剂中的稳定性的方法，该方法包括，在由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成的或由与其具有90%或更高一致性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶中，将一个或多个选自于所述SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列的 (a)位点6、(b)位点15、(c)位点16、(d)位点65、(e)位点66、(f)位点82、(g)位点83、 (h)位点204、(i)位点319和(j)位点337，或其对应位点的氨基酸残基用下列氨基酸残基取代(a)或其对应位点色氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、或组氨酸；(b)或其对应位点谷氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、半胱氨酸、色氨酸、丙氨酸、或苯丙氨酸；(c)或其对应位点甲硫氨酸、谷氨酸、精氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、组氨酸、天冬氨酸、或半胱氨酸；(d)或其对应位点色氨酸；(e)或其对应位点组氨酸、色氨酸、丝氨酸、或亮氨酸；(f)或其对应位点丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、或天冬酰胺；(g)或其对应位点丙氨酸、丝氨酸、或半胱氨酸；(h)或其对应位点谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、组氨酸、异亮氨酸、色氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、或精氨酸；(i)或其对应位点色氨酸、缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、 组氨酸、或丝氨酸；和
(j)或其对应位点精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、组氨酸、 丙氨酸、半胱氨酸、或缬氨酸。


图1 图2 图3 图4 图5 图6 图7 图8 图9
显示在位点6的氨基酸残基被取代的变体的相对残余活性的图表。 显示在位点15的氨基酸残基被取代的变体的相对残余活性的图表。 显示在位点16的氨基酸残基被取代的变体的相对残余活性的图表。 显示在位点65的氨基酸残基被取代的变体的相对残余活性的图表。 显示在位点66的氨基酸残基被取代的变体的相对残余活性的图表。 显示在位点82的氨基酸残基被取代的变体的相对残余活性的图表。 显示在位点83的氨基酸残基被取代的变体的相对残余活性的图表。 显示在位点204的氨基酸残基被取代的变体的相对残余活性的图表。 显示在位点319的氨基酸残基被取代的变体的相对残余活性的图表。显示在位点337的氨基酸残基被取代的变体的相对残余活性的图表。
具体实施例方式本发明涉及提供一种在液体洗涤剂中具有增强稳定性的碱性蛋白酶变体。本发明人已经发现，通过用其他氨基酸残基来取代用来特征化具有大约43，000 分子量的碱性蛋白酶KP43的特定氨基酸残基，得到的碱性蛋白酶变体在液体洗涤剂中的稳定性相比于母碱性蛋白得到增强。本发明可以提供在含有例如LAS的阴离子表面活性剂的液体洗涤剂中保持活性的碱性蛋白酶变体，其具有高的特异活性并可用作洗涤剂的有用酶。本发明的碱性蛋白酶变体是源自于由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成的或由与其具有90%或更高一致性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶的碱性蛋白酶变体，其中将一个或多个选自于SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列的(a)位点6、(b)位点15、(c)位点16、 (d)位点65、(e)位点66、(f)位点82、(g)位点83、(h)位点204、⑴位点319和(j)位点337，或其对应位点的氨基酸残基用其他氨基酸残基来取代。本发明的碱性蛋白酶变体可以是野生型变体或人工创造的变体。在本发明中，由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶的例子包括源自于KP43 [芽孢杆菌属KSM-KP43 (FERM BP-6532)]的碱性蛋白酶(W0 99/18218小册子)。由与SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列具有90%或更高一致性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶的例子包括那些由不同于SEQ ID NO :2所表示的氨基酸序列但与SEQ ID NO 2所表示的氨基酸序列具有90%或更高一致性，优选为95%或更高一致性，更优选为96% 或更高一致性，更优选为97%或更高一致性，更优选为98%或更高一致性，更优选为99% 或更高一致性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶；或那些由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成的且其中一个到多个氨基酸被缺失、取代或增加的碱性蛋白酶。优选地，这些碱性蛋白酶具有的功能等同于或高于由SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶的功能。由与由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列具有90%或更高一致性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶的具体例子包括蛋白酶KP9860[来源于芽孢杆菌属KSM-KP9860 (FERM BP-6534)的蛋白酶，WO 99/18218，GenBank序列号AB046403]和蛋白酶9865 [来源于芽孢杆菌属 KSM-9865 (FERM BP-10139)的蛋白酶，GenBank 序列号AB084155]。
