家族44木葡聚糖酶变体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及家族44木葡聚糖酶变体，具体地涉及亲本木葡聚糖酶的变体。本发明还涉及编码所述变体木葡聚糖酶的多核苷酸，和包含所述多核苷酸的构建体、载体和宿主细胞。
【专利说明】家族44木葡聚糖酶变体
[0001]本申请是基于申请日为2009年6月4日，申请号为“200980121086.0”(国际申请号为7(:17^?2009/056875”)、名称为“家族44木葡聚糖酶变体”的发明专利申请的分案申请。
[0002]涉及序列表
[0003]本申请含有计算机可读形式的序列表，所述计算机可读形式通过提述并入本文。发明领域
[0004]本发明涉及属于家族44糖苷水解酶的木葡聚糖酶变体，编码所述变体的多核苷酸和产生所述变体的方法。
[0005]发明背景
[0006]木葡聚糖是在植物的初级(生长的)细胞壁中主要的结构多糖。在结构上，木葡聚糖由纤维素-样β -1，4-键的葡萄糖骨架组成，所述葡萄糖骨架经常以多种侧链取代。据信木葡聚糖在植物初级细胞壁中通过交联纤维素微纤维形成纤维素-木葡聚糖网络(network)而起作用。
[0007]木葡聚糖酶能够催化木葡聚糖溶解(solubilization)为木葡聚糖寡糖(xyloglucan oligosaccharide)。一些木葡聚糖酶仅显示木葡聚糖酶活性,而其他显示木葡聚糖酶活性和纤维素酶活 性。木葡聚糖酶可归类为EC3.2.1.4或EC3.2.1.151。具有木葡聚糖酶活性的酶，例如，在 Vincken 等(1997) Carbohydrate Research298 (4): 299-310 中描述，其中表征了来自绿色木霉(Trichoderma viride)(类似于里氏木霉T.reesei)的三种不同的内切葡聚糖酶Endol、EndoV和EndoVI。Endol、EndoV和EndoVI分别属于糖苷水解酶的家族 5、7 和 12，参见 Henrissat, B.(1991) Biochem.J.280:309-316 以及 Henrissat, B.和 Bairoch, A.(1993) Biochem.J.293:781-788。W094/14953 公开了从真菌棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)克隆的家族12木葡聚糖酶(EG II)。W099/02663公开了分别从地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)和 Bacillus agaradhaerens 克隆的家族 12 和家族5木葡聚糖酶。WOO1/062903公开了家族44木葡聚糖酶。
[0008]具体而言，W099/02663和WOO1/062903表明木葡聚糖酶可用于洗涤剂。
[0009]本发明的一个目的是提供属于糖苷水解酶的家族44的木葡聚糖酶变体，与其亲本酶相比具有改善的特性。
【发明内容】
[0010]本发明涉及亲本木葡聚糖酶分离的变体，在选自下组的位置编号的一个或多个(几个)位置处包含改变:68、123、156、118、200、129、137、193、92、83、149、34、340、332、
9、76、331、310、324、498、395、366、1、374、7、140、8、14、21、211、37、45、13、78、87、436、101、104、111、306、117、119、414、139、268、142、159、164、102、168、176、180、482、183、202、206、217、4、222、19、224、228、232、2、240、244、5、247、249、328、252、259、406、267、269、275、179、166、278、281、288、298、301、18、302、165、80、303、316、169、322、120、146、342、348、147、353、380、468、382、383、38、384、389、391、10、392、396、177、397、399、409、237、413、253、415、418、40、443、445、148、449、225、450、454、3、455、456、299、461、470、204、476、488、347和507，所述位置对应于氨基酸序列SEQ ID NO:3中的位置，且其中所述改变独立地为
[0011]i)在占据所述位置的氨基酸下游插入氨基酸，
[0012]ii)缺失占据所述位置的氨基酸，或
[0013]iii)用不同的氨基酸取代占据所述位置的氨基酸；和
[0014]所述亲本木葡聚糖酶是家族44木葡聚糖酶；且所述变体具有木葡聚糖酶活性。
[0015]本发明还涉及编码所述变体木葡聚糖酶的分离的多核苷酸或具有木葡聚糖酶活性的多肽,包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生亲本木葡聚糖酶变体或具有木葡聚糖酶活性的多肽的方法。
[0016]具体地，本发明涉及如下各项:
[0017]1.一种亲本木葡聚糖酶的分离的变体，所述变体在所述亲本木葡聚糖酶一个或多个选自下组位置编号的位置包含改变:68、123、156、118、200、129、137、193、92、83、149、34、340、332、9、76、331、310、324、498、395、366、1、374、7、140、8、14、21、211、37、45、13、78、87、436、101、104、111、306、117、119、414、139、268、142、159、164、102、168、176、180、482、183、202、206、217、4、222、19、224、228、232、2、240、244、5、247、249、328、252、259、406、267、269、275、179、166、278、281、288、298、301、18、302、165、80、303、316、169、322、120、146、342、348、147、353、380、468、382、383、38、384、389、391、10、392、396、177、397、399、409、237、413、253、415、4 18、40、443、445、148、449、225、450、454、3、455、456、299、461、470、204、476、488、347和507，所述位置对应于氨基酸序列SEQ ID NO: 3中的位置，且其中
