专利名称:一种碱性低温蛋白酶海洋菌株、低温碱性蛋白酶及其生产方法
技术领域：
本发明涉及微生物及微生物发酵领域，具体涉及一种细菌产生的、具有低最佳酶反应温度的蛋白酶、产生该酶的微生物菌种及其生产该酶的方法。
背景技术：
蛋白酶是目前应用最多的一种酶，占全球酶工业市场份额的60 65 %。目前使用的蛋白酶基本上都是中温酶。与中温蛋白酶相比，低温蛋白酶在低温下(< 10°c )能保持活性，Keat值和生理效率(Keat/Km)高，有着更高的催化活性等特征，因此低温蛋白酶比中温蛋白酶更具应用价值。低温蛋白酶应用于食品、洗涤剂、化妆品、水产饲料等工业上，有着中温蛋白酶无法取代的优越性。来源于微生物的低温蛋白酶用于洗涤行业已有一些报道，例如丹麦NOVO公司的Savinase 4.0T碱性低温蛋白酶。国内，公开号为CN1109750C的专利提供了一种碱性低温蛋白酶、制造方法、应用和产生该蛋白酶的微生物，涉及一种新的黄杆菌属未知菌株YS9412-130，由该菌株或其突变体产生的新型碱性低温蛋白酶；公开号为CN1611596A的专利提供了一种低温蛋白及其生产方法，涉及一种假单胞菌C15-3CGMCCN0.1021，一种碱性低温蛋白酶及其制备方法，涉及一种细菌和从细菌得到的蛋白酶。公开号为CN1670187A的专利提供了一种从南极深海泥样获得并经分离成为纯培养物的菌株海杆菌属R2、从R2菌株得到的碱性低温蛋白酶及其制备方法。但总的而言，国内外目前菌种之间的差异性较大，存在所产生菌的酶特性差异，包括最适作用条件、热稳定性、对底物的水解特性等。在现有的研究水平下，可供研究的菌种及其产生的酶十分稀少。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种可生产碱性低温蛋白酶的海洋菌株。
本发明的目的之二在于提供一种较低的温度下具有较高的酶学活性的碱性低温蛋白酶。
本发明的目的之三在于提供一种利用可生产碱性低温蛋白酶的海洋菌株生产碱性低温蛋白酶的方法。
本发明可生产碱性低温蛋白酶的海洋菌株，其为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.) B8453013, 2009年9月14日保存于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.:3281。该菌株通过对来源于加拿大海盆的海水样本进行微生物菌种的培养、分离与筛选，获得一批嗜(适)冷菌株，并从中筛选获得一株低温蛋白酶高产菌株，标号为B8453013，从而提供了一种低温蛋白酶产生菌株，其具有产低温蛋白酶的优良特性，经16S rRNA鉴定，属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)。B8453013细胞呈短杆状(0.4 μ mX 2 3 μ m),单个排列，单端生鞭毛。革兰氏染色为阴性。该菌株在2216培养基表面，菌落圆形、低突起、有光泽、乳白色、不透明。在酪蛋白培养平皿上可产生明显的透明圈。该菌种产生的低温蛋白酶最适反应温度为25°C，最适pH为9-10。
本发明的微生物菌种，可产生碱性低温蛋白酶，生产该蛋白酶的DNA的核苷酸序列如序列〈400>1所述，且与B8453013的16S rDNA的同源性为100%的同源性。该菌株可由保藏的菌种分离，或从海洋环境中培养、筛选。另外，该菌种可通过自然及人工的诱导变异的菌株，只要产生下述蛋白酶特性的菌株皆在此范围。
本发明所涉及的产生低温蛋白酶的微生物菌种，其在分类学意义上属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas),本发明菌种从加拿大海盆海水样本中分离获得。
本发明涉及的低温蛋白酶菌株，其16S rDNA序列如序列〈400>1所述。
本发明低温蛋白酶的产生菌种，可以是自然筛选的原始菌株，或通过自然变异或人工诱导变异的变异菌株。
作为上述变异菌株的研制方法，包括物理诱变异，如紫外线辐射处理、钴60辐射处理、粒子注入处理、激光辐照等各种射线处理；化学诱变，如亚硝基胍、硫酸二乙酯等化学诱变处理，用常规蛋白酶产生菌分离筛选培养基及方法筛选出生产性能优量的菌株。
另外，也可通过分子生物学技术，从原始菌株或诱导变异菌中获取低温蛋白酶基因，将基因转入受体菌，构建基因工程生产菌株，也可产生作为本发明的低温蛋白酶产生菌种。
作为本发明的低温蛋白酶产生菌种B8453013，可采用如下方法对其进行保存、复壮与筛选，及摇瓶发酵获得本发明的碱性低温蛋白酶。
本发明的低温蛋白酶产生菌种B8453013可采用常规的斜面传代保存，此法是将本发明涉及的菌种接种于适合于细菌生长的斜面培基表面，10-15°C培养3-5天，再置于4°C下保藏，可存放3个月；或是`利用真空冷冻干燥法将本发明菌种制成干粉菌种，低温或常温保藏可达I年以上。