由与SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列具有90%或更高一致性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶的具体例子还包括如下变体，例如由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点66和246的氨基酸残基分别被天冬氨酸和丝氨酸取代的变体、由SEQ ID NO 2 表示的氨基酸序列构成而其中位点103的氨基酸残基被精氨酸取代的变体、由SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列构成而其中位点195的氨基酸残基被丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸、精氨酸、天冬酰胺或组氨酸取代的变体(JP-A-2002-218989)；如下变体，例如由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点84的氨基酸残基被精氨酸取代的变体、由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点104的氨基酸残基被脯氨酸取代的变体、由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点256的氨基酸残基被丙氨酸或丝氨酸取代的变体、和由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点369的氨基酸残基被天冬酰胺取代的变体(JP-A-2002-306176)； 如下变体，例如由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点251的氨基酸残基被谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸或苏氨酸取代的变体、和由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点256的氨基酸残基被谷氨酰胺、丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸或天冬酰胺取代的变体(JP-A-2003-125783)；如下变体，例如由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点65的氨基酸残基被脯氨酸取代的变体、由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点273的氨基酸残基被苏氨酸或异亮氨酸取代的变体、由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点320的氨基酸残基被苯丙氨酸或异亮氨酸取代的变体、由SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列构成而其中位点356的氨基酸残基被谷氨酰胺或丝氨酸取代的变体、 由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点387的氨基酸残基被赖氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺取代的变体(JP-A-2004-000122)；如下变体，例如由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点163的氨基酸残基被组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸取代的变体、由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点170的氨基酸残基被缬氨酸或亮氨酸取代的变体、由SEQ ID N0:2表示的氨基酸序列构成而其中位点171的氨基酸残基被丙氨酸、甘氨酸或苏氨酸取代的变体 (JP-A-2004-057195)；如下变体，例如由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点 63的氨基酸残基被丝氨酸取代的变体、由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点 89的氨基酸残基被组氨酸取代的变体、由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点 120的氨基酸残基被精氨酸取代的变体、由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点63和187的氨基酸残基都被丝氨酸取代的变体、由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点2 的氨基酸残基被酪氨酸取代的变体、由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点四6的氨基酸残基被缬氨酸取代的变体、由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点304的氨基酸残基被丝氨酸取代的变体(JP-A-2004-305175)；如下变体， 例如由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点15的氨基酸残基被组氨酸取代的变体、由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点16的氨基酸残基被苏氨酸或谷氨酰胺取代的变体、由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点166的氨基酸残基被甘氨酸取代的变体、由SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列构成而其中位点167的氨基酸残基被缬氨酸取代的变体、由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点346的氨基酸残基被精氨酸取代的变体、由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中位点405的氨基酸残基被天冬氨酸取代的变体(JP-A-2004-305176)；以及具有大量如上所述变化的变体。