皮肤美白用化妆料组合物的制作方法

皮肤美白用化妆料组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及皮肤美白用化妆料组合物，其包含白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物，其具有如下效果：在单独使用了所述植物提取物时，未明显显示出DPPH自由基清除能力、脂质过氧化抑制能力及还原力，但在它们的混合提取物中DPPH自由基清除能力、脂质过氧化抑制能力及还原力均显著地提高，并在混合提取物中，抑制在黑色素生成初期阶段中涉及到的蛋白质即酪氨酸酶的活性，并有意识地减少TRP-1，显示出比周知为具有美白功能成分的熊果苷更加优异的美白效果，因此能够用来制造美白功能性化妆品。
【专利说明】皮肤美白用化妆料组合物
【技术领域】
[0001]本发明涉及具有皮肤美白效果的新型天然植物混合提取物，更具体地，涉及包含白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物的皮肤美白用化妆料组合物。
【背景技术】
[0002]人的肤色是根据黑色素、叶红素及血红蛋白的量而决定的，其中最为决定性的要素是黑色素。黑色素在存在于皮肤(表皮)内的基底层的色素细胞即黑素细胞(melanocyte)中合成而转移到周边角质细胞(Keratinocyte)来显现出人的肤色。如果黑色素的生成异常地少，则引发白斑症(Vitiligo)这样的皮肤病变。相反地，如果生成过多，则形成中年女性的主要烦恼之一的黑痣、雀斑，并且与皮肤癌也有密切的关系。
[0003]在此，对美白作用进行更加详细的说明。黑色素是在存在于皮肤表皮的基底层的叫作黑素细胞的细胞中，由酪氨酸(Tyrosine)经过酶及非酶性氧化反应而生成的，并转移到构成表皮的角质细胞。作为参与黑色素的生合成的重要的酶，有酪氨酸酶(Tyrosinase)、酪氨酸酶相关蛋白I (Tyrosinase — Related proteinl)及多巴色素互变异构酶(dopachrome tau tomerase)。除了酪氨酸酶之外,该两个酶也引人注目，但是在黑色素合成中起到决定性作用的酶是酪氨酸酶。黑色素的生合成的第一步骤是根据酪氨酸酶而引发的。根据酪氨酸酶，酪氨酸成为多巴(Dopa),将该多巴制造为多巴醌(Dopa — quinone)。众所周知，根据非酶性反应也能够进行该两个反应的下一个步骤过程，但单独通过酪氨酸酶也能够生成黑色素。
[0004]最近，提出了关于根据皮肤细胞内的信号传达物质的表达而形成黑色素的过程的新理论。当皮肤暴露在紫外线中时，引发炎症的白细胞介素一 a (Inter lukin —)由上皮(Epidermis)内的角质细胞(Keratinocyte)表达，该白细胞介素α促进内皮素(Endothelin)的表达。这样的一系列的过程增加黑素细胞的形成，激活黑素细胞。在这样形成的黑素细胞内的黑素体中，酪氨酸通过酪氨酸酶而形成黑色素。
[0005]另外，NF-kB应对多种刺激响应性地被激活，从而对于免疫、增生、炎症等，提高各种基因的表达。据称NF-kB的过度激活关系到癌、类风湿、干癣等，目前在全世界范围内研发NF-kB抑制剂。并且，得知NF-kB还存在于皮肤的表皮角质细胞或真皮纤维细胞，因紫外线或炎症等的刺激，NF-kB被过度激活，转录活性提高。NF-kB的过度激活造成细胞中的感染性细胞活素的生成，因该细胞活素导致进一步的NF-kB的表达。另外，促进作为细胞增生因子的bFGF (basic fibroblast growth factor)或细胞外基质金属蛋白酶MMP — I的生成，引起由表皮角质细胞的过度增生或角质异常导致的表皮的肥厚、由黑素细胞的增生导致的色素的沉淀、由MMP — I的真皮胶原蛋白的分解导致的皮肤弹性的下降等，这关系到皮肤的光老化。
[0006]生成作为皮肤的黑色素细胞的色素的表皮黑素细胞因紫外线或慢性炎症等而增加，这导致皮肤中的黑色素生成量增加。
[0007]在受感染时，NF-kB在表皮角质细胞中被过度地表达而促进具有黑色素细胞增生作用的bFGF在表皮角质细胞中的生成。即，抑制NF-kB的作用的物质显现出防止由炎症或紫外线导致的黑痣或雀斑等的色素沉淀的效果。
[0008]因为抗环血酸(日本特开平4-9320)、对苯二酚(日本特开平6-192062)、曲酸(日本特开56-7710)、熊果苷(日本特开平4-9315)及一部分化合物具有酪氨酸酶阻碍作用，因此已经作为美白化妆料的原料而使用，但因为如下问题而其在处方界的使用受到限制:因稳定性低，分解而着色，或者产生异味，在活体级上的功效、效果的不确定及安全性问题等。并且，虽然论证了酪氨酸酶的抑制效果，但是在与实际活体级类似的实验中，其效果较低，并且对苯二酚被规定为致癌物质，因此被禁止使用。
[0009]因此，目前需要研发稳定性优异，且具有突出的皮肤美白活性的天然物质。
[0010]韩国授权专利第0562348号
[0011]韩国授权专利第0850686号

【发明内容】