[0018]a)所述改变为
[0019]i)在占据所述位置的氨基酸下游插入氨基酸，和/或
[0020]ii)缺失占据所述位置的氨基酸，和/或
[0021]iii)用不同的氨基酸取代占据所述位置的氨基酸；
[0022]b)所述亲本木葡聚糖酶是家族44木葡聚糖酶；和
[0023]c)所述变体具有木葡聚糖酶活性。
[0024]2.项I的变体，其中所述亲本木葡聚糖酶选自下组:SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 7，或所述亲本木葡聚糖酶选自与SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少75%同一性的木葡聚糖酶。
[0025]3.项I或2的变体，其中所述变体包含一种或多种下述的改变组合:
[0026]Vl*+V2*+H3* ；
[0027]VlQ+*laE+*lbV ；
[0028]H3A ；
[0029]H3A+H436A ；
[0030]K8A, Q, S ；
[0031]T9D ；
[0032]T9D+L34F+A83E+Q149E+H193T+S332P+R340T ；
[0033]I10V+D33E+M40L+A41T+Q67M+Y73F+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+I222V+V228I+D249N+S269N+V272A+E333A+I337L+M356L+T374A+S416A+D444Y+A469E+K470T+I473G+T517A+S522* ；
[0034]I10V+F17S+D33E+M40L+A41T+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+Q137E+V219A+ D249N+V272A+I337L+M356L+V397A+S416A+T421I+S424N+N441D+D444Y+V450I+K470T+I473S+V477I ;
[0035]I10V+F17S+D33E+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+H164N+N168K+T172A+V219A+I222V+V228I+D249N+S269N+V272A+E333A+I337L+M356L+N415S+T421I+S424H+N441D+D444Y+S522P+P523V+V524E ；
[0036]I10V+F17S+D33E+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+I222V+V228I+D249N+V272A+I337L+M356L+T374A+V397A+S416A+T421I+S424N+N441D+D444Y+V450I+A469E+K470T+I473G+T517A+S522P+P523V+V524E ；
[0037]I10V+F17S+D33E+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+N168K+T172A+I222V+V228I+D249N+V272A+E333A+I337L+M356L+V397A+S416A+T421I+S424H+N441D+D444Y+A469E+K470T+I473S+V477I+E489A+A490V+T517A+S522* ；
[0038]I10V+F17S+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+I222V+V228I+D249N+S269N+V272A+T320A+I337L+M356L+T374A+V397A+N415S+T421I+S424H+N441D+D444Y+A469E+K470T+I473S+V477I+T517A+S522P+P523V+V524E ；
[0039]I10V+F17S+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T104A+Q137E+N153K+R156Q+V219A+I222V+V228I+D249N+S269N+V272A+E333A+I337L+M356L+V397A+N415S+D420G+T421I+S424H+N441D+D444Y+V450I+A469E+K470T+I473G+T517A+S522* ； [0040]I10V+F17S+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+T104A+Q137E+R156Q+V159A+H164N+N168K+T172A+I222V+V228I+D249N+V272A ；
[0041]I10V+F17S+Y53H+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+T172V+A177T+I222V+V228I+D249N+S269N+I337L+M356L+V397A+S416A+T421I+S424H+N441D+D444Y+A469E+K470T+I473G+T517A+S522* ；
[0042]K13A+K129A ；
[0043]KI3A+Q68H+T92V+KII8A+QI37E+R156Y+G200P ；
[0044]K13A, R ；
[0045]K18R ；
[0046]R20A ；
[0047]K21Q+K129A ；
[0048]K21Q, R, T ；
[0049]Q32H+M40L+R49G+D65E+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+T104A+Q137E+H164N+K202E+I222V+V228I+D249N+M356L+T374A ；