在以上提到的碱性蛋白酶和蛋白酶变体中，优选那些具有任意以下由SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶所具有的酶特性1)具有氧化剂抗性，在碱性pH区间(》8)发挥作用且状态稳定。在此处使用的关于“碱性蛋白酶表现氧化剂抗性”的表达是指，在允许碱性蛋白酶在含有过氧化氢(50mM) 和氯化钙(5mM)的20mM伯瑞坦-罗比森缓冲液(Britton-Robinson buffer, pH 10)中在 20°C下静置20分钟后，碱性蛋白酶表现出至少50%的残余活性(合成底物法synthetic substrate method)的情况；2)经50°C、pHIO处理10分钟后表现出至少80%的残余活性；3)被二异丙基氟磷酸(DFP)或苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制；和4)具有由SDS-PAGE确定的43，000 士 2，000的分子量。在本说明书中，氨基酸序列之间的一致性是通过Lipman-Pearson法(kience， 227，1435，(1985))计算的。具体地，一致性是通过使用遗传信息处理软件Genetyx-Win(版本 5. 1. 1 ；Software Development Co. , Ltd.)的检索同源性(Search homology)程序来计算的，其中比较的单位大小(ktup)设为2。在本说明书中，一个到多个氨基酸被缺失、取代或增加的氨基酸序列优选为一个到十个氨基酸被缺失、取代或增加的氨基酸序列。增加包括在两个末端增加一个到多个氨基酸。本发明的碱性蛋白酶变体包括分别由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成而其中(a’ )位点6的氨基酸残基(甘氨酸残基)已经被色氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、丙氨酸或组氨酸取代；(b’ )位点15的氨基酸残基(丝氨酸残基)已经被谷氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、半胱氨酸、色氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸代替；(c’ )位点16的氨基酸残基(丝氨酸残基)已经被甲硫氨酸、谷氨酸、精氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、组氨酸、天冬氨酸或半胱氨酸取代；(d’)位点65的氨基酸残基(苏氨酸残基)已经被色氨酸取代；(e’)位点66的氨基酸残基(天冬酰胺残基)已经被组氨酸、色氨酸、丝氨酸或亮氨酸取代；(f ’ )位点82的氨基酸残基(苏氨酸残基)已经被丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、甲硫氨酸或天冬酰胺取代；(g’ )位点83的氨基酸残基(天冬酰胺残基)已经被丙氨酸、丝氨酸或半胱氨酸取代； (h’)位点204的氨基酸残基(谷氨酰胺残基)已经被谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、 苏氨酸、脯氨酸、组氨酸、异亮氨酸、色氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、赖氨酸或精氨酸取代；(i’ ) 位点319的氨基酸残基(丙氨酸残基)已经被色氨酸、缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸或丝氨酸取代；或(j’ )位点337的氨基酸残基(苯丙氨酸残基)已经被精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、组氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或缬氨酸取代的碱性蛋白酶变体；以及通过组合上述两种或更多取代(a’)到(j’)而获得的碱性蛋白酶变体。本发明的碱性蛋白酶变体也包括分别由与SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列具有 90%或更高一致性的氨基酸序列构成而其中(a”)对应于位点6的位点上的氨基酸残基已经被色氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、丙氨酸或组氨酸取代；(b”)对应于位点15的位点上的氨基酸残基已经被谷氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、半胱氨酸、色氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸代替；(c”)对应于位点16的位点上的氨基酸残基已经被甲硫氨酸、 谷氨酸、精氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、组氨酸、天冬氨酸或半胱氨酸取代；(d”)对应于位点65的位点上的氨基酸残基(已经被色氨酸取代；(e”)对应于位点66的位点上的氨基酸残基已经被组氨酸、色氨酸、丝氨酸或亮氨酸取代；(f”)对应于位点82的位点上的氨基酸残基已经被丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、 