902, 73. 397 和73. 662ym);图IlH和IlI显示10秒处理的情形中解体（之后再稳固）深度的测量值 (17. 804 和 27.57ym)。
[0093]图 12 显示，左图：扫描电镜检查（Scanningelectronmicroscopy,SEM)照片 显示编辫的未经处理的丝架（作为对照）。中图：SEM照片显示经CaCl2/Et0H/H20处理 (20secCaCl2)或经甲酸处理（20secFA)的蚕丝制品的表面，处理持续时间为20sec或 40sec(40secCaCl2;40secFA)。右图：SEM照片显示经CaCl2/Et0H/H20和甲酸处理的本发 明蚕丝制品的表面，每步处理的持续时间为20sec(20secCaCl2/20secFA)。比例尺分别为 100Um和 10ym〇
[0094] 图13显示将原生丝纤维和未脱胶丝纤维粘在一起，得到未破坏且未解体的结构 (13A(US8 202 379BI)、13B(Haverhals等，2010)、13C(Ghanaati等，2010)。
【具体实施方式】[0095]实施例：
[0096] 材料和方法
[0097] 除非特指，所有试剂都得自Sigma(维也纳，奥地利）且为分析级。
[0098] 设计并制备蚕丝导管
[0099] 白色家蚕蚕丝（20/22den，250T/m)购自TestexAG(苏黎世，瑞士）。该蚕丝导管 具有管状造型，是与一个商业纺织公司（EdelridGmbH，丨snyimAllgiiu,德国）合作制造。 六根单丝绞成纱线（yarn)，代表了商业编织机的原材料。所述管状结构是由六个相互缠绕 扭结的丝线形成的，见图1的示例。所得的生丝导管在0. 2M硼酸的0. 05M硼酸钠缓冲液pH =9. 0中煮沸（Jiang等，Mat.Lett. 60 (2006)，919-925)以脱胶。故，将2g生丝导管两次 在500mL脱胶液中煮沸45min。脱胶后，丝架在CldH2O中充分洗净，风干，以备进一步加工。
[0100] 经过脱胶的SF管纱置于ABS(丙烯腈-丁二烯-苯乙烯）杆上，在三元溶剂氯化 钙/蒸馏水/乙醇（CaCl2/H20/乙醇，摩尔比1:8:2)组成的煮沸液中浸泡20秒。待表面浸 蚀后，马上将管纱在100%甲酸（FA)中室温浸泡20秒。然后将管纱再在甲醇中再浸没20 分钟，随后用CldH2O彻底清洗。将这些管纱在层流气流下干燥，高压蒸汽灭菌，备用。
[0101] 耐力（Endurance)和疲劳（fatigue)测试
[0102] 为测试SF-NGC与未处理的初始管状SF-骨架相比的弹性，定制了一台加压测试 仪。此设备被设计为以恒定最大压力对测试标本反复施压。活塞由随动发动机（Modelcraft RS2MG/BBstandardservo,ConradElectronicSE,Hirschau,德国）驱动，以接近 5mm/ s的速度，从顶部位置向下直线移动，直到它触碰到探头（probe)。活塞持续压迫探头直至 达到预设的力度阈值。活塞中整合有压力感应电阻（StraingaugeFSR151，Interlink electronics,Camarillo,CA,USA)，起感应器的作用，是分压器（voltagedivider)的组成 部分。用微型控制器（ArduinoDuemilanoveControllerBoardwithAtmega328yC,Atmel MunichGmbH,Garching/Munich,德国）内置的IObitADC，以 50Hz的采样频率，对电阻、 因此还有施加的压力不断采样。此系统用实验室标度（scale)校准，操作精度在±5g 以内。活塞一旦达到阈值就返回顶部位置，并在顶部停留一段时间，该时间由用户设定。 此过程按用户在串联LCD显示器（SerLCDSFE09395 2lineLCDDisplay,Sparkfun electronics,Boulder,USA)上设定的反复次数而不断反复。