[0050]D33V+Q68H+N168H+V450I ；
[0051]L34F, Ι,Μ, V ；
[0052]L34I+K129A ；
[0053]D37G, N+K129A+R156Y ；
[0054]Ε38Ι,V ；
[0055]M40L+A41T+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+Q137E+N153K+H164N+D249N+V272A+I337L+M356L+V397A+N415S+T421I+S424N+N441D+V450I+E489A+A490V+T517A+S522* ；
[0056]M40V ；
[0057]L45I ；
[0058]Q68H, Μ, N ；
[0059]Q68H+G200P+N331F ；
[0060]Q68H+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；
[0061]Q68H+K118A+R156V+G200P+N331F ；
[0062]Q68H+K118A+R156Y+H193T+D366H ；
[0063]Q68H+K118R+R156F, Y ；
[0064]Q68H+K118R+R156Y+G200P ；
[0065]Q68H+K118S+R156F+G200P+G274D+N331F ；
[0066]Q68H+K129A, T+R156K+G200P+N331F ；
[0067]Q68H+R156F, V, Y+G200P+N331F ；
[0068]Q68H+R156Y ；
[0069]Q68H+R156Y+H193T ；
[0070]Q68H+R156Y+H193T+D366H ；
[0071]Q68H+R156Y+H193T+G200P+M310V ；
[0072]Q68H+S76W+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ；
[0073]Q68H+T92A, D, I, S，V, Y+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；
[0074]Q68H+T92N+D97N+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；
[0075]Q68H+T92S+K118A+K129A+R156Y+G200P+G274D+N331F ；
[0076]Q68H+T92V+G200P+M310V ；
[0077]Q68H+T92V+G200P+M310V+N33IF ；
[0078]Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+A224P+N331F ；
[0079]Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ；
[0080]Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T ；
[0081]Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+D366H ；
[0082]Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+G200P+M310V+E446K ；
[0083]Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+N331H, K, Q ；
[0084]Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T ；
[0085]Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+D366H ；
[0086]Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+G200P+M310V ；
[0087]Q68H+T92V+K118A+Q137E+N140F+R156Y+G200P+K470T ；
[0088]Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+D324N ；
[0089]Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+K470T ；
[0090]Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+M310L ；
[0091]Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ；
[0092]Q68H+T92V+K118Α, R+R156Y, F ；
[0093]Q68H+T92V+K118A+S123P, T+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ；[0094]Q68H+T92V+K118R+R156Y+H193T+D366H ；
[0095]Q68H+T92V+R156F+G200P+M310V+S484C ；
[0096]Q68H+T92V+R156F, V, Y+G200P+M310V ；
[0097]Q68H+T92V+R156F, V, Y+G200P+M310V+N331F ；
[0098]Q68H+T92V+R156F, Y+H193T ；
[0099]Q68H+T92V+R156F, Y+H193T+D366H ；
[0100]Q68H+T92V+R156F, Y+H193T+G200P+M310V ；
[0101]Q68H+T92V+R156Y ；
[0102]S76E, I, K, M, R, Τ, V, W ；
[0103]S76W+G200P ；
[0104]S76W+G200P+A224P ；
[0105]G78A+K118A++K129A+R156Y ；