[0012]本发明人为了寻找有效改善皮肤美白的物质，从大自然的各种天然物质中筛选了对皮肤美白有效的物质，其结果查明了在白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物中具有非常优异的皮肤美白效果，从而完成了本发明。
[0013]因此，本发明的目的在于提供一种作为有效成分而包含白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物的皮肤美白用化妆料组合物。
[0014]为了达到上述目的，本发明提供作为有效成分而包含白茯苓、榆白皮及甘草混合提取物的皮肤美白用化妆料组合物。
[0015]在本发明的一实施例中，所述白茯苓提取物在化妆料组合物的总重量份中占
0.001~2重量％，榆白皮提取物在化妆料组合物的总重量份中占0.001~2重量％，甘草提取物在化妆料组合物的总重量份中占0.001~5重量％。
[0016]在本发明的一实施例中，所述白茯苓、榆白皮及甘草混合提取物使用从以下的组中选择的溶剂而进行提取:水、碳数为I~4个的无水或含水低级醇、丙酮、乙酸乙酯、醋酸异丁酯以及1，3-丁二醇。
[0017]在本发明的一实施例中，所述化妆料组合物具有酪氨酸酶活性阻碍和/或者黑色素生合成阻碍效果。
[0018]在本发明的一实施例中，所述化妆料组合物形成为从以下的组中选择的剂型--溶液、悬浮液、乳液、糊状物、凝胶、膏状物、护肤液、粉、香皂、含有表面活性剂的洗面奶、油、粉末状粉底、乳液状粉底、蜡型粉底及喷雾。
[0019]本发明涉及包含白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物的皮肤美白用化妆料组合物，其具有如下效果:在单独使用了所述植物提取物时，未明显显示出DPPH自由基清除能力、脂质过氧化抑制能力及还原力，但在它们的混合提取物中DPPH自由基清除能力、脂质过氧化抑制能力及还原力均显著地提高，并在混合提取物中，抑制在黑色素生成初始阶段中涉及到的蛋白质即酪氨酸酶的活性，并有意识地减少TRP-1，显示出比周知为具有美白功能成分的熊果苷更加优异的美白效果，因此能够用来制造美白功能性化妆品。
【专利附图】

【附图说明】[0020]图1是为了了解在本发明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物中是否存在细胞毒性而进行MTT assay分析的结果。
[0021]图2是为了了解在本发明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物中是否存在抗氧化活性而确认DPPH自由基清除能力的结果。
[0022]图3是为了了解在本发明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物中是否存在抗氧化活性而测定了还原力的结果。
[0023]图4是为了了解在本发明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物中是否存在抗氧化活性，根据轻自由基(hydroxyl radical)而测定了 DNA的氧化损伤与否的结果。
[0024]图5是为了了解在本发明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物中是否存在抗氧化活性而测定了脂质过氧化程度的结果。
[0025]图6是为了了解在本发明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物中是否存在美白活性而测定了酪氨酸酶活性的结果。
[0026]图7是为了了解在本发明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物中是否存在美白活性而测定了黑色素生成程度的结果。
[0027]图8是为了了解在本发明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物中是否存在美白活性而确认了酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2及S0D-1的蛋白质表达程度的结果。
【具体实施方式】
[0028]本发明为了寻找有效改善皮肤美白的物质，从大自然的各种天然物质中筛选了对皮肤美白有效的物质，其结果确认了在白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物中具有非常优异的皮肤美白效果。
[0029]因此，本发明的特征在于，提供一种作为有效成分而包含白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物的皮肤美白用化妆料组合物。
[0030]特别是，本发明人在为了寻找来自天然物质而对人体稳定且体现显著的美白效果和抗氧化效果的素材而摸索的过程中，关注到白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物，并通过实验来确认了实际上是否具有美白效果。
