专利名称：碱性蛋白酶高产菌株及其所产的碱性蛋白酶及蛋白酶的发酵方法
技术领域：
本发明属于生物工程，涉及菌种诱变，尤其涉及一种碱性蛋白酶高产菌株及其所产的碱性蛋白酶及蛋白酶的发酵方法。
背景技术：
碱性蛋白酶(Alkaline Protease)属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，可以在碱性条件下水解蛋白质肽键，其最适作用PH—般为9 11，主要应用于加酶洗涤剂工业，在制革、丝绸、饲料、医药、食品、环保等工业也有广泛的应用。该酶种最早在猪的胰脏中发现。1913年，Rohm首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。1945年，瑞士的Dr. Jaag等发现了微生物碱性蛋白酶，使蛋白酶有可能广泛应用于洗涤剂工业。1963年，诺和诺德公司(现诺维信公司)发现了更适用于洗涤剂的碱性蛋白酶 Alcalase，酶制剂被广泛地应用于洗涤剂产品中，出现了加酶洗衣粉，随后的20年中，细菌类蛋白酶是唯一被应用于洗涤剂的商品化酶制剂。目前，在世界范围内蛋白分解酶是工业酶中用得最多的一种酶，约占酶总量的60%，其中碱性蛋白酶就占25%。它在商业中的巨大应用前景及在基础研究中的重要作用，吸引着国际国内的许多公司及研究单位竞相对其进行多方面的研究。近年来，离子束作为一种新的诱变源在诱变育种方面因其独特的诱变机理和生物学效应而发展极为迅速，与传统诱变源相比，离子注入除了具有能量沉积效应外，还具有动量传递、质量沉积及电荷中和与交换等效应，它将物理诱变与化学诱变特性于一身，能够在低剂量注入的情况下，显著提高生物的变异率，获得损伤轻、突变率高、突变谱广、遗传稳定的诱变效果。离子注入技术被广泛应用于微生物优良菌株的选育和改良研究中，已选育出一些在工业上具有较大应用前景的生物新品种，并取得了显著的经济效益和社会效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用低能N+离子注入技术诱变选育得到的碱性蛋白酶高产菌株及其所产的碱性蛋白酶及蛋白酶的发酵方法，本方法有效提高嗜碱芽孢杆菌产碱性蛋白酶的能力。本发明实现目的的技术方案如下—种碱性蛋白酶高产菌株，其特征在于名称为Y-22，分类命名为嗜碱芽孢杆菌 Bacillus alcalophilus，保藏编号为CGMCC No. 5313，保藏日期2011 年 9 月 30 日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。一种碱性蛋白酶，碱性蛋白酶高产菌株发酵得到。而且，所述碱性蛋白酶分子量为28kDa。而且，所述碱性蛋白酶当以酪蛋白为底物时，其最适作用pH为10. 5，最适作用温度为40°C，在pH7 12的范围内稳定，在40 50°C有较好的热稳定性。一种碱性蛋白酶的发酵方法，其特征在于发酵所用培养基为发酵培养基g/ L 酵母浸粉15-20、棉籽饼粉25-35、麦芽糊精90-110、柠檬酸钠1_5、氯化钙2_5、K2HPO4 15-20、pH自然、溶剂为水；发酵条件为温度30-40°C;转速100 600r/min ；通风量1 0. 5 1 2.5; 溶氧维持在20 30%，发酵过程中自动流加氨水及20% (ν/ν)的盐酸，使发酵液pH值维持在7. 0。一种碱性蛋白酶作为洗涤剂添加剂的应用。一种碱性蛋白酶在皮革行业的应用。一种碱性蛋白酶在食品行业的应用。本发明的优点及积极效果是1、本发明中诱变获得的产碱性蛋白酶菌株是由嗜碱芽孢杆菌经过低能N+离子注入诱变而得的碱性蛋白酶高产菌株，有效地提高了菌株的产酶能力，其碱性蛋白酶的摇瓶活力最大值到30700U/mL，较出发菌株提高了 37. 7%，降低了生产成本，并获得良好的经济效益。2、本发明发酵获得的碱性蛋白酶的摇瓶活力最大值到30700U/mL，较出发菌株提高了 37. 7%;7L规模发酵罐酶活力达到36000U/mL ；30L规模发酵罐酶活力达到38600U/mL ； 200L规模发酵罐酶活力达到42000U/mL。
