本发明属于环境修复技术领域，特别涉及链霉菌降解甲氧咪草烟除草剂的方法。
背景技术：
在20世纪80年代，美国氰胺公司以随机筛选为创作源，开发了一类乙酰乳酸合成酶抑制剂类的高效广谱性除草剂，名为咪唑啉酮类除草剂。由于该除草剂因具有高效、使用范围广、选择性强、使用方便等优点，曾在国际上占有绝对的市场，尤其是在美国。而在我国的东北三省尤其是黑龙江地区，广泛使用该类除草剂来防止田间杂草。
在咪唑啉酮类除草剂的6种销售产品中，甲氧咪草烟应用最为广泛，甲氧咪草烟于1997年上市，用于油菜、大豆、向日葵和水稻，向日葵是其主要应用作物，目前甲氧咪草烟的使用量稳步增长。但咪唑啉酮类除草剂在土壤中残留时间长，且由于我国是轮作套种，往往对后茬敏感作物产生药害。因此，如何解决其残留问题成为目前的一个重要课题。一般情况下，除草剂在土壤中可通过光解、水解以及微生物降解而消失。但众多研究证明，在需氧条件下的微生物降解是咪唑啉酮类除草剂的主要降解途径。
但是现有的微生物降解甲氧咪草烟除草剂，并没有找到一种在降解甲氧咪草烟除草剂的同时还能提取和检测甲氧咪草烟除草剂的方法。
技术实现要素：
发明目的：
本发明提供了采用链霉菌降解甲氧咪草烟除草剂的方法，同时确定了除草剂的提取方法及最佳检测条件，其目的是通过探究链霉菌对甲氧咪草烟除草剂的降解效果和最佳条件，更加有效地减少咪唑啉酮类除草剂对环境的危害和影响。
技术方案：
链霉菌降解甲氧咪草烟除草剂的方法，该方法包括：
（1）链霉菌的活化；
（2）筛选链霉菌的培养基；
（3）通过移液提取的方法提取甲氧咪草烟，并利用高效液相色谱法测定甲氧咪草烟的含量；
（4）利用链霉菌降解甲氧咪草烟除草剂。
该方法的具体步骤是：
（1）将链霉菌(streptomycessp.)jb接种于无机盐固体培养基上，然后在倒置于培养箱中在恒温下培养；高压灭菌后，加入甲氧咪草烟，并用接种环挑取固体培养基上的链霉菌jb接入其中，在摇床中黑暗的条件下培养；
（2）将菌株jb在含有100mg/l的甲氧咪草烟的无机盐液体培养基和蛋白胨培养基中分别进行培养，选择甲氧咪草烟降解率高的作为链霉菌的培养基；
（3）将链霉菌的培养基放入离心管中，加入乙腈、乙酸；震荡后加入nacl，摇晃直到能明显观察到液体分层为止；离心后取上层有机液，冷藏，即为提取的甲氧咪草烟；利用高效液相色谱仪检测甲氧咪草烟的含量；
（4）利用链霉菌降解甲氧咪草烟除草剂；将链霉菌jb接种于步骤（2）中筛选出的培养基中，甲氧咪草烟除草剂浓度为100mg/l时，链霉菌jb的投入量为5-10%，温度为25-30℃，ph值为6.5-8.0。
进一步地，步骤（1）中甲氧咪草烟的加入量的质量与无机盐液体培养基的体积比为（5-15）mg：100ml；
步骤（3）中加入的乙腈与培养基体积相等的；体积分数为65%的乙酸加入量是乙腈体积的0.1%；震荡后加入与乙腈和培养基总体积比为10ml：2.5g质量的nacl；
进一步地，链霉菌的活化是：将链霉菌(streptomycessp.)jb接种于无机盐固体培养基上，然后在倒置于培养箱中在恒温30℃-38℃下培养4-10d；再配制无机盐液体培养基，高压灭菌后，待培养基温度为小于40℃时向100ml无机盐液体培养基中加入5-15mg甲氧咪草烟，并用接种环挑取固体培养基上的链霉菌jb接入其中，在摇床中以30℃、150rpm、黑暗的条件下培养15-20d。
进一步地，筛选甲氧咪草优势培养基是将菌株jb分别在甲氧咪草烟浓度为100mg/l的无机盐液体培养基和蛋白胨培养基中进行培养，根据甲氧咪草烟降解率；选择甲氧咪草优势培养基。
进一步地，移液提取的方法具体是：
用移液枪取5ml含有甲氧咪草烟的培养基于15ml的离心管中，加入乙腈和乙酸，在转速为220rpm、25℃的摇床上振荡30min，加入nacl，直到能明显观察到液体分层为止；