本发明菌株的菌株活化包括菌株复壮和菌株筛选，具体如下:
菌株复壮是将碱性低温蛋白酶海洋菌株接种于适合其生长的复壮培养基表面，10-15°C培养3-5天，菌株筛选是将经复壮的菌株接种至筛选培养基表面，10-15°C培养3-5天，菌落周围产生明显的透明圈，挑取透明圈与菌落直径比最大的菌株作为后续发酵用菌株。所述复壮培养基优选为2216培养基，所述筛选培养基优选为含有lwt%脱脂奶粉的2216培养基；所述2216培养基的成分以重量计为:蛋白胨0.5%，酵母膏0.1%，NaCl 11.738%, KCl 0.332%, KBr 0.048%, MgCl2.6H20 5.305%, SrCl2.6H20 0.020%,CaCl2.2Η20 0.7345%, Na2SO4 1.9585%, NaHCO3 0.096%, H3BO3 0.013%, (NH4)2SO40.5%,去离子水，ρΗ9.0。
本发明的碱性低温蛋白酶，其酶学特征为:
I)最适反应温度为25°C，在25°C-30°C范围内酶活力高，温度高于60°C后，酶基本不具备活力，表现出明显的低温蛋白酶特性；在0°〇-30°C内酶活力稳定，50°C、60°C和70°C处理IOmin后，蛋白酶的活性仅为原活性的70%、42%和7%，25°C保温30min后仍保持100%的活性，符合低温蛋白酶对热敏感的特性；
2)最适pH为9-10，属于碱性蛋白酶；
3)该酶受丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF抑制，金属蛋白酶抑制剂EDTA以及半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64对蛋白酶活性无影响，表明该蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶；[0021]4)金属离子Ni2+、Zn2+、Hg2+、Cu2+、Fe3+、Ca2+、和Mg2+可部分抑制酶的活性，而DTT和巯基乙醇等还原剂及Triton X-100和吐温-80等表面活性剂对酶活性无显著影响。
本发明碱性低温蛋白酶的生产方法，其特征在于包括以下步骤:
a、菌株活化；
b、发酵；将菌株直接接种于发酵培养基中发酵，或者是将菌株先进行液体增殖培养，再接种于发酵培养基中发酵；发酵的条件为:接种量5-15%，发酵温度为5-30°C，pH为6-10，转速为150-200转/分钟，发酵周期为72-120小时；
c、收集碱性低温蛋白酶；从发酵所得培养液中收集碱性低温蛋白酶即得成品。
所述发酵温度优选为10_15°C，所述发酵步骤中的pH优选为9-10。
作为发酵培养基的碳源，可广泛使用通常用于细菌培养的营养源。例如，可使用淀粉、乙酸钠、玉米粉、葡萄糖、麦芽汁、蔗糖、水解糖、可用的多糖等。其用量依据其它营养源的选择不同及培养条件的差异而有所不同。本发明发酵培养基中的碳源优选为柠檬酸钠，用量优选为发酵培养基总量的0.5-lwt%。
作为发酵培养基的氮源，也可广泛使用通常用于细菌培养的营养源，例如铵盐、硝酸盐、酪蛋白、玉米浆、酵母膏、豆柏、明胶、蛋白胨、尿素、硝酸钾等。其氮源的选择和用量，可依据其它营养源的成分和用量的不同而不同，只要适合于本发明的低温蛋白酶产生菌的培养及发酵产生既可。本发明发酵培养基中的氮源优选为酪蛋白，用量优选为发酵培养基总量的0.5-lwt% ο
作为发酵培养基的产酶促进剂，可适量添加吐温系列的表面活性剂，添加量依据培养基的不同而定，只要适合促进培养过程产生本发明的蛋白酶既可。本发明发酵培养基中的产酶促进剂优选为吐温-80，用量优选为发酵培养基总量的0.05-0.lwt%。
本发明发酵培养基的成分及重量组成优选为:酪蛋白0.5%，柠檬酸钠0.5%，蛋白胨 0.5%，酵母膏 0.1 %，NaCl 11.738%, KCl 0.332%, KBr 0.048 %, MgCl2.6H205.305%, SrCl2.6H20 0.020%, CaCl2.2H20 0.7345%, Na2SO4 1.9585%, NaHCO3 0.096%,H3BO30.013%, (NH4)2SO4 0.5%, Tween-80 0.05%，去离子水，pH9.0。
经上述培养，主要在菌体外(培养液中)产生目的蛋白酶。
从如上所得的培养液中收集低温蛋白酶，可按照通常用于采集细胞外酶的方法，如硫酸铵盐析、超滤浓缩、冷冻干燥、色谱分离等，由分离精制而进行。
S卩，可由下述方法获得本发明的低温蛋白酶:由过滤法或离心分离法从培养液中得到上清液或滤液，对这些分离液进行或不进行浓缩，添加可溶性盐类，使酶沉淀的盐析法；添加亲水性的有机溶剂，使酶或夹杂物沉淀的有机溶剂沉淀法；使用离子交换树脂等的吸附洗脱法；凝胶过滤法；添加稳定辅助剂或不添加稳定辅助剂的喷雾干燥法；单独或多个组合使用冷冻干燥法等分离或精制方法。
通过实施本发明具体的技术方案，实现本