组氨酸、赖氨酸、精氨酸、甲硫氨酸或天冬酰胺取代；(g”)对应于位点83的位点上的氨基酸残基已经被丙氨酸、丝氨酸或半胱氨酸取代；(h”)对应于位点204的位点上的氨基酸残基已经被谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、组氨酸、异亮氨酸、色氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、赖氨酸或精氨酸取代；(i”)对应于位点319的位点上的氨基酸残基已经被色氨酸、缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸或丝氨酸取代；或(j”) 对应于位点337的位点上的氨基酸残基已经被精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、 苏氨酸、组氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或缬氨酸取代的碱性蛋白酶变体；或者通过组合两个或更多上述(a’ )到(j’ )而得到的碱性蛋白酶变体。例如，在本发明的碱性蛋白酶变体中，任意一个或多个氨基酸残基可以在由SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列的位点6或其对应位点、位点15或其对应位点、位点16或其对应位点、位点65或其对应位点、位点66或其对应位点、位点82或其对应位点、位点83或其对应位点、位点204或其对应位点、位点319或其对应位点、位点337或其对应位点处被同时取代。优选地，在本发明的碱性蛋白酶变体中，在由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列中的位点6或其对应位点的氨基酸残基被色氨酸、亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸取代；位点15或其对应位点的氨基酸残基被谷氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸或缬氨酸取代；位点16或其对应位点的氨基酸残基被甲硫氨酸、谷氨酸、精氨酸或缬氨酸取代；位点65或其对应位点的氨基酸残基被色氨酸取代；位点66或其对应位点的氨基酸残基被组氨酸取代；位点82或其对应位点的氨基酸残基被丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺或丝氨酸取代；位点83或其对应位点的氨基酸残基被丙氨酸或丝氨酸取代；位点204或其对应位点的氨基酸残基被谷氨酸、天冬氨酸或色氨酸取代；位点319或其相对位点的氨基酸残基被色氨酸、缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸取代；和/或位点337或其对应位点的氨基酸残基被精氨酸或缬氨酸取代。更优选地，在本发明的碱性蛋白酶变体中，在由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列中的位点6或其对应位点的氨基酸残基被色氨酸取代；位点15或其对应位点的氨基酸残基被谷氨酸取代；位点16或其对应位点的氨基酸残基被甲硫氨酸取代；位点65或其对应位点的氨基酸残基被色氨酸取代；位点66或其对应位点的氨基酸残基被组氨酸取代；位点82或其对应位点的氨基酸残基被丙氨酸取代；位点83或其对应位点的氨基酸残基被丙氨酸取代；位点204或其对应位点的氨基酸残基被谷氨酸取代；位点319或其相对位点的氨基酸残基被色氨酸取代；和/或位点337或其对应位点的氨基酸残基被精氨酸取代。在本发明中，“在对应位点的氨基酸残基”可通过已知演算法则(例如， Lipman-Pearson法)对碱性蛋白酶的氨基酸序列进行比对来识别，从而将最高同源性定位到存在于氨基酸序列中的保守氨基酸残基上。当通过该方法对碱性蛋白酶的氨基酸序列进行定位时，不管氨基酸序列中存在什么插入或缺失，都可以确定每一蛋白酶中的同源氨基酸残基的位点。可以想象的是，同源氨基酸残基在碱性蛋白酶的三维结构中处于相同的位置上，因此这些蛋白酶在特异性相关的功能方面是相类似的。例如，当通过上述方法对由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列与蛋白酶KP9860以及蛋白酶KP9865的氨基酸序列进行比较时，可以确定以下关系(a)由SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列中的位点6的氨基酸残基(甘氨酸残基) 对应于蛋白酶KP9860的位点6的甘氨酸残基以及蛋白酶KP9865的位点6的甘氨酸残基；(b)由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列中的位点15的氨基酸残基(丝氨酸残基) 对应于蛋白酶KP9860的位点15的丝氨酸残基以及蛋白酶KP9865的位点15的丝氨酸残基；(c)由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列中的位点16的氨基酸残基(丝氨酸残基) 对应于蛋白酶KP9860的位点16的丝氨酸残基以及蛋白酶KP9865的位点16的丝氨酸残基；(d)由SEQ ID N0:2表示的氨基酸序列中的位点65的氨基酸残基(苏氨酸残基) 对应于蛋白酶KP9860的位点65的苏氨酸残基以及蛋白酶KP9865的位点65的苏氨酸残基；(e)由SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列中的位点66的氨基酸残基(天冬酰胺残基)对应于蛋白酶KP9860的位点66的天冬酰胺残基以及蛋白酶KP9865的位点66的天冬
酰胺残基；(f)由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列中的位点82的氨基酸残基(苏氨酸残基) 对应于蛋白酶KP9860的位点82的苏氨酸残基以及蛋白酶KP9865的位点82的苏氨酸残基；(g)由SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列中的位点83的氨基酸残基(天冬酰胺残基)对应于蛋白酶KP9860的位点83的天冬酰胺残基以及蛋白酶KP9865的位点83的天冬