[0106]G78A+K118A+K129A+R156Y ； [0107]G78A+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；
[0108]G78A+K118A+K129A+R156Y+K169A ；
[0109]G78A, N, S ；
[0110]G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y ；
[0111]G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；
[0112]G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y+K169A ；
[0113]L80V ；
[0114]A83D, Ε, H, I, L, N, R, S, Τ, Y ；
[0115]K87Q ；
[0116]K87V+K129A+K169A ；
[0117]Τ92Ι, V ；
[0118]T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ；
[0119]T92V+K118A+K129A+R156Y ；
[0120]T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；
[0121]T92V+K118A+K129A+R156Y+H164N+G200P+N331F ；
[0122]T92V+K129A+R156Y ；
[0123]Κ101Α+Κ129Α ；
[0124]KlOlR ；
[0125]K101R+L102I ；
[0126]T104A+P111Q+A117S+K129A+R156Y ；
[0127]PlllQ ；
[0128]Κ118Α+Κ129Α ；
[0129]K118Α+Κ129A+F146L+R156Y+G200P+N33IF ；
[0130]K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ；
[0131]K118A+K129A+R156Y ；
[0132]K118A+K129A+R156Y+A224P ；[0133]K118A+K129A+R156Y+G200P ；
[0134]K118A+K129A+R156Y+G200P+M310V+N33IF ；
[0135]K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；
[0136]K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F+N399I ；
[0137]K118A+K129A+R156Y+K169A+G200P+N33IF ；
[0138]K118A+K129A+R156Y+K470T ；
[0139]K118A, R ；
[0140]K118A+R156Y ；
[0141]K118A+R156Y+G200P ；
[0142]D119L ；
[0143]G120A ；
[0144]S123P, T ；
[0145]S123T+K129A+R156Y ；
[0146]K129A, F, I, K, R, S, T ；
[0147]K129A+K169A ；
[0148]K129A+K176P ；
[0149]K129A+K275Q ；
[0150]K129A+K445S ；
[0151]K129A+K470T ；
[0152]K129A+Q137E+R156Y ；
[0153]K129A+Q137E+R156Y+G200P ；
[0154]K129A+Q137E+R156Y+K470T ；
[0155]K129A+Q137E+V139K+N140F+Q147S+R156Y ；
[0156]K129A+R156Y ；
[0157]K129A+R156Y+A177T+V179I+A183S ；
[0158]K129A+R156Y+A328G ；
[0159]K129A+R156Y+D247G ；
[0160]K129A+R156Y+D249G, N, S ；
[0161 ]K129A+R156Y+D303I, K, S, V ；
[0162]K129A+R156Y+D324N ；
[0163]K129A+R156Y+D366H+T374A ；
[0164]K129A+R156Y+D461N, Q, T ；
[0165]K129A+R156Y+E288Q ；
[0166]K129A+R156Y+G200P ；
[0167]K129A+R156Y+G200P+G204T+R211K ；
[0168]K129A+R156Y+H164N ；
[0169]K129A+R156Y+H436Y ；
[0170]K129A+R156Y+I10V+V14I+D19E ；
[0171]K129A+R156Y+I222V+A224P+V228I+V232A ；[0172]K129A+R156Y+K176P, S ；
[0173]K129A+R156Y+K275T ；
[0174]K129A+R156Y+K322I+K454Q ；
[0175]K129A+R156Y+K406N+N415G ；
[0176]K129A+R156Y+K454Q ；
[0177]K129A+R156Y+L380F+N383Y+D384G+N389T ；
[0178]K129A+R156Y+N298F+E299N+G301T ；
[0179]K129A+R156Y+N302K+D303L, S ；
[0180]K129A+R156Y+N331F ；
[0181]K129A+R156Y+P507A ；
[0182]K129A+R156Y+R267H ；
[0183]K129A+R156Y+R409L, T ；
[0184]K129A+R156Y+S443D+K445S+L4491+V4501+S455N+M456Y ； [0185]K129A+R156Y+T244D ；
[0186]K129A+R156Y+V159M+H164N+F165Y ；
[0187]K129A+R156Y+V259I+R267K+L268K+S269A ；
[0188]Q137D, E ；
[0189]N140F ；