[0031]即，根据本发明的一实施例，为了以本发明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物为对象测定DPPH自由基清除能力，对Brand — Williams实验方法进行变形，测定了对于
I,l-diphenyl-2-picryIhydrazyI (DPPH)自由基的 PCEE> GUEE> UMEE> PGUE 组的清除能力，其结果显示:分别单独处理的组和处理了混合溶液的组的对于DPPH自由基的消除能力与浓度成正比地增加，特别是作为它们的混合物的PGUE在15.6 μ g/ml浓度以上中显示出78%的DPPH自由基消除能`力。这表明与作为阳性对照组的100 μ g/ml的维生素C相比，PGUE的清除能力高10% (参照图2)。
[0032]根据本发明的另一实施例，以本发明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物为对象测定了还原力，其结果显示:在本发明的白茯苓、甘草及榆白皮酒精提取物的混合物(PGUE)中未显示出还原力，但是GUEE、UMEE, PGUE组的还原力与浓度成正比地增加。GUEE在62.5 μ g/ml浓度中显示出150 %的还原力，UMEE和PGUE在62.5 μ g/ml的浓度中，UMEE显示出350%的还原力，PGUE显示出270%的还原力，由此可知与作为阳性对照组而使用的10 μ g/ml的维生素C相比，还原力优异(参照图3)。[0033]根据本发明的另一实施例，为了了解在本发明的混合提取物中是否存在对于脂质过氧化的抗氧化活性，对于各种浓度的亚油酸悬浮液进行处理之后测定了抗氧化活性，其结果如下:在分别处理了白茯苓、甘草及榆白皮酒精提取物的组中未显示出有效的抑制效果，但作为白茯苓酒精提取物、油溶性甘草提取物及榆白皮酒精提取物的混合物的本发明的PGUE在7.8 μ g/ml以上的浓度下抑制17%的脂质过氧化，在15.6 μ g/ml的浓度下，与作用阳性对照组而使用的1000yg/ml的维生素E类似地，抑制了 20%程度的脂质过氧化(参照图5)。
[0034]因此，具有抗氧化活性的本发明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物可用作功能性化妆料。
[0035]另外，根据本发明的另一实施例可知，本发明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物与将白茯苓、甘草及榆白皮提取物单独处理的组相比，酪氨酸酶活性抑制效果及黑色素合成抑制效果优异(参照图6及7)。
[0036]进而，为了确认在本发明的白茯苓、甘草及的榆白皮酒精提取物的混合物(PGUE)中是否存在作为黑色素形成中的重要的酶的酪氨酸酶和在黑色素生成信号传达机制中重要的 TRP_l(tyrosinase related protein — I)和 TRP-2 (tyrosinase related protein —2)及在抗氧化酶中作为最重要的SOD (Superoxide dismutase)的S0D-1的蛋白质表达,进行了蛋白质印迹分析，其结果可知:本发明的混合提取物与对照组相比，在3.12 μ g/ml浓度下，对TRP-2和酪氨酸酶的蛋白质表达不产生影响，但减少了 TRP-1及S0D-1的表达(参照图8)。
[0037]通过这样的结果，本发明人通过实验来论证了如下的事实:本发明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物具有抗氧化效果及皮肤美白效果，并且这样的效果比单独根据白茯苓、榆白皮及甘草的提取物而获得的效果更加优异。
[0038]因此，本发明能够提供作为有效成分而包含白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物的皮肤美白用化妆料组合物。
[0039]本发明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物是使用本领域公知的提取及分离方法，从天然物提取及分离获得而使用，本发明中所定义的“提取物”是利用适当的溶剂而从白茯苓、榆白皮及甘草提取的，例如包括所有白茯苓、榆白皮及甘草的粗提取物、极性溶剂可溶提取物或非极性溶剂可溶提取物。
[0040]作为用于提取所述白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物的适当的溶液，只要是医学上允许的有机溶剂，则可使用任何溶剂，可使用水或有机溶剂，但不限于此，例如可将下述的各种溶剂单独或混合而使用:纯净水、包括甲醇(methanol )、乙醇(ethanol)、丙醇(propanol)、异丙醇(isopropanol)、丁醇(butanol)等的碳数为 I至 4 的醇、丙酮(acetone)、乙醚(ether)、苯(benzene)、三氯甲烧(chloroform)、乙酸乙酯(ethylacetate)、二氯甲烧(methylene chloride)、己烧(hexane)及环己烧(cyclohexane)等。优选使用乙醇(酒精)。