图1为本发明N+离子注入对菌株存活率的影响曲线；图2为本发明N+离子注入对菌株突变及正突变率的影响；图3为本发明经低能N+离子注入技术得到的碱性蛋白酶高产菌株Y-22的摇瓶发酵产酶曲线；图4为本发明碱性蛋白酶高产菌株Y-22的7L发酵罐发酵产酶曲线；图5为本发明碱性蛋白酶高产菌株Y-22的30L发酵罐发酵产酶曲线；图6为本发明碱性蛋白酶高产菌株Y-22的200L发酵罐发酵产酶曲线；图7为本发明碱性蛋白酶电泳图；(A. Marker，B.纯化后碱性蛋白酶蛋白，C.发酵液)；图8为本发明碱性蛋白酶在？!15、6、7、8、9、10、11、12、13下的相对酶活；图9为本发明碱性蛋白酶在？!15、6、7、8、9、10、11、12、13下401保温Ih后的相对
酶活；图10为本发明碱性蛋白酶在30、40、50、60、70、80、90°C下的相对酶活；图11为本发明碱性蛋白酶在ρΗΙΟ. 5下45、50、55、60、65 °C分别保温20、40、60、 80、100、120min后的相对酶活。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
1、出发菌株的筛分从斜面上挑取一环新培养的嗜碱芽孢杆菌接入种子培养液中，于34°C、200r/min 培养12h，然后涂布到固体培养基中，在34°C的培养箱中继续培养48h，从中挑取20个单菌落转接入斜面，再将这20个斜面菌株接到种子培养基中，每瓶(50mL种子培养基/250mL三角瓶)接种一个单菌落，200r/min，34°C培养12h，观察菌液变浑浊、无异味后按2% (ν/ν) 接种量转接至液体发酵培养基。34°C，200r/min，挡板三角瓶(50mL发酵培养基/250mL挡板三角瓶)中振荡培养54h，将发酵液离心后，以福林酚法测定粗酶液活力，结果如表1所
7J\ ο测定碱性蛋白酶活力后，选择酶活较高且较稳定的菌株作为出发菌株。原始出发菌株经过复壮后，菌种发酵液的酶活平均值为19000U/mL 22000U/mL。YXB-13最高，为 22300U/mL。将上述试验中酶活较高的菌株YXB-13进行传代试验，连续传代20次考察菌株遗传性状的稳定性。其结果为(见表2)此菌株高产且稳定性好，适合作为离子注入诱变的出发菌株。2、N+离子注入诱变(1)样品的前处理将嗜碱芽孢杆菌出发菌株于产芽孢培养基中培养至产芽孢期，取0. ImL芽孢悬液均勻地涂布于无菌平板上，用无菌风吹干后立即进行N+离子注入；(2)离子注入条件注入能量为30keV，靶室真空度为5_6 X 10_3Kpa，以6s脉冲式注入，间隔为60s，单次注入剂量为1 X 1014N+ions/cm2 ；注入剂量分别为3、8、10、30、50、80、 100、200。每个注入剂量做一个真空对照。每个处理及其相应的真空对照在离子注入前预抽真空5min，以消除因真空干燥程度不同可能带来的影响；(3)样品的后处理将经过N+离子注入的培养皿和真空对照的培养皿分别用无菌水洗脱，适当稀释后涂布于活化平板上，置34°C下培养48h后计数，以计算存活率。存活率为经N+离子注入处理的存活菌落数与经真空对照处理的存活菌落数的比值。