酰胺残基；(h)由SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列中的位点204的氨基酸残基(谷氨酰胺残基)对应于蛋白酶KP9860的位点204的谷氨酰胺残基以及蛋白酶KP9865的位点204的谷
氨酰胺残基；(i)由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列中的位点319的氨基酸残基(丙氨酸残基) 对应于蛋白酶KP9860的位点319的丙氨酸残基以及蛋白酶KP9865的位点319的丙氨酸残基；(j)由SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列中的位点337的氨基酸残基(苯丙氨酸残基)对应于蛋白酶KP9860的位点337的苯丙氨酸残基以及蛋白酶KP9865的位点337的苯
11丙氨酸残基。本发明的碱性蛋白酶变体可以通过将变化带入由SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列构成或由与SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列具有90%或更高一致性的氨基酸序列构成而未经修饰的碱性蛋白酶(下文中可称作母碱性蛋白酶)的目标位点而产生。本发明的碱性蛋白酶变体可以通过例如以下过程来获得。具体地，使编码母碱性蛋白酶的克隆基因(例如，具有SEQ ID NO :1表示的核苷酸序列的基因)突变；将由此突变的基因转化到合适的宿主中；将经转化的宿主进行培养，之后从培养产物中重获碱性蛋白酶。对于编码母碱性蛋白酶的克隆可以通过常用的遗传重组技术来进行，例如，在WO 99/18218小册子或WO 98/56927小册子中描述的方法。编码母碱性蛋白酶的基因的突变可以通过任意的常用点突变技术来进行。更具体地，基因的突变可以通过，例如，Site-Directed Mutagenesis System Mutan -Super Express Km试剂盒(Takara Bio Inc.的产品)的使用来进行。通过重组PCR(聚合酶链式反应)法(PCR实验方案，Academic Press,New York，1990)，基因的任意序列片段可以被取代为对应于该任意序列片段的另一基因的序列片段。使用如上获得的突变基因来产生本发明的蛋白酶变体的方法，例如，如下所示将突变基因连接到可以持续扩增该基因的DNA载体中，之后转化到宿主细菌中的方法；或将突变基因引入能持续维持该基因的宿主细菌的染色体DNA中的方法。表现出如上所述特征的宿主细菌的例子包括属于芽孢杆菌属的细菌、大肠杆菌(Escherichia coli)、霉菌、酵母和放线菌(Actinomyces)。通过将含有突变基因的宿主微生物体接种到含有可同化碳源、氮源和其他必需营养素的培养基中，之后用常用方法进行培养可以产生出蛋白酶变体。如此产生的本发明的碱性蛋白酶变体表现出氧化剂抗性，保持酪蛋白降解活性 (甚至在存在高浓度脂肪酸时)，具有经SDS-PAGE确定的43，000 士 2，000的分子量，在碱性 PH范围内表现出活性，并表现出高度特异活性。此外，保持高度特异活性的本发明的碱性蛋白酶被赋予了极佳的特性；例如，碱性蛋白酶变体在含有例如LAS的阴离子表面活性剂的液体洗涤剂中表现出比母碱性蛋白酶更高的稳定性。因此，在本发明的一个方面，提供了一个用于在液体清洗剂中稳定碱性蛋白酶的方法，该方法包括取代氨基酸残基的步骤。在本发明的方法中，用来进行取代的碱性蛋白酶是以上提到的母碱性蛋白酶，且进行取代所涉及的氨基酸残基是在上述(a)到(j)中描述的那些氨基酸残基。因此，本发明的碱性蛋白酶变体作为可混合到多种洗涤剂组合物中的酶有用。此外，通过本发明的稳定性增强方法，可以提供混合到多种洗涤剂组合物中的有用酶。对于混合到洗涤剂组合物中的本发明的碱性蛋白酶变体的用量没有特别的限定， 只要碱性蛋白酶变体能表现出其活性即可。基于Ikg洗涤剂组合物，要混合的碱性蛋白酶变体的量可以为0. 1到5，000PU，但是，从经济等的角度出发，混合量优选为500PU或更少。除本发明的碱性蛋白酶变体外，本发明的洗涤剂组合物可以含有多种酶，例如， 水解酶、氧化酶、还原酶、转移酶、裂解酶、异构酶、连接酶和合成酶。其中，优选为除了本发明的碱性蛋白酶变体以外的蛋白酶、纤维素酶、角蛋白酶、酯酶、角质酶、淀粉酶、脂肪酶、支链淀粉酶、果胶酶、甘露聚糖酶、葡萄糖苷酶、葡聚糖酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、 漆酶等，更优选为蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和脂肪酶。蛋白酶的例子包括市售的产品， 例如 Alcalase 、Esperase 、Savinase 、Everlase 禾口 Kannase (Novozymes)；Properase 禾口 Purafect(Genencor)；禾口 KAP (Kao Corporation)。纤维素酶的例子包括 Celluzyme 禾口 Carezyme (Novozymes)；禾口 KAC(Kao Corporation)，在 JP-A-H10—313859 中描述的由芽孢杆菌属KSM-S237菌株产出的碱性纤维素酶，和在JP-A-2003-313592中描述的突变碱性纤维素酶。淀粉酶的例子包括Termamyl 、Duramyl⑥和Mainzyme (Novozymes) ；Purastar (Genencor)禾口 KAM (Kao Corporation)。月旨肪醇的例子包括 Lipolase ⑧、Lipolase Ultra 禾口 Lipex (Novozymes)。当除本发明的碱性蛋白酶变体外的蛋白酶与碱性蛋白酶变体一起混合到洗涤剂组合物中时，基于Ikg洗涤剂组合物，蛋白酶含量优选为0. 1到500PU。