[0041]作为提取方法，可从下述方法中选择一个来使用:热水提取法、冷浸提取法、环流冷却提取法、溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、超声波提取法、喷涌法、压榨法等。另外，关于目标提取物，可追加执行通常的划分工艺，也可以利用通常的精制方法来精心制作。关于本发明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物的制造方法不进行限制，可利用公知的任何方法。[0042]例如，本发明的组合物中所包含的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物可通过如下方法制造:将通过所述的热水提取法或溶剂提取法来提取的一次提取物，通过减压蒸馏及冻结干燥或喷雾干燥等这样的追加过程而制造成粉末状态。另外，对于上述一次提取物，利用硅胶柱层析法、薄层层析法、高性能液体层析法等各种层析法，获得追加性地精心制造的划分。
[0043]因此，在本发明中，白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物包括在提取、划分或精制的各个阶段获得的所有提取液、划分及精制物、它们的稀释液、浓缩液或干燥物。
[0044]另外，在本发明的组合物被制造成化妆品组合物的情况下，本发明的组合物不仅包括上述的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物，还包括在化妆料组合物中通常所利用的成分，例如包括抗氧化剂、稳定剂、溶解剂、维生素、颜料及香料这样的通常的助剂和载体。
[0045]另外，本发明的组合物除了上述的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物之外，在与白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物反应而不损伤皮肤保护效果的限度内，可混合使用以往一直使用的有机防晒霜。
[0046]作为有机防晒霜，可使用从以下的组中选择的一种以上:甘油基己酯(GlycerylPABA)λ 甲酌.曲唑三娃氧焼(Drometrizole Trisiloxane)、甲酌.曲唑(Drometrizole)、二没食子酰三油酸酯(Digalloyl Trioleate)、苯基二苯并咪唑四磺酸二钠(DisodiumPhenyl Dibenzimidazole Tetrasulfonate)、二乙基己基丁酸胺基三嗪酮(DiethylhexylButamido Triazone)、二乙氨基轻苯甲酉先基己基苯甲酸酯(Diethylamino HydroxybenzoylHexyl Benzoate)、DEA-甲氧基肉桂酸盐(DEA-Methoxycinnamate)、2_ 羟基-1，4_ 萘醌(Lowsone)和二羟基丙酮(Dihydroxyacetone)的混合物、亚甲基双-苯并三唑基四甲基丁基酌二物理防剂晒(Methylene Bis-Benzotriazolyl Tetramethylbutylphenol)、4-甲基亚苄基樟脑(4-MethyIbenzyIidene Camphor)、邻氨基苯甲酸甲酯(MenthylAnthranilate)、二苯甲丽 _3 (轻苯甲丽)(Benzophenone-3 (Oxybenzone))、二苯甲丽 _4(Benzophenone-4)、二苯甲丽 _8 (二轻苯丽)(Benzophenone_8 (Dioxybenzone))、丁基甲氧基二苯酉先化甲焼(Butyl Methoxydibenzoylmethane)、双-乙基己氧苯酌二甲氧苯基三嗪(Bis-ethylhexy1xyphenoI methoxyphenyl triazine)、西诺沙酯(Cinoxate)、乙基二轻丙基 PABA (Ethyl Dihydroxypropyl PABA)、氰双苯丙烯酸辛酯(octocrylene)、乙基己基二甲基PABA (Ethylhexyl Dimethyl PABA)、乙基己基甲氧基肉桂酸酯(Ethylhexilemethoxycinnamate)、水杨酸乙基己酯(Ethylhexyl Salicylate)、乙基己基三嗪酮(Ethylhexyl Triazone)、对甲氧基肉桂酸异戊酯(Isoamyl p-methoxycinnamate)、聚娃氧焼-15 (Dimethicodiethylbenzal malonate)、麦素宁滤光环(TerephthalylideneDicamphor Sulfonic Acid)及其盐类、TEA-水杨酸盐(TEA-Salicylate)、氨基苯甲酸(对氨基苯甲酸)(aminobenzoic acid (PABA))。
