专利名称：对糖类物质有浓度响应的可降解的苯硼酸/粘液素层层自组装超薄膜的制作方法
技术领域：
本发明涉及高分子自组装膜领域，尤其涉及一种利用层层自组装技术制备苯硼酸衍生物/粘液素超薄膜的方法及应用。
背景技术：
Layer-by-Layer(LbL)自组装(通常译作层层自组装)属于界面超分子组装技术，是一种制备厚度精确可控的功能薄膜的方法。此方法具有组装基元丰富、组装流程简单可控及薄膜调控功能优越等优点。聚离子、生物大分子、金属胶体粒子、表面带电荷的无机微小粒子等均可作为组装基元。组装流程则主要是将洗涤干净的基片依次浸泡在组装材料中，通过静电吸引使其交替沉积在基片表面，如此重复组装即可获得不同厚度的功能薄膜。 随着对层层自组装技术的不断扩展，一些非静电相互作用力如，氢键作用、疏水作用和生物特异识别作用也被引入作为层层组装的成膜推动力，大大拓展了此技术的应用范围。目前它以成为生物医用材料表面设计和修饰的有效手段。与其它层状组装超薄膜技术(LB膜技术)相比，层层自组装技术的最大特点是对沉积过程或膜结构的分子级控制。通过调控成膜溶液的酸碱度或离子强度，即可获得功能可调的超薄膜表面。特别在生物大分子层层组装中，此技术可以提高薄膜的生物相容性并可维持生物分子的天然结构。通过连续沉积不同组分即可实现层间分子对称或非对称的二维甚至三维的超晶格结构，从而实现薄膜的光、电、磁、非线性光学性等的功能化；也可仿真自然生物膜的形成。苯硼酸(PBA)是一种Lewis酸，在水溶液中以带负电荷的解离态和不带电荷的未解离态平衡存在。其中只有带电荷的形式可以与具有1，2-或1，3-二醇基团的多羟基化合物(多糖、糖脂、糖蛋白及核苷酸等物质)形成可逆的五元或六元环酯，从而可用于多羟基化合物的识别、分离与检测。众所周知，在自然界中存在大量这样的多羟基化合物，而且它们许多都存在于生物体内，对生物体的生命活动有重要影响。因此苯硼酸不仅可以用于这些化合物的检测、分离与提纯，还可以将其对体内多羟基物质的识别功能用于自律式给药系统或调节某些生命活动。基于苯硼酸的上述特性，苯硼酸衍生物中的硼酸基团可与粘液素糖链中的羟基反应形成可逆的硼酯共价键。以此种硼酯共价键为主要推动力的层层自组装超薄膜在适宜的条件下即会发生解组装。例如在糖类物质(如葡萄糖)存在下，其会与粘液素中的糖链竞争硼酸基团从而导致自组装膜解组装。因此本发明的苯硼酸衍生物/粘液素层层组装超薄膜是一种对糖类物质有浓度响应的可降解超薄膜。
发明内容
本发明的目的是提供一种对糖类物质有浓度响应的可降解的苯硼酸衍生物/粘液素超薄膜及其制备方法和应用。
利用层层自组装技术制备苯硼酸衍生物/粘液素超薄膜的方法如下首先将基片依次浸泡在阳离子和阴离子聚电解质中，重复多个循环完成基片底膜的制备；再将苯硼酸衍生物和粘液素分别溶于pH 8. 0-9.0,0. OlM磷酸盐缓冲液中，配成终浓度为0. 1-0. Olmg/mL含0-0. 5M NaCl的溶液。然后将预组装底膜的基片继续浸泡在苯硼酸衍生物溶液中，30-60分钟取出，去离子水冲洗、氮气干燥；再同样操作放入粘液素溶液中浸泡。如此重复循环即可获得苯硼酸 衍生物/粘液素层层自组装超薄膜。上述步骤中所述的阳离子聚电解质为聚二烯丙基二甲基氯化铵(TODA)、聚丙烯胺(PAH)和聚醚酰亚胺(PEI);阴离子聚电解质为聚苯乙烯磺酸盐(PSS)、聚丙烯酸(PAA)。