然后在4000r/min下离心5min，取出后吸取上层有机液体，通过0.22μm的一次性针筒过滤器进行过滤，注入高效液相色谱测定的棕色瓶中，冷藏待测，为待测的甲醛咪草烟试样。
进一步地，利用高效液相色谱仪对待测的甲醛咪草烟试样进行检测，培养基采用蛋白胨培养基；流动相组成：乙腈：乙腈的加入量与培养基体积相等；乙酸水溶液体积比为65：35，乙酸加入量为乙腈含量的0.1%；流量：20μl/min；柱温：30℃；检测波长为254nm，对待测的甲醛咪草烟试样测定。
进一步地，利用链霉菌降解甲氧咪草烟除草剂；链霉菌设置在温度30℃，ph值7.2，链霉菌投加量为10%，除草剂初始浓度10-400mg/l。
优点及效果：
利用链霉菌降解甲氧咪草烟除草剂，具有如下优点：
（1）链霉菌在土壤中分布较多，利于筛选，使用链霉菌进行原位修复对土著微生物的影响较小。
（2）应用土壤中的微生物来降解环境中的农药具有快速、安全、环境友好的特点，是生物修复农药的重要手段之一，也是降低甲氧咪草烟除草剂污染的一个重要方法。
（3）通过探究影响链霉菌的降解因素，并不断优化条件获得最佳降解条件，确定除草剂异位生物修复机制。为治理咪唑啉酮类除草剂污染的农田提供微生物资源和有力的技术支撑。
具体实施方式：
链霉菌降解甲氧咪草烟除草剂的方法，该方法包括：
（1）链霉菌的活化；
（2）筛选链霉菌的培养基；
（3）通过移液提取的方法提取甲氧咪草烟，并利用高效液相色谱法测定甲氧咪草烟的含量；
（4）利用链霉菌降解甲氧咪草烟除草剂。
该方法的详细步骤是：
（1）将链霉菌(streptomycessp.)jb接种于无机盐固体培养基上，然后在倒置于培养箱中在恒温下培养；高压灭菌后，加入与无机盐液体培养基的体积和质量比为100ml：（5-15）mg的甲氧咪草烟，并用接种环挑取固体培养基上的链霉菌jb接入其中，在摇床中黑暗的条件下培养；
（2）将菌株jb在含有100mg/l的甲氧咪草烟的无机盐液体培养基和蛋白胨培养基中分别进行培养，选择甲氧咪草烟降解率高的作为链霉菌的培养基；
（3）将链霉菌的培养基放入离心管中，加入与培养基体积相等的乙腈、体积分数为65%的乙腈体积0.1%的乙酸；震荡后加入nacl的质量与培养基和乙腈总体积比为2.5g：10ml，摇晃直到能明显观察到液体分层为止；离心后取上层有机液，冷藏，即为提取的甲氧咪草烟；利用高效液相色谱仪检测甲氧咪草烟的含量；
（4）利用链霉菌降解甲氧咪草烟除草剂；将链霉菌jb接种于步骤（2）中筛选出的蛋白胨培养基中，甲氧咪草烟除草剂浓度为100mg/l时，链霉菌jb的投入量为5~10%，温度为25~30℃，ph值为6.5~8.0。链霉菌jb的投入量是指加入到液体培养基中的量，按液体培养基体积比加入链霉菌。
链霉菌的活化具体步骤包括：
将链霉菌(streptomycessp.)jb接种于无机盐固体培养基上，然后在倒置于培养箱中在恒温30℃-38℃下培养4-10d；再配制无机盐液体培养基，高压灭菌后，待培养基温度为小于40℃时向100ml无机盐液体培养基中加入5-15mg甲氧咪草烟，并用接种环挑取固体培养基上的链霉菌jb接入其中，在摇床中以30℃、150rpm、黑暗的条件下培养15-20d。
筛选甲氧咪草优势培养基是将菌株jb分别在甲氧咪草烟浓度为100mg/l的无机盐液体培养基和蛋白胨培养基中进行培养，根据甲氧咪草烟降解率；选择甲氧咪草优势培养基。
移液提取的方法具体是：
用移液枪取5ml含有甲氧咪草烟的培养基于15ml的离心管中，加入乙腈和乙酸，在转速为220rpm、25℃的摇床上振荡30min，加入nacl，直到能明显观察到液体分层为止；然后在4000r/min下离心5min，取出后吸取上层有机液体，通过0.22μm的一次性针筒过滤器进行过滤，注入高效液相色谱测定的棕色瓶中，冷藏待测，为待测的甲醛咪草烟试样。
利用高效液相色谱仪对待测的甲醛咪草烟试样进行检测，培养基采用蛋白胨培养基；