[0047]另外，本发明的化妆料组合物可以制造成本领域中通常制造的任何剂型，例如可制造为如下剂型:溶液、悬浮液、乳液、糊状物、凝胶、膏状物、护肤液、粉、香皂、含有表面活性剂的洗面奶、油、粉末粉底、乳液粉底、蜡型粉底及喷雾等，但不限于此。更具体地，本发明的化妆料组合物可制造为如下剂型:柔软化妆水、营养化妆水、营养霜、按摩霜、精华素、目艮霜、洁面霜、洁面胶、卸妆水、面膜、喷雾或粉。
[0048]在本发明的剂型为糊状物、膏状物或凝胶的情况下，作为载体成分，可利用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、胶黄蓍、纤维衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土、硅石、滑石或氧化锌
坐寸O
[0049]在本发明的剂型为溶液或乳液的情况下，作为载体成分而利用溶剂、溶解剂、乳化剂，例如有水、乙醇、异丙醇、碳酸亚乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯酸苄酯、丙二醇、1，3 —丁基乙二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇、或山梨聚糖的脂肪酸酯。
[0050]在本发明的剂型为悬浮液的情况下，作为载体成分可利用如下成分:水、乙醇或丙二醇这样的液态的稀释剂、乙氧基异硬脂醇、聚氧化乙烯酯、及聚氧化乙烯酯这样的悬浮液、微小决定性纤维、氢氧化铝、膨润土、琼胶或胶黄蓍等。 [0051]在本发明的剂型为粉或喷雾的情况下，作为载体成分可利用乳糖、滑石、硅石、氢氧化铝、钙硅酸盐或聚酰胺粉，特别是在剂型为喷雾的情况下，可追加性地包含氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚这样的推进剂。
[0052]在本发明的剂型为含有表面活性剂的洗面奶的情况下，作为载体成分而可利用如下:脂肪醇硫酸盐、脂肪醇乙醚硫酸盐、磺基琥珀酸磷酸、羟乙基磺酸盐、咪唑烷衍生物、氨基乙磺酸甲酯、肌氨酸盐、脂肪酸胺乙醚硫酸盐、脂肪酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛酯衍生物或聚氧乙烯甘油醚脂肪酸脂等。
[0053]另外，本发明提供化妆方法，其特征在于将作为有效成分而包含白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物的化妆料组合物适用于人的皮肤而获得美白效果。
[0054]本发明的化妆方法是指所有利用本发明的化妆料组合物的所有化妆方法。即，利用化妆料组合物的在本领域公知的所有方法均包括在本发明的化妆方法中。
[0055]本发明的化妆料组合物可单独或重复使用，或者与本发明之外的其他化妆料组合物重复而使用。另外，本发明的化妆料组合物可根据通常的使用方法来使用，并且根据使用者的皮肤状态或爱好来采取不同使用次数。
[0056]在本发明的化妆料组合物为香皂、含有表面活性剂的洗面奶剂型或不含有表面活性剂的洗面奶剂型的情况下，在涂敷于皮肤之后，可擦掉或取下或者用水来清洗。作为具体例，所述香皂为液体香皂、粉末香皂、固体香皂及油香皂，所述含有表面活性剂的洗面奶剂型为洁面胶、卸妆水、洗面巾、洁面面膜，所述不含有表面活性剂的洗面奶剂型为洁面霜、洁面液、卸妆水及洁面凝胶，但不限于此。
[0057]下面，对本发明的实施例进行更加详细的说明。这些实施例只是为了更具体地说明本发明，本领域技术人员应该明白本发明的范围不限于这些实施例。
[0058]<实施例1>
[0059]材料及试料的制造
[0060]〈1-1>材料的准备
[0061]从Gibco BRL, Life Technologies(Paisley, Scotland)购美了用于进行细胞培养的 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)、膜蛋白酶 EDTA、青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)/ 两性霉素(amphotericin)(分别为 10,000U/ml, 10,000 μ g/ml 及2, 500 μ g/ml )、胎牛血清(FBS)试剂。另外，从 ATCC (American Type CultureCoIIection,USA)购买了 B16F1 细胞株(cell line),并从 Sigma Chemical C0.(St.Louis, MO, USA)购买了 MTT试剂、白明胶(gelatin)、琼脂糖(agarose)和其他试剂。
[0062]〈1-2>试料的制造[0063]通过如下的方法来提取了白茯苓酒精提取物(在本发明中，将白茯苓酒精提取物命名为“PCEE ”)、油溶性甘草提取物(在本发明中，将油溶性甘草提取物命名为“GUEE ”)、榆白皮酒精提取物(在本发明中，将榆白皮酒精提取物命名为“UMEE ”)以及它们三个的混合物(在本发明中，将白茯苓酒精提取物、油溶性甘草提取物、榆白皮酒精提取物的混合物命名为“P⑶E”)。