[0190]K142A, Q, R ；
[0191]F146C+H164C ；
[0192]F146K, L ；
[0193]F146L+K322I ；
[0194]L148K+N168D ；
[0195]Q149E ；
[0196]R156A, D, E, F, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S，Τ, V, ff, Y ；
[0197]R156Y+N331F ；
[0198]V159M ；
[0199]Η164Α, N ；
[0200]L1661 ;
[0201]N168D ；
[0202]Κ169Α, Q, R ；
[0203]Κ176Ρ ；
[0204]Α177Ε, T ；
[0205]K180R ；
[0206]Η193Α, D, S, T ；
[0207]R197A, L ；
[0208]Η199Α ；
[0209]G200A, C，D, Ε, F，H, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S，Τ, V, W, Y ；
[0210]G200P+A224P ；[0211]K202N, Q, R ；
[0212]S214E ；
[0213]K217A ；
[0214]A221K ；
[0215]G225S ；
[0216]V232A ；
[0217]G237A, S, V ；
[0218]K240A, Q, R ；
[0219]K252A, Q, R ；
[0220]G253A ；
[0221]R267A ；
[0222]L268I ；
[0223]K275A, Q, R ；
[0224]L278I ；
[0225]F281L ；
[0226]M290R ；
[0227]R295A ；
[0228]K306A, R ；
[0229]K307Q ；
[0230]M310I,L, V ；
[0231]M310V+N399I ；
[0232]R314A ；
[0233]G316I ；
[0234]K322A, R ；
[0235]D324N ；
[0236]N331A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, Τ, V, ff, Y ；
[0237]S332M, P ；
[0238]S332P+V397I ；
[0239]R340A, N, T ；
[0240]K342A ；
[0241]V345I ；
[0242]K347A, Q, R ；
[0243]D348G ；
[0244]K353Q, R ；
[0245]D366H ；
[0246]M373Q ；
[0247]T374A ；
[0248]L380F ；
[0249]K382A ；[0250]N383Y ；
[0251]N389A, F, N, V ；
[0252]W391V ；
[0253]K392G, Q ；
[0254]D395G ；
[0255]G396P ；
[0256]V397S ；
[0257]N399I ；
[0258]K406N ；
[0259]G413A, S ；
[0260]K414A ；
[0261]N415S ；
[0262]T417 K ；
[0263]F418I ；
[0264]V431E ；
[0265]H436A ；
[0266]N441G+A442E+S443D ；
[0267]S443E, K, Q ；
[0268]K445A, R, S ；
[0269]K445C+K470C ；
[0270]H448A ；
[0271]K454R ；
[0272]S467R+G468S+A469T ；
[0273]G468S, Y ；
[0274]K470P, R, T ；
[0275]I473T ；
[0276]K476Q ；
[0277]K482A, Q, R ；
[0278]K488A, Q, R, T ；
[0279]A490R ；
[0280]G498A, D, S ；
[0281]R500A, T, V ；
[0282]H512A ；
[0283]T517A+G518D ;或
[0284]G518D。
[0285]4.项I或2的变体，在对应于68位、或123位、或156位、或118位、或200位、或129位、或137位、或193位、或92位、或76位、或331位的一个或多个位置包含改变，所述位置对应于氨基酸序列SEQ ID NO:3中的位置。
[0286]5.项I或2的变体，其中所述变体在68位包含取代，并在一个或多个其他位置包含一个或多个取代，所述其他位置选自下组的位置编号:123、156、118、200、129、137、193、92、83、149、34、340、332、9、76、331、310、324、498、395 和 366。
[0287]6.项I或2的变体，其中所述变体在位置156包含取代，并在一个或多个其他位置包含一个或多个取代，所述其他位置选自下组的位置编号:10、13、14、19、37、68、78、92、118、123、129、137、139、140、147、159、 164、165、169、176、177、179、183、200、204、211、222、224、244、247、249、259、267、268、269、275、288、299、301、302、303、310、324、328、331、366、380、383、384、389、406、409、415、436、443、445、449、450、454、455、456、461、470 和 507。
[0288]7.项6的变体，其中所述变体在129位和156位包含取代。
[0289]8.项1-7任一项所述的变体，其中所述变体包含选自下组的一个或多个取代:Q68H, N, L ；S123P, T ；R156Y, F，V, I, K, ff, L, M ；K118A, R ；G200P, E, S, D ；K129T, A, S ；Q137E ；H193T, S, D ；T92V, I, A, S ；A83E ；Q149E ；L34F, I, V ；R340T, N ；S332P ；T9D ；S76ff, V, I, K, R, T ；N331F, C ；M310I, V, L ；D324N ；G498A, D ；D395G 和 D366H。