发明内容
，可以达到以下有益效果。
本发明的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)菌株B8453013及其与其同等的菌株或其变异株，可有效地应用于产生本发明的低温蛋白酶。其次，该低温蛋白酶在低温下(25°C -30°C )具有较高酶活性，且具有较高的低温稳定性(25°C保温30min后仍保持100%的活性)；另外，本发明的优点在于，使用所述菌株制造具有上述性质的低温蛋白酶的方法可有效地产生所述的低温蛋白酶，其酶活可达80-110U/mL，并且由于该方法所产蛋白酶存于培养液中，便于收集精制。
保藏说明
1、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)B8453013, 2009 年 9 月 14 日保存于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.:3281o
图1为本发明的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)菌株B8453013产生的低温蛋白酶最适反应pH值图表。
图2为本发明的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)菌株B8453013产生的低温蛋白酶最适反应温度图表。
图3为本发明的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)菌株B8453013产生的低温蛋白酶热稳定性图表。
具体实施方式
以下通过结合附图、序列表及实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
低温蛋白酶产生菌(B8453013)的活化培养
将低温蛋白酶产生菌B8453013接种于2216培养基表面，15°C培养3天，进行复壮。再将其接种于含0.lwt%脱脂奶粉的2216培养基中进行筛选，15°C培养3天可在菌落周围可产生明显的透明圈，挑取透明圈与菌落直径比最大的菌株作为后续发酵用菌株。2216培养基的成分以重量计为:蛋白胨0.5%，酵母膏0.1 %，NaCl 11.738%, KCl
0.332%,KBr 0.048%,MgCl2.6Η20 5.305%, SrCl2.6Η20 0.020%, CaCl2.2Η20 0.7345%,Na2SO4L 9585 %, NaHCO3 0.096 %, H3BO3 0.013%, (NH4)2SO4 0.5 %，去离子水，ρΗ9.0，
0.1Mpa蒸汽灭菌15分钟。
实施例2:低温蛋白酶产生菌(Β8453013)的发酵培养-1
本实施例是将筛选所得发酵用菌株直接接种于发酵培养基中培养。具体为:
将发酵用菌株斜面接种于发酵培养基中，每250mL摇瓶装发酵培养基lOOmL，培养条件为:15°C，150转/分钟，发酵培养72小时，酶活力达到97U/mL。发酵培养基的成分以重量计为:酪蛋白0.5%，柠檬酸钠0.5%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.1%, NaClll.738%, KCl
0.332%,KBr 0.048%,MgCl2.6Η20 5.305%, SrCl2.6Η20 0.020%, CaCl2.2Η20 0.7345%,Na2SO4 1.9585%, NaHCO3 0.096%, H3BO3 0.013%, (NH4)2SO40.5%, Tween-80 0.05%，去离子水，pH9.0,0.1Mpa蒸汽灭菌15分钟。
往所得的蛋白酶液(即发酵培养液)中加硫酸氨至70%饱和度，离心取沉淀，再以常规的方法脱盐后，冷却干燥得低温蛋白酶的原粉。
实施例3:低温蛋白酶产生菌(B8453013)的发酵培养-1I
本实施例是将筛选所得发酵用菌株先进行液体增殖培养，再接种于发酵培养基中发酵。具体为:
将低温蛋白酶产生菌种斜面接种于2216培养基中增殖，15°C，150rpm，培养24小时后，将培养物以15%接种量加入到发酵培养基中发酵。2216培养基成分与实施例1中相同。发酵培养基成分与灭菌方法同实施例2中的发酵培养基成分与灭菌方法。发酵培养为每250mL摇瓶装发酵培养基50mL，培养条件为:15°C，200转/分钟，发酵培养72小时，酶活力达到110U/mL。
往所得的蛋白酶液(即发酵培养液)中加硫酸氨至70%饱和度，离心取沉淀，再以常规的方法脱盐后，冷却干燥得低温蛋白酶的原粉。
实施例4:酶活性的测量方法