[0103] 测试前，各份样品在PBS中水化过夜（o/n)。为进行测试，导管在Petri皿中固定， 用PBS覆盖。力学测试方案是，进行1000个加压和释压周期，所加压力为300g，每次加压 持续300ms。测试过程后，将所测试的管纱室温过夜以便风干，在施压部位小心地切出接近Imm厚的切片进行形态学分析。最后，施压后残余的变形能力用SEM分析来评估。
[0104]SEM分析
[0105] 样品在2. 5%戊二醛的次甲砷酸缓冲液中室温过夜进行固定。然后样品由分级 乙醇和接下来的六甲基二娃氮（disilazane)脱水，再在通风橱中风干。样品用Polaron SC7620 喷涂仪（QuorumTechnologiesLtd.EastGrinstead,英国）喷涂Pd_Au，用JEOL JSM-6510 扫描电镜（JEOLGmbH,Eching/Munich,Germany)以 3kV进彳丁检查。
[0106] 细胞培养实验
[0107]NIH/3T3
[0108] NIH/3T3细胞系购自ECACC(欧洲细胞培养物保藏中心，UK)。在包被有0. 2%明胶 溶液的平板中，将NIH/3T3细胞培养在含10%胎牛血清（FCS)的DMEM(LonzaLtd.，巴塞 尔，瑞士）中，该培养基补加了 2mML-谷氨酰胺、lOOU/mL青霉素和0.lmg/mL链霉素。
[0109] 许旺样细胞（Schwann-likecells)
[0110] 脂肪衍生的基质细胞（Adipose-derivedstromacells,ASC)从Sprague-Dawley 大鼠分离，并分化为许旺细胞样表型（Kingham等，Exp.Neurol. 207(2007)，267-274)。简 言之，将解剖出的内脏脂肪切碎，用I型胶原蛋白酶处理，分离出ASC。细胞在作为生长培 养基、含10%胎牛血清（FCS;PAA，Pasching,奥地利）的改良型Eagle培养基（a-MEM)中 培养和传代后，ASC先与含lmM0 -巯基乙醇的生长培养基一起保温24h。然后，将培养基 换成补加了 35ng/mL全反式视黄酸的新鲜培养基，再培养2h。最后，添加分化培养基，其包 含血小板衍生的生长因子（PDF;Peprotech,维也纳，奥地利）、lOng/mL碱性成纤维细胞生 长因子（bFGF;P印rotech，维也纳，奥地利）、14yM毛喉素和252ng/mL神经胶质生长因子 2 (GGF-2 ;Peprotech,维也纳，奥地利）。
[0111] 许旺样细胞（Schwann-likecells,SLCs)以IO5个细胞/mL的浓度接种 在SF-NGC内壁。2小时后，给细胞供应含10 %FCS(PAA，Pasching,奥地利）、0. 1 % heregulin(Preprotech,维也纳，奥地利）和14yM毛喉素的培养基。3天后，SLC附着至 SF-NGC内壁结构的情况用钙黄绿素AM染色（Invitrogen,维也纳，奥地利）评估。
[0112] 细胞通透性
[0113] 设计一个细胞迀移试验来验证SF-NGC的细胞不通透性。用IOOy1含 F1DGF-AA(Peprotech,维也纳，奥地利）的纤维蛋白凝块（Tisseel,Baxter,维也纳，奥地 利）诱导细胞迀移。l〇ngI3DGF-AA在纤维蛋白原中彻底混合后，将该混聚物与250个单位 /mL的凝血酶一起保温。得到的紧密纤维蛋白结构避免了TOGF-AA的爆发释放。再将此纤 维蛋白凝块置于所研宄的管纱内侧，将如此装配的结构物钉入包被了硅酮的（Sylgard? 184,DowCorningEuropeS.A.，Seneffe,Belgium) 12-孔平板中。另一份 100y1 的纤维 蛋白凝块含2.5xl05NIH/3T3成纤维细胞，将其放置在所述管纱顶部。.纤维蛋白原用2个 单位/mL凝血酶聚合，以生成松散的均匀纤维蛋白结构，并允许成纤维细胞从该凝块相趋 化刺激物迀移。作为阳性对照，从含有TOGF-AA的凝块用IOOym孔径的细胞滤器的尼龙网 (BectonDickinson,Schwechat,奥地利）分离出含有细胞的纤维蛋白凝块。添加培养基， 直至构建物被彻底覆盖，将这些实验物混合2天和4天后，更换培养基。第6天评估细胞迀 移，方法是将含有I3DGF-AA的纤维蛋白凝块用钙黄绿素AM(Invitrogen,维也纳，奥地利） 染色。除了将所述结构物固定到Petri皿上的可能性以外，Sylgard?184已知因其疏水特 性而能阻止细胞粘附（Ai等，CellBiochemBiophys. 38(2003)，103-114)，从而避免细胞从 一个凝块越过细胞培养板的表面向另一凝块迀移的可能性。结果，从一个凝块向另一凝块 移动的唯一途径是穿过SF-NGC，因此必须要求SF-NGC有一定的细胞通透性。