[0064]首先，将白茯苓、榆白皮用流动的水清洗干净之后，使其完全自然干燥。将清洗、干燥的所述白茯苓、榆白皮在酒精中提取3天，将所述提取物过滤之后，将过滤的滤液减压并浓缩而获得了粉末形态的白茯苓、榆白皮酒精提取物。在甘草提取物的情况下，用无水乙醇来提取甘草根，并将所获得的提取物再用乙酸乙酯(ethyl acetate)提取之后，把将提取液减压、浓缩并干燥的油溶性提取物制造成粉末形态，将制造的粉末形态的试料稀释为实验浓度而用于本发明中。
[0065]<实施例2>
[0066]MTT assay 分析
[0067]本发明人为了分析通过实施例1的方法来制造的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物的MTT assay,根据Hansen [10]的方法，利用MTT(溴化3_ (4，5_ 二甲基_2基)_2，5- 二苯基四唑(3- (4, 5-dimethyl-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazoIium bromide))而测定了对于B16F1 细胞的 PCEE、GUEE, UMEE, PGUE 的细胞毒性。
[0068]在测定对于B16F1细胞的各个试料的细胞毒性的结果，如图1所示，可知PCEE、GUEE, UMEE、PGUE在3.12 μ g/ml以下的浓度下，与对照组相比，没有任何的毒性效果(参照图1)。
[0069]<实施例3>
[0070]DPPH自由基分析
[0071]本发明人为了测定通过实施例1的方法来制造的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物的DPPH自由基消除能力，将Brand-WiIIiams实验方法变形而测定了 PCEE、GUEE、UMEE、PGUE 对于 1，1-二苯基-2-苦餅基(1，l-diphenyl-2-picrylhydrazyl) (DPPH)自由基的消除能力。将各个试料处理为实验浓度之后，混合10秒钟，并使它们在室温下反应20分钟之后，在525nm下测定了吸光度。另外，DPPH自由基含量是将试料添加组和对照组的吸光度比换算为％值而表示的。
[0072]通常，DPPH自由基消除法作为以将抗氧化物质所致的DPPH自由基的脱色程度为指标而预测氧化抑制程度的尺度来使用，在此显示出分别单独使用的组和处理了混合溶液的组对于DPPH自由基的消除能力与浓度成正比地增加，特别是它们的混合物即PGUE在15.6 μ g/ml的浓度以上中显示出78%的DPPH自由基消除能力。这表示:与作为阳性对照组的100 μ g/ml的维生素C相比，PGUE的消除能力提高了 10% (参照图2)。
[0073]<实施例4>
[0074]还原力分析
[0075]本发明人为了分析通过实施例1的方法来制造的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物的还原力，根据Oyaizu的方法来进行了测定。
[0076]在PCEE、GUEE, U MEE, PGUE中依次分别加入Iml的ρΗ6.6的200mM磷酸缓冲溶液及I %的赤血盐(potassium ferricyanide)而搅拌之后,在50°C的水浴中反应了 20分钟。在其中加入Iml的10% TCA溶液而在13，500 Xg中进行15分钟的离心分离而获得的上等液Iml中,将蒸懼水及氯化铁(ferric chloride)分别加入Iml而混合之后,在700nm下测定了吸光度。作为阳性对照组而使用了 0.01%的维生素C，将试料添加组和对照组的吸光度比换算为％值而示出了试料的还原力。
[0077]其结果，在本发明的白茯苓、甘草及榆白皮的酒精提取物的混合物(PGUE)中未显示出还原力，但是GUEE、UMEE、PGUE的还原力与浓度成正比地增加。GUEE在62.5 μ g/ml浓度下显示出了 150%的还原力，UMEE和PGUE在62.5 μ g/ml浓度下，UMEE显示出350%的还原力，PGUE显示出270%的还原力，可知比作为阳性对照组而使用的10 μ g/ml的维生素C还原力优异(参照图3)。
[0078]另外,本发明人利用从B16F1细胞分离的genomic DNA,对于由fenton反应发生的轻自由基(hydroxyl radical)所致的DNA的氧化损伤,调查了 PGUE的抗氧化效果,其结果对照组的genomic DNA被分解为如图4所示那样。但是，在添加了 PGUE的组中，对于DNA的氧化损伤的保护效果根据浓度而增加，在62.5 μ g/ml中显示出130%的较高的保护效果(参照图4)。
[0079]<实施例5>
[0080]对于脂质过氧化的抗氧化活性分析