[0290]9.项8的变体，其中所述变体包含选自下组的一个或多个取代:Q68H;S123P;R156Y, F ；K118A ；G200P, E ；K129T, A ；Q137E ；H193T ；T92V 和 N331F。
[0291]10.项1-4任一项所述的变体，其中所述变体包含一个或多个下述的取代组合:
[0292]Q68H ；
[0293]S123P ；
[0294]R156Y ；
[0295]Q68H+R156Y ；
[0296]K129A+R156Y ；
[0297]S123T+K129A+R156Y ；
[0298]K129A+R156Y+G200P ；
[0299]Q68H+K118R+R156F ；
[0300]Q68H+R156Y+H193T ；
[0301]Q68H+R156F+G200P+N331F ；
[0302]Q68H+T92V+K118A+R156Y ；
[0303]K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；
[0304]G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y ；
[0305]Q68H+K129T+R156K+G200P+N331F ；
[0306]K118A+K129A+R156Y+K169A+G200P+N33IF ；
[0307]T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；
[0308]G78A+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；
[0309]G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y+K169A ；
[0310]Q68H+T92V+Q137E+R156Y+G200P+N331F ；
[0311]Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+N331F ；
[0312]Q68H+T92V+R156Y+G200P+M310V+N33IF ；
[0313]Q68H+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；
[0314]Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F ；
[0315]Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ；[0316]Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+D366H ；
[0317]Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+D366H ；
[0318]Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ；
[0319]Q68H+T92V+K118A+S123P, T+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F ;或
[0320]Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+A224P+N331F。
[0321]11.项1-10任一项所述的变体，其中所述变体中改变的总数为二，优选三，甚至更优选四，甚至更优选五，甚至更优选六，甚至更优选七，甚至更优选八，甚至更优选九，且最优选十。
[0322]12.项1-11任一项所述的变体，其中所述变体包含与SEQ ID NO:3的亲本木葡聚糖酶的氨基酸序列具有至少75%同一性的氨基酸序列。
[0323]13.项1-12任一项所述的变体，其中所述变体与所述亲本木葡聚糖酶相比具有改善的化学稳定性。
[0324]14.项13的变体，其中所述改善的化学稳定性导致改善的洗涤剂稳定性。
[0325]15.一种分离的多核苷酸序列,其编码项1-12任一项所述的变体。
[0326]16.项15的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列通过诱变对应于SEQ ID NO:1的亲本多核苷酸序列，或通过 诱变与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少75%同一性的多核苷酸序列来制备。
[0327]17.一种包含表达载体的重组宿主细胞，所述表达载体包含项15或16的多核苷酸序列。
[0328]18.一种产生亲本木葡聚糖酶变体的方法，其中所述变体具有木葡聚糖酶活性，所述方法包括:
[0329]a)在适于所述变体表达的条件下培养项17的宿主细胞；和
[0330]b)从培养基回收所述变体。
[0331]19.一种改善木葡聚糖酶的洗漆剂稳定性的方法,其包括改变一个或多个选自下组位置的位置:68、123、156、118、200、129、137、193、92、83、149、34、340、332、9、76、331、310、324、498、395、366、1、374、7、140、8、14、21、211、37、45、13、78、87、436、101、104、111、306、117、119、414、139、268、142、159、164、102、168、176、180、482、183、202、206、217、4、222、19、224、228、232、2、240、244、5、247、249、328、252、259、406、267、269、275、179、166、278、281、288、298、301、18、302、165、80、303、316、169、322、120、146、342、348、147、353、380、468、382、383、38、384、389、391、10、392、396、177、397、399、409、237、413、253、415、418、40、443、445、148、449、225、450、454、3、455、456、299、461、470、204、476、488、347 和507，所述位置对应于氨基酸序列SEQ ID NO: 3中的位置，且其中