上述步骤中所述的苯硼酸衍生物为聚(丙烯酰胺-3-丙烯酰胺基苯硼酸)[P(AAm-AAPBA)]，其中丙烯酰胺单体与3-丙烯酰胺苯硼酸单体的比例为100 5或是1000 50 ;为聚(N-异丙基丙烯酰胺-3-丙烯酰胺苯硼酸)[P (NIPAM-APBA)]，其中N-异丙基丙烯酰胺单体与3-丙烯酰胺苯硼酸单体的比例为50 25或是750 37.5。上述步骤中所述的粘液素为猪胃粘蛋白(PGM)、牛颂下腺粘蛋白(BSM)或人粘蛋白(MUC5B)。上述步骤中所述的基片为玻璃片、硅片、石英片、石英金片、石英银片、细胞培养板和ELISA板。玻璃、石英和硅片基片在使用前需要经过酸洗。其中酸洗的过程为将玻璃、石英和硅片基片浸泡在75°C的体积比为7 3的98wt^H2SO4与30被^H2O2混合溶液中，浸泡2-3小时，然后用去离子水清洗干净，氮气干燥后使用。石英金片在使用前需要经过碱洗。过程为采用体积比为I : I : 5的25-28wt%&氨水、30wt% H2O2与去离子水的混合溶液，75°C浸泡15-30分钟,浸泡后用去离子水清洗干净,氮气干燥后使用。本发明所述层层自组装超薄膜应用于体内和体外糖类物质浓度检测基于苯硼酸能与糖类或是糖蛋白结合形成硼酸酯这一原理，采用本发明制备的含苯硼酸组分的层层自组装膜可以用于检测糖类物质(例如葡萄糖)。本发明采用的方法是以石英金片为基片制备苯硼酸衍生物/粘液素层层自组装薄膜，再利用石英晶体微天平测定随糖类通入时间的变化石英金片频率变化的情况。本发明的制作设备简单、成本低、有较好的使用价值。通过对薄膜厚度的调控可有效提高对糖类物质检测或吸附的灵敏度。并且可逆硼酯共价键的特性使此超薄膜易于降解，更利于重复组装及使用。
图I为实施例I中，在不同盐离子浓度溶液中，苯硼酸衍生物与粘液素层层吸附所引起的石英银电极频率变化的曲线。图2为实施例2中，在不同pH值溶液中，苯硼酸衍生物与粘液素层层吸附所引起的石英银电极频率变化的曲线。图3为应用例I中，在pH值9.0条件下不同浓度葡萄糖溶液引起组装金电极频率变化的曲线。图4为应用例2中，在pH值7. 4条件下不同浓度葡萄糖溶液引起组装金电极频率变化的曲线。
具体实施例方式通过以下实施例和应用例对本发明做更详细的描述，但所述实施例和应用例不构成对本发明的限制。实施例I :苯硼酸衍生物/粘液素超薄膜组装将500uL聚二烯丙基二甲基氯化铵(I3DDA)和IOOmg聚苯乙烯磺酸盐(PSS)分别溶于IOOmL超纯水中，配成lmg/mL的溶液；分别取聚(丙烯酰胺_3_丙烯酰胺基苯硼酸)[P (AAm-AAPBA)]和猪胃粘蛋白(PGM)溶于pH 9. 0,0. OlM磷酸盐缓冲液中，配成终浓度为0. lmg/mL的溶液，其中含有0. 5M NaCl。将干净的石英银电极(石英片基频为9MHz，切割方式为AT-cut)先浸泡在I3DDA溶液中，10分钟后取出，去离子水冲洗氮气吹干；再浸泡在PSS溶液中，10分钟后取出，去离子水冲洗氮气吹干。如此重复两次，最后浸泡于roDA溶液中，完成石英银电极2. 5个双层(roDA/PSS)2roDA底膜的制备，右下角数字2为重复浸泡的次数，再将此石英银电极放入石英晶体微天平上测量频率变化。然后继续将此银电极分别浸泡在含有不同盐浓度(0M、