流动相组成：乙腈：乙腈的加入量与培养基体积相等；乙酸水溶液体积比为65：35，乙酸加入量为乙腈含量的0.1%；流量：20μl/min；柱温：30℃；检测波长为254nm，对待测的甲醛咪草烟试样测定。
利用链霉菌降解甲氧咪草烟除草剂；最优降解范围是：链霉菌设置在温度30℃，ph值7.2，链霉菌投加量为10%，除草剂初始浓度10-400mg/l。
目前现有技术中都是通过前期进行大量的筛菌挑选出有利于降解除草剂残留的微生物，但是前期投入成本高、效率低，且适用范围窄，仅针对特定的除草剂残留，但是后期购买菌种成本高昂，农民根本无法承担如此高的降解成本，也不会对菌种进行培养，无法实现低成本高效率的使用，造成现有的微生物降解菌种在实际应用中无法推广，而本发明采用简单高效的方法，在选择出高效菌种，进一步对培养基和降解条件进行深入的研究，降低了降解除草剂残留的成本，有利于后期大范围推广，为治理咪唑啉酮类除草剂污染的农田提供微生物资源和有力的技术支撑。
首先是链霉菌的活化：
将链霉菌(streptomycessp.)jb接种于无机盐固体培养基上，然后在倒置于培养箱中在恒温36℃下培养7d左右。7d后配制无机盐液体培养基，121℃高压灭菌30min后，待培养基温度为40℃时向100ml无机盐液体培养基中加入10mg甲氧咪草烟，并用接种环挑取固体培养基上的链霉菌jb接入其中，在摇床中以30℃、150rpm、黑暗的条件下培养15d。
无机盐配液体培养基是将4gna2hpo4、1.5gkh2po4、1gnh4cl、0.2gmgso4·7h2o、0.02gcacl2、0.03gfeso4·7h2o、1.0gnano3、1ml微量元素，搅拌均匀，充分溶解，蒸馏水定容至1000ml，ph为7.2。
无机盐固体培养基是1l的无机盐液体培养基中加入15g的琼脂煮沸，冷却后，得到固体培养基。
其次筛选链霉菌的最优培养基：
由于不同培养基对甲氧咪草烟的降解速率及效果不同，将菌株jb分别在甲氧咪草烟浓度为100mg/l的msm（无机盐液体培养基）和lb（蛋白胨培养基）中进行培养。发现在msm培养基中，培养30天时，菌株jb对甲氧咪草烟降解率为51.24%。而在lb培养基中，培养4天时，菌株jb对甲氧咪草烟降解率为88.25%。由此可见链霉菌在lb培养基的降解速度明显高于无机盐培养基，而且具有更高的降解效果，所以选用lb液体培养基进行后续高效降解菌降解特性的研究。
蛋白胨培养基是加入10g蛋白胨，5g酵母浸粉和5gnacl，搅拌均匀，充分溶解，蒸馏水定容至1000ml，现用现配。
接着确定甲氧咪草烟的提取方法与检测方法：
提取方法：用移液枪取5ml含有甲氧咪草烟的培养基于15ml的离心管中，加入相同体积的乙腈，同时加入0.1%的乙酸（体积比为65%），在转速为220rpm、25℃的摇床上振荡30min，加入nacl，直到能明显观察到液体分层为止。然后在4000r/min下离心5min，注意取出后不要剧烈震荡。然后用针管吸取上层有机液体，通过0.22μm的一次性针筒过滤器进行过滤，注入高效液相色谱测定的棕色瓶中，冷藏待测。
检测方法：采用高效液相色谱仪，流动相组成：乙腈，乙腈的加入量与培养基体积相等；乙酸水溶液=65:35（v/v），乙酸加入量为乙腈含量的0.1%；流量：20μl/min；柱温：30℃；检测波长为254nm。通过对标准样的测定，发现甲氧咪草烟保留时间在1.62min左右。
最后探究影响链霉菌jb对甲氧咪草烟除草剂的降解效率的因素，其中影响因素包括：设置不同温度：20℃、25℃、30℃、35℃；设定不同的ph值：4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5；设定不同菌株投加量：1%、5%、10%、20%、50%；设定不同的除草剂初始浓度10、50、100、150、200、400mg/l。以下将结合具体实施例对本发明进行进一步的说明，但本发明的保护范围并不受下列实施例的限制。