[0332]a)所述改变为
[0333]i)在占据所述位置的氨基酸下游插入氨基酸，和/或
[0334]ii)缺失占据所述位置的氨基酸，和/或
[0335]iii)用不同的氨基酸取代占据所述位置的氨基酸；
[0336]b)所述亲本木葡聚糖酶是家族44木葡聚糖酶；和
[0337]c)所述变体具有木葡聚糖酶活性。
[0338]20.项19的方法，其中所述亲本木葡聚糖酶选自下组:SEQ IDN0:3、SEQ IDN0:5和SEQ ID NO: 7，或所述亲本木葡聚糖酶选自与SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少75%同一性的木葡聚糖酶。[0339]21.项19或20的方法，其中所述变体包含一种或多种下述的改变组合:
[0340]Vl*+V2*+H3* ；
[0341]VlQ+*laE+*lbV ;
[0342]H3A ； [0343]H3A+H436A ；
[0344]K8A, Q, S ；
[0345]T9D ；
[0346]T9D+L34F+A83E+Q149E+H193T+S332P+R340T ；
[0347]I10V+D33E+M40L+A41T+Q67M+Y73F+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+I222V+V228I+D249N+S269N+V272A+E333A+I337L+M356L+T374A+S416A+D444Y+A469E+K470T+I473G+T517A+S522* ；
[0348]I10V+F17S+D33E+M40L+A41T+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+Q137E+V219A+D249N+V272A+I337L+M356L+V397A+S416A+T421I+S424N+N441D+D444Y+V450I+K470T+I473S+V477I ;
[0349]I10V+F17S+D33E+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+H164N+N168K+T172A+V219A+I222V+V228I+D249N+S269N+V272A+E333A+I337L+M356L+N415S+T421I+S424H+N441D+D444Y+S522P+P523V+V524E ；
[0350]I10V+F17S+D33E+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+I222V+V228I+D249N+V272A+I337L+M356L+T374A+V397A+S416A+T421I+S424N+N441D+D444Y+V450I+A469E+K470T+I473G+T517A+S522P+P523V+V524E ；
[0351 ] 110V+F17S+D33E+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+N168K+T172A+I222V+V228I+D249N+V272A+E333A+I337L+M356L+V397A+S416A+T421I+S424H+N441D+D444Y+A469E+K470T+I473S+V477I+E489A+A490V+T517A+S522* ；
[0352]I10V+F17S+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+I222V+V228I+D249N+S269N+V272A+T320A+I337L+M356L+T374A+V397A+N415S+T421I+S424H+N441D+D444Y+A469E+K470T+I473S+V477I+T517A+S522P+P523V+V524E ；
[0353]I10V+F17S+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T104A+Q137E+N153K+R156Q+V219A+I222V+V228I+D249N+S269N+V272A+E333A+I337L+M356L+V397A+N415S+D420G+T421I+S424H+N441D+D444Y+V450I+A469E+K470T+I473G+T517A+S522* ；
[0354]I10V+F17S+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+T104A+Q137E+R156Q+V159A+H164N+N168K+T172A+I222V+V228I+D249N+V272A ；
[0355]I10V+F17S+Y53H+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+T172V+A177T+I222V+V228I+D249N+S269N+I337L+M356L+V397A+S416A+T421I+S424H+N441D+D444Y+A469E+K470T+I473G+T517A+S522* ；
[0356]K13A+K129A ；
[0357]KI3A+Q68H+T92V+KII8A+QI37E+R156Y+G200P ；
[0358]K13A, R ；
【权利要求】
1.一种亲本木葡聚糖酶的分离的变体，所述变体在所述亲本木葡聚糖酶的位置156包含氨基酸取代，所述亲本木葡聚糖酶是SEQ ID NO: 3，且其中所述变体在位置156的氨基酸用酪氨酸取代；其中所述变体为选自下述的改变组合:
D37G+K129A+R156Y
D37N+K129A+R156Y
G78A+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
G78A+KII8A+KI29A+R156Y+KI69A