(4)存活率曲线的绘制吸取离子注入后的孢子悬液lmL，注入装有9mL无菌水的试管中，制成 ο—1稀释液；反复吹吸ICT1的稀释液，使其混合均勻后吸取lmL，注入装有9mL 无菌水的试管中，制成10_2稀释液；按上述程序操作，制备10_3稀释液；选择适宜浓度的稀释液，分别取0. ImL涂布于平皿中，每个稀释度做3个平行；于34°C恒温培养箱中培养48h 后，取出计数。以注入剂量为横坐标，存活率为纵坐标，绘制存活率与注入剂量的关系曲线。存活率(％) =N+注入处理菌落数/真空对照菌落数X 100%。其结果为(见图 1)在N+离子注入剂量达到30X 1014N+ions/cm2前，菌株存活率随N+离子注入剂量的增加而迅速降低；注入剂量超过200X 1014N+ions/cm2后，存活率基本为零。当N+离子注入剂量在30 X IO14 50X 1014N+ions/cm2范围内时，菌种的存活率呈现高-低-高的“马鞍型”变化趋势。(5) N+离子注入对菌株突变率的影响采用初筛法检测每个注入剂量下的菌落透明圈直径与菌落直径之比变化情况，规定透明圈直径高于对照株5%的突变株称为正突变，小于5%的为负突变，士 5%之间为未突变。试验结果见图2。由图2可知，随着离子注入剂量的增加，菌株突变率随之增加；注入剂量在 30 X IO14 50 X 1014N+ions/cm2范围内菌株的正突变率较高(22% 26% )，注入剂量超过 50X1014N+ions/cm2以后，菌株的突变率继续增加，但其正突变率呈降低的趋势。分析原因， 可能是由于低剂量注入后的菌株容易发生回复突变，而高剂量使DNA及生物膜等生物大分子的损伤严重造成较高的突变率和低的正变率。在“马鞍”区域内，注射剂量适宜，突变率相对较高，正突变率也较高。3、高产菌株的初次筛选将菌液在最佳注入剂量下进行N+离子注入诱变处理，适当稀释后涂布于初筛平板上。初筛选用双层平板，下层为发酵固体培养基，上层为牛奶培养基，将随机挑选的 100株菌依次编号Y-1-Y-100，一一对应点接于平板下层培养基；每板点接5株诱变菌，每株菌作一支平行，并点接原始菌做对照，34°C培养54h后，将定量的牛奶培养基均勻倾注于平板上，10°C放置12h，计算透明圈直径与菌落直径之比，每板挑选2个比值大于原始菌的突变株。按此方法筛选3轮，初步选定Y-13、Y-22、Y-44、Y-66、Y-77、Y-95六株突变株进行复筛。4、高产菌株的再次筛选将初筛筛得的6株菌分别进行摇瓶发酵培养，以54h酶活力作为复筛标准，重复三次。各个突变株酶活如表3所示，其中突变株Y-22产酶活力最高，达30700U/mL，比初始菌株提高了 37. 7%。5、碱性蛋白酶高产菌株的确定对以上诱变试验中筛选得到的高产突变株进行连续传代试验，测其酶活力，考察其遗传性状的稳定性，筛选到可以最终应用于生产上的菌株。对突变株Y-22连续传代5次，以54h发酵粗酶液活力为标准，结果如表4所示，传代五次后，产酶能力保持稳定，这与报道的离子注入诱变后，菌株的优良性状可稳定遗传相一致，突变株Y-22即为高产碱性蛋白酶菌株。6、碱性蛋白酶高产菌株摇瓶水平发酵产蛋白酶从斜面上挑取一环新培养的嗜碱芽孢杆菌Y-22接入种子培养液中(50mL种子培养基/250mL三角瓶)，200r/min，34°C培养12h，2% (ν/ν)接种量转接至液体发酵培养基。 34°C，200r/min，挡板三角瓶(50mL发酵培养基/250mL挡板三角瓶)中振荡培养，每间隔一定时间后，将发酵液离心，以福林酚法测定粗酶液活力，结果附图3所示。