[0081 ] 为了了解在本发明的白茯苓、甘草及榆白皮的酒精提取物的混合物(PGUE )中是否存在对于脂质过氧化的抗氧化活性，使PCEE、GUEE, UMEE, PGUE与亚麻酸乳液(Iinolenicacid emulsion)混合30分钟而形成0.0625,0.125,0.25,0.5、I %的浓度之后，使混合了0.8mM H2O2及0.8mM FeSO4的溶液反应5小时，然后添加0.4% TBA，在95°C下反应2小时，并在室温下反应了 10分钟。然后，添加500 μ I的15:1比例的正丁醇:吡啶溶液，在1，OOOXg下进行10分钟的离心分离，对于由此获得的上清液在532nm下测定了吸光度，脂质过氧化程度是将试料添加前后的吸光度比换算为％值而显示的。
[0082]其结果，在对各个试料进行处理后发现，PCEE, GUEE, UMEE未显示出有效的抑制效果，但是作为白茯苓酒精提取物、油溶性甘草提取物及榆白皮酒精提取物的混合物的本发明的PGUE在7.8 μ g/ml以上的浓度下，抑制了 17 %的脂质过氧化，在15.6 μ g/ml的浓度下，与作为阳性对照组而使用的1000 μ g/ml的维生素E类似地抑制了 20%程度的脂质过氧化(参照图5)。
[0083]<实施例6>
[0084]酪氨酸酶的活性分析
[0085]酪氨酸酶作为在人体内的黑色素生合成路径中最重要的初期速度决定阶段中涉及到的酶，很多美白成分具有抑制该酶的作用机制。因此，本发明人为了了解在本发明的白茯苓、甘草及榆白皮的酒精提取物的混合物(PGUE)中是否存在美白活性，测定了酪氨酸酶的活性。
[0086]首先，在试管中依次放入了 0.1M磷酸盐缓冲液(ρΗ6.5)220 μ I和试料液20 μ I以及蘑菇酪氨酸酶(1500U/mL)液20 μ I。在该溶液中放入1.5mM的塔罗素液40 μ I，并在37°C下反应10~15分钟之后,利用ELISA reader而在490nm下测定了吸光度。[0087]其结果，如图6所示，白茯苓酒精提取物(PCEE)和榆白皮酒精提取物(UMEE)未显示出酪氨酸酶抑制效果，但是在本发明的白茯苓、甘草及榆白皮的酒精提取物的混合物(PGUE)中，酪氨酸酶的抑制效果根据处理浓度而增加。另外，本发明的混合物(PGUE)在31.2 μ g/ml浓度下,与作为阳性对照组而使用的2000 μ g/ml的熊果苷(arbutin)的效能相t匕，显示出更加优异的酪氨酸酶活性抑制效果(参照图6 )。
[0088]因此，可知本发明的白茯苓、甘草及榆白皮的酒精提取物的混合物(PGUE)与单独处理白茯苓、甘草及榆白皮提取物的组相比，酪氨酸酶活性抑制效果明显优异。
[0089]<实施例7>
[0090]黑色素生成分析 [0091]为了了解在本发明的白茯苓、甘草及榆白皮的酒精提取物的混合物(PGUE)中是否具有美白活性而测定了黑色素生成程度。
[0092]首先，在6-孔板中以3 X 105ce 11 s/we 11分开种植了细胞，并处理了试料，在I小时后用L-dopa刺激了黑色素的生成，然后进行了 48小时的细胞培养。收集细胞而在1，200rpm下进行5分钟的离心处理而沉淀之后，通过Iml均化剂(均化缓冲液，50mM磷酸钠，pH6.5，
I% Triton X-100,2mM PMSF)进行了溶解。在此，在所获得的颗粒中添加200 μ I的IN NaOH(10% DMSO)而混合(vortex)后,在405nm下测定了吸光度，并利用由黑色素标准(Sigma,USA)获得的标准检验线而算出了在各个孔中所生成的黑色素量。关于黑色素，比较了在单位细胞(IO4Cells)中的黑色素生成量。
[0093]另外，本发明人为了调查通过多巴(DOPA)刺激的黑色素生成调节效果，使用B16F1细胞而测定了黑色素含量，其结果白茯苓酒精提取物(PCEE)在3.12 μ g/ml浓度下，与对照组相比，抑制了 9%的黑色素的生成，在6.25 μ g/ml的浓度下，与作为阳性对照组而使用的熊果苷(arbutin)抑制效果类似。
[0094]在本发明的白茯苓、甘草及榆白皮的酒精提取物的混合物(PGUE)的情况下，在
6.25 μ g/ml浓度下，与对照组相比，黑色素生成抑制效果更有意识性(P < 0.01)，在利用INNaOH而测定细胞内的黑色素的结果，如图7所示地，除了示出受到色素的影响而增加的形态的甘草提取物(GUEE)组之外，白茯苓酒精提取物(PCEE)在0.39 μ g/ml以上浓度下，抑制了 25%以上的黑色素合成。
[0095]在本发明中作为阳性对照组而使用的2000 μ g/ml的熊果苷抑制了 25%程度的黑色素的合成。榆白皮酒精提取物(UMEE )也显示出与白茯苓酒精提取物(PCEE )类似的效果，在本发明的白茯苓、甘草及榆白皮的酒精提取物的混合物(PGUE)的情况下，在0.78 μ g/ml以上浓度下，抑制了 23%的黑色素的合成。
[0096]<实施例8>
[0097]蛋白质印迹分析