[0114] 细胞毒作用分析
[0115] 为测试作制得的SF-NGC的细胞毒作用，将IgSF-NGC切割材料在5mL细胞培养基 中浸没至少24h。与此平行地，在24孔板上每孔接种0.2xl05NIH/3T3成纤维细胞。含有从 切割材料滤出的产物的培养基然后过滤（〇. 22ym,Rotilabo,Karlsruhe,德国），用于更换 细胞培养中的培养基。用标准的细胞培养基作为阴性对照。将细胞培养基吸出，每孔分别 添加含650mg/mLMTT[3-(4, 5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑]溴化物的细胞培养 基。在37°C和5%CO2中保温Ih后，吸出培养基，将MTT甲臜（formazan)沉淀物避光机械 振荡20min，使之溶于DMS0。将每份样品的100y1等份转移到96孔板。马上在自动微滴 板读数仪（SpectraThermo,TECANAustriaGmbH,奥地利）上读取540nm处的吸光度。针 对非特异性本底，校准光密度（OD)值。
[0116] 动物和IOmm神经缺损模型
[0117] 所有动物在LudwigBoltzmannInstitute的实验和临床外伤学部饲养，环境温度 可控。随意供应食物和水。所有实验方案得到奥地利维也纳市政府批准，符合国家卫生院 (NationalInstituteofHealth)制定的实验动物保护和使用指南的规定。
[0118] 一共有 22 只体重介于 350 - 450g的雌性Sprague-Dawley大鼠（AnimalResearch Laboratories,Himberg,奥地利）用于这些实验。18只大鼠随机分配到三个不同处理组： 自体移植（n= 6)、SF-NGC(n= 6)和填充胶原的SF-NGC(n= 6)，观察12周。给动物称重 后，在熏箱中以80011117111111流速给予3.5%异氟烷（「〇1'3此@,41*〇?，维也纳，奥地利）进 行麻醉。后续在整个手术过程中的麻醉用喷嘴喷2. 5%异氟烷来维持。在右后腿手术部位 刮毛，用0-Isodona(Mundipharma，维也纳，奥地利）清洁。所有后续手术过程在手术显微 镜（LeicaM651，LeicaGmbH,维也纳，奥地利）下进行。切开皮肤和肌肉，暴露坐骨神经。 取出一段8mm的坐骨神经，远端和近端残端都略微收缩，结果形成IOmm的缺口。在自体移 植组，切出 8mm的坐骨神经，翻转 180。，再用Ethilon8/0(Ethicon_Johnson&Johnson,布 鲁塞尔，比利时）穿过神经外膜而缝回近端和远端残端。在两个SF-NGC组，神经导管的移 植是，将近端和远端神经残端插入12mm管纱中，通过两个神经弓突缝合接到丝架上。其中 一组的SF-NGC内腔另外填充大鼠尾部来源的I型胶原（Millipore，维也纳，奥地利）。之 后，通过连续走针（Vicryl4/0，Ethicon_Johnson&Johnson,布鲁塞尔，比利时）缝合肌肉 层，通过可吸收型单线（Vicryl4/0，Ethicon-Johnson&Johnson,布鲁塞尔，比利时）将皮 肤闭合。之后，将大鼠都放回笼中，待其恢复。在即将手术之前，以及在手术的2天后，用 0? 75mg/kgBW美洛昔康（Meloxicam) (Metacam?，Boehringerlngelheim，Ingelheim/ Rhein,Germany)和I. 25mg/kgBW布托菲诺（butorphanol)(buta.rn.id.Ol'?，RichterPharma AG,Wels,奥地利）进行止痛处