0.15M、0. 25M和0. 5M NaCl)的P (AAm-AAPBA)溶液中，20分钟取出，去离子水冲洗氮气吹干；再放入含有相同盐浓度的PGM溶液中浸泡，20分钟取出，去离子水冲洗氮气吹干。此为一个循环，如此重复10次即在石英银电极表面制得10个双层的P(AA-APBA)/PGM层层自组装超薄膜。在每层冲洗吹干后都将银电极放入石英晶体微天平中测量银电极频率的变化，检测不同盐浓度下每双层的P(AAm-AAPBA)和PGM吸附量的情况，结果如图I。实施例2 :苯硼酸衍生物/粘液素超薄膜组装将ImL聚二烯丙基二甲基氯化铵(TODA)和200mg聚苯乙烯磺酸盐(PSS)分别溶于 IOOmL超纯水中，配成2mg/mL的溶液。分别取5mg聚(丙烯酰胺_3_丙烯酰胺基苯硼酸)[P(AAm-AAPBA)]和猪胃黏蛋白(PGM)溶于pH 8. 0-9. 0,0. OlM磷酸盐缓冲液中，配成终浓度为0. lmg/mL的溶液，其中含0. 5M NaCl。按照实例I方法在石英银电极(石英片基频为9MHz，切割方式为AT-cut)上预组装2. 5个双层(roDA/PSS)2H)DA底膜，然后再将此银电极分别浸泡在不同pH值(pH 8.0、pH 8. 5和pH 9. 0)的P(AAm-AAPBA)溶液中，30分钟取出，去离子水冲洗氮气吹干；再浸泡在相应PH值的PGM溶液中，30分钟取出，去离子水冲洗氮气吹干。如此重复10个循环，SP在石英银电极制得10个双层的P (AAm-AAPBA)/PGM层层自组装超薄膜。将每层去离子水冲洗氮气吹干后电极都放入石英晶体微天平中测量银电极频率的变化，检测不同PH值条件下P(AAm-AAPBA)和PGM吸附量的情况，结果如图2。实施例3 :碱性条件下苯硼酸衍生物/粘液素超薄膜对葡萄糖浓度响应的应用按照实施例I方法在石英金电极表面组装6个双层的P (AAm-AAPBA) /PGM层层组装超薄膜。再将组装好的石英金电极安装在石英晶体微天平内(石英片基频为5MHz，切割方式为AT-cut)，先用pH 9.0,0. OlM磷酸盐缓冲液走平基线，再分别换用浓度为0. 5、I和5mg/mL, pH 9. 0的葡萄糖溶液。检测在pH值9. 0条件下不同浓度葡萄糖溶液对已组装薄膜的金电极频率的影响，结果如图3所示。实施例4 :生理pH值条件下苯硼酸衍生物/粘液素超薄膜对葡萄糖浓度响应的应用按照实施例I方法在石英金电极表面组装5. 5个双层的P (AAm-AAPBA) /PGM层层组装超薄膜。再将组装好的石英金电极安装在石英晶体微天平内(石英片基频为5MHz，切割方式为AT-cut)，先用pH 7. 4，0. OlM磷酸盐缓冲液走平基线，再分别换用浓度为0. 5、I和5mg/mL, pH 7. 4的葡萄糖溶液。检测在生理pH值条件下不同浓度葡萄糖溶液对已组装薄膜的金电极频率的 影响，结果如图4所示。
权利要求
1.苯硼酸衍生物/粘液素层层自组装超薄膜，其特征在于它的制备方法如下 首先将基片依次浸泡在阳离子和阴离子聚电解质中，重复多个循环完成基片底膜的制备；再将苯硼酸衍生物和粘液素分别溶解于溶剂，配成0. 1-0. 01mg/mL的溶液。然后将预组装底膜的基片继续浸泡在苯硼酸衍生物溶液中，30-60分钟取出，去离子水冲洗、氮气干燥；再同样操作放入粘液素溶液中浸泡。如此重复循环即可获得苯硼酸衍生物/粘液素层层自组装超薄膜。