[0098]为了确认在本发明的白茯苓、甘草及榆白皮的酒精提取物的混合物(PGUE)中是否存在作为在黑色素形成中重要的酶的酪氨酸酶和在黑色素生成信号传达机制中重要的TRP-1 (与酪氨酸酶有关的蛋白-1 (tyrosinase related protein-1))和TRP_2(与酪氨酸酶有关的蛋白_2 (tyrosinase related protein-2))及在抗氧化酶中作为最重要的SOD(超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase))的S0D-1的蛋白质表达,进行了蛋白质印迹分析。
[0099]首先，在5% CO2及在37°C中维持了 95 %以上的湿度的培养器中，在包括10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺及100 μ g/ml青霉素一链霉素的DMEM培养基中培养了 B16F1细胞。[0100]在B16F1 细胞中添加喷涌缓冲溶液(50mM TrisHCl, pH7.5,0.4% Nonidet P-40，120mM NaCl, 1.5mM MgC12, 2mM 苯甲基横酸基氟(phenylmethylsulfonyl fluoride),80μ g/ml亮抑蛋白肽酶(leupeptin),3mM NaF和ImM DTT),在4°C下进行了 30分种的处理。在10% TrisHCl凝胶中对10 μ g的细胞喷涌液进行电泳之后，电气地将蛋白质转移为硝酸纤维膜(nitrocellulose membrane)。
[0101]然后，将10 %脱脂油预先处理到硝酸纤维膜(nitrocellulose membrane),处理对目标蛋白质的一次抗体(抗-酪氨酸酶(ant1-tyrosinase),抗-TRP-1,抗-TRP-2,抗-S0D-1,抗-β -肌动蛋白(ant1-beta-actin))之后，处理二次抗体,然后使用化学突光剂 chemiluminescent ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech)而检测了目标蛋白质。利用LAS3000图像分析仪(Fujifilm Life Science,Tokyo, Japan)而观察了蛋白质印迹的区域。
[0102]其结果，显示出白茯苓酒精提取物(PCEE)减少了 S0D-1的蛋白质的表达，对于与黑色素生成相关的其他蛋白质的表达并未产生影响。这样的结果表示由白茯苓的氧化力减少作为抗氧化酶的S0D-1的蛋白质表达。
[0103]但是，可知本发明的白茯苓、甘草及榆白皮的酒精提取物的混合物(PGUE)与对照组相比，在3.12 μ g/ml浓度下，对TRP-2和酪氨酸酶蛋白质的表达未产生影响，但减少了TRP-1及S0D-1的表达(参照图8)。
[0104]〈实施例9>
[0105]统计处理
[0106]通过将各个实验反复进行3次以上而得到其结果，对于各自的试料浓度显示为平均土标准偏差。关于对各个试料浓度组的有意差检验，与对照组比较而进行Student’ sttest之后,将p < 0.05值统计为有意义的结果。
[0107]以上，对于本发明，以其优选实施例为中心进行了说明。本领域技术人员应该理解在不脱离本发明的本质特性的范围内能够以变形的形态来实现。因此，所公开的实施例并不是限定本发明，而是对本发明进行说明。本发明的范围并不体现在上述说明中，而是记载于权利要求书中，在与此相同的范围内的所有区别点均包括在本发明中。
【权利要求】
1.一种皮肤美白用化妆料组合物，其特征在于，该皮肤美白用化妆料组合物包含白茯苓、榆白皮及甘草混合提取物，作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的皮肤美白用化妆料组合物，其特征在于， 所述白茯苓提取物在化妆料组合物的总重量份中占0.0Ol重量％~2重量％，榆白皮提取物在化妆料组合物的总重量份中占0.001重量％~2重量％，甘草提取物在化妆料组合物的总重量份中占0.001重量％~5重量％。
3.根据权利要求1所述的皮肤美白用化妆料组合物，其特征在于， 所述白茯苓、榆白皮及甘草混合提取物使用从以下的组中选择出的溶剂而进行提取:水、碳数为I~4个的无水或含水低级醇、丙酮、乙酸乙酯、醋酸异丁酯以及1，3-丁二醇。
4.根据权利要求1所述的皮肤美白用化妆料组合物，其特征在于， 所述化妆料组合物具有酪氨酸酶活性阻碍和/或者黑色素生合成阻碍效果。
5.根据权利要求1所述的皮肤美白用化妆料组合物，其特征在于， 所述化妆料组合物形成为从以下的组中选择的剂型:溶液、悬浮液、乳液、糊状物、凝胶、膏状物、护肤液、粉、香皂、含有表面活性剂的洗面奶、油、粉末状粉底、乳液状粉底、蜡型粉底及喷雾。
【文档编号】A61Q1/12GK103599020SQ201310567094
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月14日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】金文武, 吴荣姬, 南香, 权恩廷, 朴慧贞, 李守卿, 洪秀暻, 金相珉 申请人:芽美化妆品有限公司