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
G78A+T92V+KII8A+KI29A+R156Y+KI69A
KII8A+KI29A+FI46L+R156Y+G200P+N33IF
K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F
K118A+K129A+R156Y
Kl18A+K129A+R156Y+A224P
KII8A+KI29A+R156Y+G200P+M310V+N331F
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F+N399I
KII8A+KI29A+R156Y+KI69A+G200P+N33IF
Kl18A+K129A+R156Y+K470T
K118A+R156Y
K118A+R156Y+G200P
K129A+Q137E+R156Y
KI29A+QI37E+R156Y+G200P
K129A+R156Y
K129A+R156Y+D303I
K129A+R156Y+D303K
K129A+R156Y+D303S
K129A+R156Y+D303V
K129A+R156Y+D324N
K129A+R156Y+D366H+T374A
K129A+R156Y+D461N
K129A+R156Y+D461Q
K129A+R156Y+D461T
K129A+R156Y+G200P
K129A+R156Y+G200P+G204T+R211K
K129A+R156Y+H164N
K129A+R156Y+K176S
K129A+R156Y+K275T
K129A+R156Y+K322I+K454QK129A+R156Y+K454Q
K129A+R156Y+N302K+D303L
K129A+R156Y+N302K+D303S
K129A+R156Y+P507A
K129A+R156Y+R267H
K129A+R156Y+V159M+H164N+F165Y
K129A+R156Y+V259I+R267K+L268K+S269A
D37G+K129A+R156Y
D37N+K129A+R156Y
G78A+K118A+K129A+R156Y+G200P+N33IF。
2.一种分离的多核苷酸序列，其编码权利要求1所述的变体。
3.权利要求2 的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列通过诱变对应于SEQID NO:1的亲本多核苷酸序列来制备。
4.一种包含表达载体的重组宿主细胞,所述表达载体包含权利要求2或3的多核苷酸序列。
5.一种产生亲本木葡聚糖酶变体的方法，其中所述变体具有木葡聚糖酶活性，所述方法包括: a)在适于所述变体表达的条件下培养权利要求4的宿主细胞；和 b)从培养基回收所述变体。
6.一种改善木葡聚糖酶的洗涤剂稳定性的方法，其包括在亲本木葡聚糖酶的位置156的氨基酸取代，所述亲本木葡聚糖酶是SEQ ID NO: 3，且其中所述变体在位置156的氨基酸用酪氨酸取代；其中所述变体为选自下述的改变组合:
D37G+K129A+R156Y
D37N+K129A+R156Y
G78A+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
G78A+K118A+K129A+R156Y+K169A
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
G78A+T92V+KII8A+KI29A+R156Y+KI69A
KII8A+KI29A+FI46L+R156Y+G200P+N33IF
K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F
K118A+K129A+R156Y
Kl18A+K129A+R156Y+A224P
KII8A+KI29A+R156Y+G200P+M310V+N331F
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F+N399I
KII8A+KI29A+R156Y+KI69A+G200P+N33IF
Kl18A+K129A+R156Y+K470T
K118A+R156YK118A+R156Y+G200PK129A+Q137E+R156YKI29A+QI37E+R156Y+G200PK129A+R156YK129A+R156Y+D303IK129A+R156Y+D303KK129A+R156Y+D303SK129A+R156Y+D303VK129A+R156Y+D324NK129A+R156Y+D366H+T374AK129A+R156Y+D461NK129A+R156Y+ D461QK129A+R156Y+D461TK129A+R156Y+G200PK129A+R156Y+G200P+G204T+R211KK129A+R156Y+H164NK129A+R156Y+K176SK129A+R156Y+K275TK129A+R156Y+K322I+K454QK129A+R156Y+K454QK129A+R156Y+N302K+D303LK129A+R156Y+N302K+D303SK129A+R156Y+P507AK129A+R156Y+R267HK129A+R156Y+V159M+H164N+F165YK129A+R156Y+V259I+R267K+L268K+S269AD37G+K129A+R156YD37N+K129A+R156YG78A+K118A+K129A+R156Y+G200P+N33IF。
7.一种配制物,其包含权利要求1所述的变体。
8.权利要求7的配制物，其中所述配制物是液体配制物。
【文档编号】C11D3/386GK104017789SQ201410265667
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2009年6月4日 优先权日:2008年6月6日
【发明者】沃纳.贝森马特, 艾斯本.P.弗里伊斯, 基思.吉布森, 弗兰克.W.拉斯马森, 迈克尔.斯克乔特 申请人:诺维信公司