当纤维素酶和碱性蛋白酶变体一起混合时，基于Ikg洗涤剂组合物，纤维素酶含量优选为300到3，000, 000KU, 其中KU代表用在JP-A-H10-313859的第W020]段中描述的酶活性测定法确定的单位。当淀粉酶和碱性蛋白酶变体一起混合时，基于Ikg洗涤剂组合物，淀粉酶含量优选为50到500，000IU，其中IU代表用在JP-A-Hl 1-43690的第W040]段中描述的淀粉酶活性测定法确定的单位。当脂肪酶和碱性蛋白酶变体一起混合时，基于Ikg洗涤剂组合物，淀粉酶含量优选为10，000到1，000, 000LU，其中LU代表用JP-A-H08-500013的实施例1描述的脂肪酶活性测定法确定的单位。本发明的洗涤剂组合物可以含有已知的洗涤剂成分，其例子包括以下物质。(1)表面活性剂将表面活性剂以0. 5到60质量％的量混合入洗涤剂组合物，在洗涤剂组合物为粉末形式的情况下优选为10到45质量％，在洗涤剂组合物是液体形式的情况下优选为20到 50质量％。当本发明的洗涤剂组合物用作漂白剂或用于自动洗碗机的洗涤剂时，需混合的表面活性剂的量一般为ι到10质量％，优选为1到5质量％。用于本发明洗涤剂组合物的表面活性剂的例子包括选自于阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性表面活性剂和阳离子表面活性剂的一种；和这些表面活性剂的组合。 优选地，使用阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂。优选的阴离子表面活性剂的例子包括C10-C18醇硫酸酯盐、C8-C20烷氧基醇硫酸酯盐、烷基苯磺酸盐、链烷磺酸盐、α -烯烃磺酸盐、α -磺基脂肪酸盐、α -磺基脂肪酸烷基酯盐和脂肪酸盐。在本发明中，优选为具有C10-C14，更优选C12-C14的烷基链的直链烷基苯磺酸盐。反离子种类优选为碱金属盐或胺盐，更优选钠和/或钾；单乙醇胺；或二乙醇胺。优选的非离子表面活性剂的例子包括聚氧化烯C8-C20烷基醚、烷基多糖苷、聚氧化烯C8-C20烷基苯基醚、聚氧化烯失水山梨糖醇C8-C22脂肪酸酯、聚氧化烯二醇C8-C22 脂肪酸酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物。非离子表面活性剂优选为通过例如环氧乙烷或环氧丙烷这样的环氧烷烃G到20mol)与C10-C18醇的加成而获得的聚氧化烯烷基醚， 该聚氧化烯烷基醚优选具有10. 5到15. O、更优选11. O到14. 5的HLB值(亲水亲油平衡值)(用GrifTin法计算得到)。(2) 二价金属离子捕集剂二价金属离子捕集剂以0. 01到50质量％的量混入，优选为5到40质量％。用于本发明的洗涤剂组合物的二价金属离子捕集剂的例子包括缩合磷酸盐，例如三聚磷酸盐、焦磷酸盐和正磷酸盐；硅铝酸盐，例如沸石；合成的层状结晶型硅酸盐；次氮基三乙酸盐；乙二胺四乙酸盐；柠檬酸盐；异柠檬酸盐；和聚缩醛羧酸盐。其中，优选结晶型硅铝酸盐(合成沸石)。在A型、X型和P型沸石中，优选A型沸石。优选使用的合成沸石具有0.1到10 μ m 的平均初级粒径，更优选为0. 1到5 μ m。(3)碱剂碱剂以0. 01到80质量％、优选为1到40质量％的量混入。在粉末洗涤剂中使用的碱剂的例子包括通常称作重质苏打灰或轻质苏打灰的例如碳酸钠的碱金属碳酸盐，和 JIS No. 1、2或3的无定形碱金属硅酸盐。这些无机碱剂对洗涤剂在干燥过程中形成颗粒核是有效的，从而能够提供一种具有极佳流动性的相对硬性的洗涤剂。可以用例如倍半碳酸钠或碳酸氢钠来代替以上这些碱剂，并且例如三聚磷酸盐这样的磷酸盐也可以用作碱剂。 可以用于液体洗涤剂并作为表面活性剂的反离子的碱剂的例子包括氢氧化钠和单_、二 _、 或三乙醇胺，以及如上所述的碱剂。(4)抗-再沉积剂抗-再沉积剂以0.001到10质量％、优选为1到5质量％的量混入。在本发明的洗涤剂组合物中使用的抗-再沉积剂的例子包括聚乙二醇、羧酸聚合物、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。其中，羧酸聚合物具有金属离子捕集能力和把固体微粒污渍从衣物中分散到洗涤槽中的能力，以及抗-再沉积的能力。羧酸聚合物是由丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸等形成的均聚物或共聚物，且优选通过如上所述的单体与马来酸的共聚反应形成的共聚物。 共聚物的分子量优选为数千到100，000。除以上提到的羧酸聚合物外，优选使用例如聚缩水甘油酸这样的聚合物、例如羧甲基纤维素这样的纤维素衍生物、或例如聚天冬氨酸这样的氨基羧酸聚合物，因为这些物质也具有金属离子捕集能力、分散力和抗-再沉积力。(5)漂白剂漂白剂例如过氧化氢或过碳酸盐，优选地以1到10质量％的量混入。在使用漂白剂的情况下，例如四乙酰乙二胺(TAED)这样的漂白活化剂或在JP-A-H06-316700中描述的漂白活化剂以0. 01到10质量％的量混入。(6)荧光剂在本发明洗涤剂组合物中使用的荧光剂的例子包括联苯荧光剂(例如， Tinopal CBS-X)和芪荧光剂(例如，DM型荧光染料)。该荧光剂优选地以0. 001到2质量％的量混入。(7)其他成分本发明的洗涤剂组合物还可以含有在衣物洗涤剂领域中已知的增洁剂、软化剂、 还原剂(例如，亚硫酸盐)、消泡剂(例如，硅酮)、或香料；或其他添加剂。本发明的洗涤剂组合物可以通过常用方法使用以上获得的本发明的碱性蛋白酶变体以及上述其他酶和/或上述已知的洗涤剂成分(如果需要的话)来制备。洗涤剂组合物的形式可以根据用途来合理地选择，且洗涤剂可以采用例如液体、粉末、颗粒、糊状或固体的形式。如此制备的本发明的洗涤剂组合物可以用作，例如衣物洗涤剂、漂白剂、用于清洁硬表面的洗涤剂、用于排水管的洗涤剂、假牙清洗剂、和用于对医疗器械进行消毒灭菌的洗涤剂。实施例