2.根据权利要求I所述的苯硼酸衍生物/粘液素层层自组装超薄膜，其特征在于，所述的阳离子聚电解质为聚二烯丙基二甲基氯化铵(TODA)、聚丙烯胺(PAH)聚醚酰亚胺(PEI)；阴离子聚电解质为聚苯乙烯磺酸盐(PSS)、聚丙烯酸(PAA)。
3.根据权利要求1-2所述的苯硼酸衍生物/粘液素层层自组装超薄膜，其特征在于，所述的苯硼酸衍生物为聚(丙烯酰胺-3-丙烯酰胺苯硼酸)[P (AAm-AAPBA)]，其中丙烯酰胺单体与3-丙烯酰胺苯硼酸单体的比例为100 5或是1000 50;为聚(N-异丙基丙烯酰胺-3-丙烯酰胺苯硼酸)[P (NIPAM-AAPBA)]，其中N-异丙基丙烯酰胺单体与3-丙烯酰胺苯硼酸单体的比例为50 25或是750 37.5。
4.根据权利要求1-3所述的苯硼酸衍生物/粘液素层层自组装超薄膜，其特征在于，所述的粘液素为猪胃粘蛋白(PGM)、牛颌下腺粘蛋白(BSM)或人粘蛋白(MUC5B)。
5.根据权利要求1-4所述的苯硼酸衍生物/粘液素层层自组装超薄膜，其特征在于所述的溶剂为0. OlM磷酸盐缓冲液，pH值8. 0-9. 0，其中含有0-0. 5M NaCl。
6.根据权利要求1-5所述的苯硼酸衍生物/粘液素层层自组装超薄膜，其特征在于所述的基片为玻璃片、硅片、石英片、石英金片、石英银片、细胞培养板和ELISA板。
7.权利要求1-6任一项所述的苯硼酸衍生物/粘液素层层自组装超薄膜的制备方法，其特征在于首先将基片依次浸泡在阳离子和阴离子聚电解质中，重复多个循环完成基片底膜的制备；再将苯硼酸衍生物和粘液素分别溶解于溶剂，配成0. 1-O.Olmg/mL的溶液。然后将预组装底膜的基片继续浸泡在苯硼酸衍生物溶液中，30-60分钟取出，去离子水冲洗、氮气干燥；再同样操作放入粘液素溶液中浸泡。如此重复循环即可获得苯硼酸衍生物/粘液素层层自组装超薄膜。
8.权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述的阳离子聚电解质为聚二烯丙基二甲基氯化铵(TODA)、聚丙烯胺(PAH)聚醚酰亚胺(PEI);阴离子聚电解质为聚苯乙烯磺酸盐(PSS)、聚丙烯酸(PAA)。
9.根据权利要求1-6任一项所述层层自组装超薄膜在体内和体外对糖类物质检测的应用。
全文摘要
本发明提供一种对葡萄糖及其它糖类物质有浓度响应的可降解苯硼酸衍生物/粘液素超薄膜的制备方法。这种自组装超薄膜的具体制备步骤如下先将干净基片依次浸泡在阳离子和阴离子聚电解质中，重复操作在基片表面制备多个双层的底膜；然后再将此基片依次浸泡在苯硼酸衍生物溶液和粘液素溶液中。通过重复上述浸泡过程，即可获得易于降解的苯硼酸衍生物/粘液素层层自组装超薄膜。本发明的制作设备简单、成本低、有较好的使用价值。通过对薄膜厚度的调控可有效提高对糖类物质检测或吸附的灵敏度。并且可逆硼酯共价键的特性使此超薄膜易于降解，更利于重复组装及使用。
文档编号C04B41/52GK102775078SQ20121007322
公开日2012年11月14日 申请日期2012年3月13日 优先权日2012年3月13日
发明者安铁洙, 李玉花, 林园, 王倩, 王博, 蓝兴国 申请人:东北林业大学大庆生物技术研究院, 大庆麦伯康生物技术有限公司, 李玉花