7、碱性蛋白酶高产菌株7L发酵罐发酵工艺从斜面上挑取一环新培养的嗜碱芽孢杆菌Y-22接入种子培养液中(50mL种子培养基/250mL挡板三角瓶)，200r/min，34°C培养12h，按照5% (ν/ν)的接种量转接入7L发酵罐，发酵罐装液量0. 65。温度34°C，转速200 500r/min，通风量1 0. 5 1 2.5， 溶氧维持在20 30%。发酵过程中流加氨水及20% (ν/ν)的盐酸，使发酵液ρΗ值维持在 7. 0。采用该工艺连续发酵三批，如附图4所示，发现在该流加工艺控制工艺下，菌株从20h 开始产酶，25h进入产酶高峰期，55h达到最大值，酶活力平均在36000U/mL稳定，此后，酶活力开始迅速下降。8、碱性蛋白酶高产菌株30L发酵罐发酵工艺从斜面上挑取一环新培养的嗜碱芽孢杆菌Y-22接入种子培养液中(IOOmL种子培养基/500mL挡板三角瓶)，200r/min，34°C培养12h，按照5% (ν/ν)的接种量转接入30L发酵罐，发酵罐装液量0. 7。温度;34°C;转速100 600r/min;通风量1 0. 5 1 2.5;溶氧维持在20 30%。发酵过程中自动流加氨水及20% (ν/ν)的盐酸，使发酵液ρΗ值维持在7. 0。采用该工艺连续发酵三批，如附图5所示，发现在该流加工艺控制工艺下，30h以后，碱性蛋白酶大量合成，到达50h时，酶活力最高38600U/mL。54h以后，产酶速度变慢，活力下降，很快菌体进入消亡期，同时PH值迅速上升。9、碱性蛋白酶高产菌株200L发酵罐发酵工艺从斜面上挑取一环新培养的嗜碱芽孢杆菌Y-22接入种子培养液中(IOOmL种子培养基/500mL挡板三角瓶)，34°C振荡培养12h，按2% (ν/ν)的接种量于30L种子培养基，34°〇，溶氧维持在20 30%，1011。按照5% (ν/ν)的接种量转接入200L发酵罐，发酵罐装液量0. 7。温度34°C ；转速250 450r/min ；通风量1 0. 5 1 1. 5 ；溶氧20 30%。发酵过程中自动流加氨水及20% (ν/ν)的盐酸，使发酵液ρΗ值维持在7.0。如附图6所示，发现在该流加工艺控制工艺下发酵36h时，酶活力达到最大值4. 2 X 104U/mL。200L发酵罐中细胞生长延滞期缩短，生长迅速，产酶期也相应提前，整个产酶期均以较高的速率产酶。培养基(1)保藏/活化培养基(g/L)牛肉膏8，酵母浸粉2，多聚蛋白胨5，NaCl 2，琼脂17，酪蛋白 4，K2HPO418，ρΗ 自然。(2)种子培养基(g/L)酵母浸粉5，胰蛋白胨5，葡萄糖10，K2HPO4 18，ρΗ自然。(3)发酵培养基(g/L)酵母浸粉17，棉籽饼粉30，麦芽糊精100，柠檬酸钠3，氯化钙 2. 6，K2HPO4 18，ρΗ 自然。(4)牛奶培养基(g/L)脱脂奶粉100，琼脂20，ρΗ自然。(5)产芽孢培养基(g/L):酵母膏0.7，蛋白胨1，葡萄糖1，(NH4)2SO4 0.2,MgSO4. 7Η200· 2，K2HPO4 1，ρΗ7· 2，固体培养基加 1.8% (w/v)的琼脂。10、碱性蛋白酶活力的测定采用《中华人民共和国轻工业标准》QB/T1805. 3-93工业酶制剂通用实验方法，即福林(Folin)法。11、酶的纯化工艺取发酵液100ml，8000r/min离心lOmin。取上清液，以饱和度70 %的固体硫酸按进行盐析，8000r/mln离心IOmin收集沉淀。将沉淀溶于Tris-HCI(pH8. 8)缓冲液中，在相同的缓冲液中进行透析除盐。离心除去少量不溶物，取上清液过 DEAE-S印haroseCL-6B 离子交换柱进行纯化，以 20mMTris-Hcl (pH8. 8，含 IOmMNacl)缓冲液进行洗脱。碱性蛋白酶未被吸附，先被洗脱下来，得到无色透明的液体。收集酶液进行真空冷冻干燥，得到纯酶粉进行进一步分析。如图4所示，SDS-PAGE蛋白电泳表明纯化后的样品已达到电泳纯，分子量为28kDa0回收率为27. 54%，纯化倍数为5. 23倍，比活力可达18620. 20U/mg。12、对酶的性质进行研究。