接下来将以实施例的方式更加详细地说明本发明。实施例1KP43蛋白酶的制备接下来将以野生型KP43蛋白酶为例说明制备用于酶稳定性评价的蛋白酶的方法。用限制性内切酶BamHI和XbaI (Roche，罗氏)同时消化质粒pHA64(日本专利第 349293号，在表达启动子的下游侧具有BamHI位点和)(baI位点)，且该产物用作基因插入和基因表达的载体。用限制性内切酶BamHI和)(baI同时消化由SEQ ID NO=I表示的且包括野生型 KP43蛋白酶基因(在基因上游侧的5’端具有BamHI位点，在基因下游侧的3’端具有^CbaI位点)的DNA片段，之后和上述制备的插入和表达载体混合。混合物用Ligation High(Toyobo 的产品)进行连接。连接产物通过乙醇沉淀来纯化，并通过电穿孔使纯化产物转化至作为宿主的芽孢杆菌属KSM-9865 (FERM BP-10139)。将产物涂布到含脱脂奶的碱性LB琼脂培养基(含有细菌用胰蛋白胨(—(^讨巧？切！^…；^酵母提取物^^氯化钠^^脱脂奶、 1. 5%琼脂粉、0. 05%碳酸钠和15ppm四环素)中。几天后从出现在琼脂培养基上的菌落中， 通过证实脱脂奶透明溶蛋白圈(skimmed milk dissolution spots)的存在来筛选转染上蛋白酶基因的转化菌株。从转化菌株中提取质粒DNA，并证实由SEQ ID NO :1表示的蛋白酶基因的正确插入。如此得到的质粒称为质粒PHA64TSA。将含有pHA64TSA的KSM-9865转化菌株接种到接种培养基(6. 0% (w/v)多聚蛋白胨S、0. 1 %酵母提取物、1.0%麦芽糖、0. 02%七水硫酸镁、0. 磷酸二氢钾、0.3%无水碳酸钠、30ppm四环素)(5mL)中，并在30°C下振荡培养16小时。接下来，将接种培养基接种 (1% (ν/ν))到培养用培养基(8%多聚蛋白胨S、0. 3%酵母提取物、10%麦芽糖、0.04%七水硫酸镁、0. 2%磷酸二氢钾、1. 5%无水碳酸钠、30ppm四环素)(30mL)中，在30°C下振荡培养三天。将含有通过培养得到的KP43蛋白酶的培养液进行离心，并评估回收的球粒在液体洗涤剂中的稳定性。实施例2KP43蛋白酶变体的生产接下来以变体“G6A”为例说明生产KP43蛋白酶变体的方法。在G6A中，将野生型成熟KP43蛋白酶区域的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)中的位点6甘氨酸(G6)突变为丙氨酸。用充分稀释的作为模板的质粒PHA64TSA、与起始密码子上游区域互补的引物 KG24S2 (SEQ ID NO :3，具有BamHI位点)、以及与G6密码子相邻的上游区域互补的引物G6_ R(SEQ ID NO 4)来进行PCR，从而扩增编码KP43蛋白酶N端部分的DNA序列。另外，用作为模板的质粒PHA64TSA、用于使丙氨酸的密码子取代G6密码子的引物G6A_F(SEQ ID NO :5， 其5，端部分与引物G6_R互补)、和在终止密码子下游侧的引物KG11S(SEQ ID N0:6，具有 )CbaI位点)进行PCR，从而扩增编码KP43蛋白酶C端部分的DNA序列。接下来，将由此得到的编码N端和C端部分的PCR产物混合到一起，并将该混合物用作模板。使用引物KGMS2 和引物KGllS来进行PCR，从而得到含有KP43蛋白酶变体基因全长的PCR产物，其中，G6密码子已经被丙氨酸的密码子取代。将PCR产物用乙醇沉淀来纯化，纯化产物同时用限制性内切酶BamHI和)(baI来消化。将消化产物和实施例1中用于插入和表达的载体混合，并用 Ligation High(Toyobc)的产品)来连接该混合物。连接产物通过乙醇沉淀来纯化，并通过电穿孔法使纯化产物转化至作为宿主的芽孢杆菌KSM-9865(FERM BP-10139)。将产物涂布到含脱脂奶的碱性LB琼脂培养基上。从数天后出现在琼脂培养基上的菌落中，通过证实脱脂奶透明溶蛋白圈的存在来筛选转染上蛋白酶基因的转化菌株。因此，生产了转化菌株，该转化菌株生产G6被突变为丙氨酸的KP43蛋白酶变体“G6A”。重复以上过程，除了用列在下列表1到10中“突变体反向引物(Mutation primer · R) ”这一栏的SEQ ID NO.表示的引物来代替引物G6R，以及用由列在下面表1到 10中“突变体正向引物(Mutation primer · F) ”这一栏的SEQ ID NO.表示的引物来代替引物66々_ 外，从而生产转化菌株，其中，该转化菌株生产具有列在下面表1到10的“KP43 蛋白酶突变”这一栏的突变的KP43蛋白酶变体。每一个如此得到的转化菌株都通过在实施例1中描述的方法进行培养，由此回收含有所需蛋白酶变体的培养上清液。评估蛋白酶变体在液体洗涤剂中的稳定性。表权利要求
1.一种碱性蛋白酶变体，其中，所述碱性蛋白酶变体源自于由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成的或由与其具有 90%或更高一致性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶，其中，一个或多个选自于所述SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列的(a)位点6、(b)位点 15、(c)位点16、(d)位点65、(e)位点66、(f)位点82、(g)位点83、(h)位点204、⑴位点319和(j)位点337，或其对应位点的氨基酸残基用下列氨基酸残基取代(a)或其对应位点色氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、 赖氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、或组氨酸；(b)或其对应位点谷氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、半胱氨酸、色氨酸、丙氨酸、或苯丙氨酸；(c)或其对应位点甲硫氨酸、谷氨酸、精氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、组氨酸、天冬氨酸、或半胱氨酸；(d)或其对应位点色氨酸；(e)或其对应位点组氨酸、色氨酸、丝氨酸、或亮氨酸；(f)或其对应位点丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、或天冬酰胺；(g)或其对应位点丙氨酸、丝氨酸、或半胱氨酸；(h)或其对应位点谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、组氨酸、异亮氨酸、色氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、或精氨酸；(i)或其对应位点色氨酸、缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、或丝氨酸；和(j)或其对应位点精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、组氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、或缬氨酸。