实施例1：
将链霉菌jb按照10%的接种量接种于90ml的lb培养基中，最终使药剂浓度为100mg/l。在ph7.2，150r/min、温度为20℃、25℃、30℃、35℃条件下摇床中培养4天后，25~30℃是甲氧咪草烟的最佳降解温度。
当温度低于25℃或者高于30℃时，降解率则发生下降，而且在高温环境中，除草剂的降解率要明显低于低温环境中的降解率，这可能和链霉菌的生长情况和菌株对降解除草剂产生作用酶的最适温度有关，所以在用链霉菌进行降解的过程中，要充分考虑到环境温度变化对降解效果的影响，过高或过低都不利于链霉菌对除草剂的降解。
实施例2：
为了解链霉菌在不同ph对甲氧咪草烟的降解性，将链霉菌jb按照10%的接种量接种于90ml的lb培养基中，最终使药剂浓度为100mg/l。在30℃，150r/min摇床中培养4天，发现菌株jb在ph6.5~8.0之间降解率较高，比较适应于中性偏酸的环境中，而在其它ph值范围下降解率较低，ph4.5时，降解率为40%左右；ph8.5时降解率下降至70%以下，是因为过酸或者过碱抑制了酶的活性，从而影响了微生物对农药的降解。
实施例3：
为了解链霉菌jb在不同接种量时对甲氧咪草烟的降解性，将链霉菌按照1%、5%、10%、20%、50%的接种量接种于lb培养基中，最终使药剂浓度为100mg/l。然后在ph7.2，30℃、150r/min摇床中培养2天，发现对于不同的接种量所对应的降解率基本都稳定在87%左右，无显著差异。这是因为培养两天时，培养基中的菌株生长数量趋向于一致，因此降解率基本相接近。实际上，接种量过低或过高时，链霉菌初期的生长可能会受到影响，进而影响链霉菌的降解效率。
实施例4：
为了解链霉菌jb在不同初始浓度对甲氧咪草烟的降解性，将链霉菌按照10%的接种量接种于lb培养基中，最终使药剂浓度分别为10mg/l、50mg/l、100mg/l、150mg/l、200mg/l、400mg/l。然后在ph7.2，30℃、150r/min摇床中培养4天，得出甲氧咪草烟除草剂的降解主要集中在前2天，第2天时，菌株jb对不同浓度的甲氧咪草烟的降解率基本达到了85%，当培养时间超过2.5天后，菌株的生长达到了顶峰（od600=1.7），此时降解菌jb的降解率可以达到95%以上，随着培养的继续，链霉菌的生长幵始减慢，随着甲氧咪草烟对营养物质的消耗，以及代谢后产生的中间代谢产物较为复杂，很可能会对微生物的生长起到一定的抑制作用，造成甲氧咪草烟代谢的阻遏。
总体来看链霉菌jb显示了良好的降解能力。在6种不同浓度范围内，降解效率基本维持在95%以上，并且大部分的降解均出现在前2天，整个降解过程中并没有延迟期的出现。这表明链霉菌jb具有优秀的甲氧咪草烟降解能力，并且可以适应较高浓度农药残留的生态环境。
实施例5：
链霉菌的活化是：将链霉菌(streptomycessp.)jb接种于无机盐固体培养基上，然后在倒置于培养箱中在恒温38℃下培养10d；再配制无机盐液体培养基，高压灭菌后，待培养基温度为小于40℃时向100ml无机盐液体培养基中加入5mg甲氧咪草烟，并用接种环挑取固体培养基上的链霉菌jb接入其中，在摇床中以30℃、150rpm、黑暗的条件下培养20d。
结论：本发明利用以使用范围极其广泛的甲氧咪草烟除草剂为研究对象，对甲氧咪草烟的降解菌jb进行降解特性研究。分析了各种现阶段的前处理技术以及检测技术，经过大量实验确定了检测方法。以链霉菌(streptomycessp.)jb为研究对象，测定了菌株jb在不同环境因子下降解除草剂的效果，通过除草剂降解率的检测可知该发明可有效的修复除草剂污染，为未来对土壤施加链霉菌来加速除草剂的降解，减少其长期残留对后茬作物或非标靶生物的药害奠定基础。