以酪蛋白为底物时，分别测定碱性蛋白酶在pH5、6、7、8、9、10、ll、12、13下的相对酶活(附图8);在？!15、6、7、8、9、10、11、12、13下401保温111后的相对酶活(附图9)；在30、40、50、60、70、80、90°C下的相对酶活(附图 10)；在 ρΗΙΟ. 5 下 45、50、55、60、65°C分别保温20、40、60、80、100、120min后的相对酶活(附图11)。可以得到其最适作用pH为10. 5，最适作用温度为40°C。该酶在pH7 12的范围内稳定，在45 50°C左右有较好的热稳定性。表1原始菌株的酶活
权利要求
1.一种碱性蛋白酶高产菌株，其特征在于名称为Y-22，分类命名为嗜碱芽孢杆菌 Bacillus alcalophilus，保藏编号为CGMCC No. 5313，保藏日期2011 年 9 月 30 日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种碱性蛋白酶，其特征在于由权利要求1所述的碱性蛋白酶高产菌株发酵得到。
3.根据权利要求2所述的碱性蛋白酶，其特征在于所述碱性蛋白酶分子量为28kDa。
4.根据权利要求2所述的碱性蛋白酶，其特征在于所述碱性蛋白酶当以酪蛋白为底物时，其最适作用pH为10. 5，最适作用温度为40°C，在pH7 12的范围内稳定，在40 50°C有较好的热稳定性。
5.一种如权利要求2所述的碱性蛋白酶的发酵方法，其特征在于发酵所用培养基为 发酵培养基g/L 酵母浸粉15-20、棉籽饼粉25-35、麦芽糊精90-110、柠檬酸钠1_5、氯化钙 2-5、K2HPO4 15-20、pH 自然、溶剂为水；发酵条件为温度30-40°C ；转速100 600r/min ；通风量1 0. 5 1 2. 5 ；溶氧维持在20 30%，发酵过程中自动流加氨水及20% (ν/ν)的盐酸，使发酵液pH值维持在 7. 0。
6.一种如权利要求2-5任一所述的碱性蛋白酶作为洗涤剂添加剂的应用。
7.—种如权利要求2-5任一所述的碱性蛋白酶在皮革行业的应用。
8.—种如权利要求2-5任一所述的碱性蛋白酶在食品行业的应用。
全文摘要
本发明涉及碱性蛋白酶高产菌株及碱性蛋白酶，其中菌株的分类命名为嗜碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus，保藏编号为CGMCC No.5313，保藏日期2011年9月30日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，酶由碱性蛋白酶高产菌株发酵得到。本发明中诱变获得的产碱性蛋白酶菌株是由嗜碱芽孢杆菌经过低能N+离子注入诱变而得的碱性蛋白酶高产菌株，有效地提高了菌株的产酶能力，其碱性蛋白酶的摇瓶活力最大值到30700U/mL，较出发菌株提高了37.7％。
文档编号C12N9/54GK102382786SQ201110333678
公开日2012年3月21日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者刘敏尧, 刘逸寒, 刘靓, 王建玲, 王春霞, 薄嘉鑫, 路福平 申请人:天津科技大学