2.根据权利要求1所述的碱性蛋白酶变体，其中，所述碱性蛋白酶变体源自于由所述SEQ ID NO :2表示的所述氨基酸序列构成的碱性蛋白酶，其中，一个或多个选自于所述氨基酸序列的(a)位点6、(b)位点15、(c)位点16、(d) 位点65、(e)位点66、(f)位点82、(g)位点83、(h)位点204、⑴位点319和(j)位点337， 或其对应位点的氨基酸残基用其他氨基酸残基取代。
3.一种基因，其编码如权利要求1或2所述的碱性蛋白酶变体。
4.一种重组载体，其包括如权利要求3所述的基因。
5.一种转化菌株，其包括如权利要求4所述的重组载体。
6.根据权利要求5所述的转化菌株，其中，其宿主为微生物。
7.一种洗涤剂组合物，其包括如权利要求1或2所述的碱性蛋白酶变体。
8.根据权利要求7所述的洗涤剂组合物，其中，所述洗涤剂组合物包含阴离子表面活性剂。
9.一种用于加强碱性蛋白酶在液体洗涤剂中的稳定性的方法，其中，所述方法包括，在由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列构成的或由与其具有90%或更高一致性的氨基酸序列构成的所述碱性蛋白酶中，将一个或多个选自于所述SEQ ID N0:2表示的氨基酸序列的(a)位点6、(b)位点15、(c)位点16、(d)位点65、(e)位点66、(f)位点82、(g)位点83、(h)位点204、⑴位点319和(j)位点337，或其对应位点的氨基酸残基用下列氨基酸残基取代(a)或其对应位点色氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、 赖氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、或组氨酸；(b)或其对应位点谷氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、半胱氨酸、色氨酸、丙氨酸、或苯丙氨酸；(c)或其对应位点甲硫氨酸、谷氨酸、精氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、组氨酸、天冬氨酸、或半胱氨酸；(d)或其对应位点色氨酸；(e)或其对应位点组氨酸、色氨酸、丝氨酸、或亮氨酸；(f)或其对应位点丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、或天冬酰胺；(g)或其对应位点丙氨酸、丝氨酸、或半胱氨酸；(h)或其对应位点谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、组氨酸、异亮氨酸、色氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、或精氨酸；(i)或其对应位点色氨酸、缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、或丝氨酸；和(j)或其对应位点精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、组氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、或缬氨酸。
10. 一种用于制造如权利要求1或2所述的碱性蛋白酶变体的方法，其中，所述方法包括培养如权利要求5所述的转化菌株。
全文摘要
本发明提供一种碱性蛋白酶变体，其源自于由SEQ ID NO2表示的氨基酸序列构成的或由与其具有90％或更高一致性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶，该变体具有突变，其中一个或多个选自于所述SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的(a)位点6、(b)位点15、(c)位点16、(d)位点65、(e)位点66、(f)位点82、(g)位点83、(h)位点204、(i)位点319和(j)位点337或其对应位点的氨基酸残基被下列氨基酸残基取代(a)或其对应位点Typ、Leu、Val、Ile、Met、Tyr、Gln、Lys、Thr、Phe、Arg、Ser、Cys、Ala、或His；(b)或其对应位点Glu、Met、Asp、Val、Gln、Arg、Cys、Trp、Ala、或Phe；(c)或其对应位点Met、Glu、Arg、Val、Lys、Phe、Tyr、Ile、His、Asp、或Cys；(d)或其对应位点Trp；(e)或其对应位点His、Trp、Ser、或Leu；(f)或其对应位点Ala、Glu、Gln、Ser、Cys、Gly、His、Lys、Arg、Met、或Asn；(g)或其对应位点Ala、Ser、或Cys；(h)或其对应位点Glu、Asp、Cys、Val、Thr、Pro、His、Ile、Trp、Ser、Asn、Lys、或Arg；(i)或其对应位点Trp、Val、Thr、Leu、Ile、Cys、Glu、Lys、Tyr、Arg、Phe、Gln、Met、Pro、Asp、Asn、His、或Ser；和(j)或其对应位点Arg、Gly、Ser、Lys、Gln、Thr、His、Ala、Cys、或Val。
文档编号C11D3/386GK102421893SQ20108001915
公开日2012年4月18日 申请日期2010年4月26日 优先权日2009年4月30日
发明者东畑正敏, 佐伯胜久, 佐藤刚, 奥田光美, 远藤圭二 申请人:花王株式会社