取ImL 稀释酶液(50mmol/L Tris.HCl (pH7.5)进行稀释),在 40°C下保温 Imin,加入ImL同样温度的底物(用50mmol/L Tris.HCl (pH8.0)缓冲液配制的2%酪蛋白作为底物)，40°C下反应IOmin后，加入2mol/L 10%三氯乙酸终止反应。40°C保温15min后，12000rpm离心15min,取ImL上清液加入5mL 0.4mol/L碳酸钠和ImL福林试剂混勻,40°C保温20min后，用分光光度计测定660nm处OD值。酶活力定义为在40°C下，每mL酶液催化酪蛋白水解形成I μ g酪氨酸的酶量为I个单位(U/mL)。
实施例5:低温蛋白酶最适pH
将上述制备的稀释酶液分别加入到醋酸钠(PH5)，柠檬酸磷酸盐(pH5 7)，磷酸(pH6 8), Tris.Cl (pH8, pH9),甘氨酸氢氧化钠(pH9, pHIO)及碳酸盐(pHIO, pHll)6 个溶液中，4°C保存2h后，按实施例4中的蛋白酶活性测定方法测定酶的活力。本发明制备的蛋白酶酶最适PH值如图1所示，本发明菌株ArcB82306分泌的蛋白酶在pH5_l I均有活性，且在pH9左右表现出较高活力，属于碱性蛋白酶。
实施例6:低温蛋白酶最适温度
设置O °C、5 °C、10 °C、15 °C >20 °C >25 °C >30 °C >40 °C >45 °C >50 °C >60 °C >70 °C >80 V、90°C UOO0C 15个温度梯度，按实施例4中的蛋白酶活性测定方法测定不同温度下的由本发明上述步骤制备的蛋白酶活力，以确定其最适温度。蛋白酶酶最适温度如图2所示，本发明制备的蛋白酶最适反应温度为25°C，在25 30°C范围内酶活力高，温度高于60°C后，酶基本不具备活力。
实施例7:低温蛋白酶的热稳定性
将上述制备的稀释酶液分别在15°C、25°C、40°C、50°C、6(TC和70°C 6个温度条件下依次水浴保温10min、20min、30min、40min和50min，然后放入冰水混合物中，与未被保温处理的酶活力相比较，按实施例4中的蛋白酶活性测定方法测定蛋白酶剩余活力。低温蛋白酶的热稳定性如图3所示，本发明制备的蛋白酶在O 30°C内酶活力稳定，50°C、60°C和70°C处理IOmin后，蛋白酶的活性仅为原活性的70%、42%和7%。
实施例8:各种抑制剂对酶活的影响
在酶的最佳反应温度和最佳反应pH值条件下，于酶反应体系中加入不同抑制齐U，按实施例4中的蛋白酶活性测定方法测定酶活，并以未加抑制剂的酶活力为100%，计算加入化学成份后的残余活力。各种抑制剂对本发明制备的蛋白酶的酶活的影响结果见表I。从表中可以看出，丝氨酸蛋白酶抑制剂(苯甲基磺酰氟PMSF)作用最强；金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸EDTA，以及半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64对本发明制备的蛋白酶活性无影响。各种金属离子对蛋白酶活性的影响也存在差异，其中以Cu2+的抑制作用最强，其次为Fe3+，而Mg2+和Zn2+的抑制作用最弱。还原剂
如二硫苏糖醇DTT和β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)
及表面活性剂
如曲拉通X-1OO (Triton X-100)和吐温-80 (Tween-80)
对酶活活性无显著影响，而变性剂(如十二烷基硫酸钠SDS)对蛋白酶的抑制作用较强。
表1各种抑制剂对酶活的影响
权利要求
1.一种碱性低温蛋白酶海洋菌株，其为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)B8453013，2009年9月14日保存于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编`号为CGMCC N0.:32810
专利摘要
本发明公开了一种产生低温蛋白酶的海洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)B8453013(菌种保藏编号为CGMCC No.3281)和利用此菌株生产低温蛋白酶的生产方法，同时还提供了低温蛋白酶。通过利用假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)B8453013，建立菌种保藏、复壮及选育的系统方法，经过培基优化筛选及发酵工艺条件优化控制，确立了生产低温蛋白酶的方法，生产出的低温蛋白酶具有良好的低温活性和高酶活。可广泛应用于洗涤剂、饲料、皮革、食品加工等工业。
文档编号C12N1/20GKCN102120974 B发布类型授权 专利申请号CN 201010586973
公开日2013年9月11日 申请日期2010年12月14日
发明者陈吉刚, 杨季芳, 毛芝娟 申请人:浙江万里学院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3), 非专利引用 (1),