鲜果汁磁性纳米纤维保鲜盒及制备方法与流程

本发明属于食品保鲜材料领域，具体涉及fe3o4/壳聚糖磁性纳米纤维保鲜盒的制备方法。

背景技术：

食源性病原菌是导致食品安全危害最主要因素，据统计，40％以上的食物中毒由细菌引发，特别是近年来鲜榨果汁食品安全隐患不容忽视，对我国150家餐饮店鲜榨果汁抽检调查，发现病原菌合格率仅25％，亟待研发新型抗菌保鲜技术，开辟冷杀菌产业新领域。

目前，果蔬汁物理杀菌技术主要为60-80℃/30-60min巴斯灭菌、121℃/400-600mpa/30min高温高压灭菌、130-150℃/2-8s超高温顺时灭菌以及无菌过滤、辐照、紫外、超声、微波、高压脉冲电场和等离子等方法，但极易导致果蔬汁褐变、异味、营养损失或灭菌不彻底。而果蔬汁保鲜的化学方法主要是直接添加防腐剂，如广泛使用的化学制剂-苯甲酸钠，那他霉素等，生化制剂-壳聚糖、多肽等，以及微生物拮抗菌—酵母、细菌等，这类抗菌剂难免产生残留二次污染，或产生异味，干扰食品体系，相信每个目睹杀菌剂添加过程的消费者都会产生心理障碍，但又缺乏有效的取代技术。

传统抗菌包装技术,主要是将抗菌活性成分添加到成膜基材，利用熔融挤出或涂布法制备膜材料，如将特克多(tbz)、纳米银/钛/锌等，添加到塑料或纸浆中，这种熔融挤出或涂布制备的膜或纸载体空间位阻效应明显，极大限制抗菌成分与病原菌界面反应，抗菌效率低。将不耐高温的精油等挥发性抗菌材料，或非挥发性咪唑类、噻唑类、季铵盐类、双呱类等混合涂布在塑料膜或纸质表面,稳定性亟待提高，使用时易脱落或溶解，表面被动接触性杀菌效果差，至今难以商业化应用。

为了满足鲜果汁保鲜包装需求，中国专利cn106835504a公开了纳米纤维抗菌膜及其制备方法和用途，将负载d-氨基酸/肉桂精油包裹在壳聚糖纳米粒子中制成纤维膜，有效抑制豆制品上金黄色葡萄球菌生物膜形成；中国专利cn106400310a公开了具有多孔结构的纳米纤维抗菌果蔬保鲜膜及制备方法与应用，通过添加苦槛蓝超临界萃取物，与壳聚糖、聚乙烯醇纳米二氧化钛混合电纺，得到具有多孔结构的纳米纤维抗菌果蔬保鲜膜。此类专利虽然能够达到长期抑菌，延长保质期的效果，但材料其中的添加物会进入食品中造成潜在的危害，抑菌成分本身也容易变性失去抗菌效果。

本发明将壳聚糖与fe3o4共混制备鲜果汁磁性纳米纤维保鲜包装材料，壳聚糖复合磁性超微粒子对病原菌吸附特性以及铁载体介导fe³⁺跨膜转运系统调控抗菌，目前还未有报道。

技术实现要素：

本发明提的目的在克服现有技术的不足之处，提供保鲜效果好、保鲜期长的鲜果汁磁性纳米纤维保鲜盒及制备方法。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种鲜果汁磁性纳米纤维保鲜盒制备方法，步骤如下:

⑴fe3o4的制备方法：

将一定量的二价铁盐和三价铁盐混合溶液加入到三口烧瓶中，滴液漏斗中加入沉淀剂nh3·h2o，在氮气氛下将氨水溶液加到反应体系中，使体系的ph≥10，剧烈搅拌，水浴恒温，搅拌30min后结束反应，用蒸馏水反复洗涤直至中性，倾去上层清液，在60℃下真空干燥后，研磨即得纳米fe3o4粒；

⑵fe3o4/壳聚糖复合流体的制备方法：

①称取制备的fe3o4纳米粒子溶于冰醋酸；

②将冰醋酸水溶液精确称量放入500ml塑料烧杯中，在室温下，使用旋浆式搅拌器将壳聚糖缓慢溶解在冰醋酸水溶液中，快速倒入上步液体中，在搅拌器搅拌过程中溶解均匀，即成fe3o4/壳聚糖复合流体；

⑶以获得的fe3o4/壳聚糖复合流体利用静电纺丝方法制备致病菌诱捕过滤抗菌膜；

⑷保鲜盒制备：

采用涂塑纸盒在成型-弃填-封合包装机上进行包装。将附有壳聚糖磁性纳米纤维的铝箔作为鲜果汁包装内层，制备250ml、500ml的鲜果汁保鲜盒。

而且，静电纺丝装置为yfsp-t(m3t2qg)，10ml注射器安装在静电纺丝装置卡槽处，选用不粘型铝箔纸能达到将纤维膜更好分离铝箔的效果，实验中滚筒式收集器控制在80r/min，推柱速率为1mm/min，电压13-18kv，进样针至收集器垂直距离为10-20cm，连接注射器的不锈钢针头外观尺寸为0.7mm×32mm，直径0.390mm与注射器相连，在不锈钢针头处连接高压电场为实验提供高压电源，静电纺丝装置环境内温度50℃，连续静电纺丝6h。

本发明与现有技术相比的优点和积极效果如下：

1、本发明首次研发电纺磁性壳聚糖纤维材料，利用天然抗菌成分壳聚糖为纤维骨架、纤维直径达纳米级的三维网状结构，具有低阻力、高渗透性的多孔载体界面特性。

2、本发明中壳聚糖由宏观颗粒转变为超微纳米粒子，具有高效抗菌的小尺寸“构-效”特性，能同时发挥反应界面与抗菌剂活性的双向增强优势。

3、本发明中壳聚糖纳米纤维中包埋的fe3o4磁性纳米粒子具有超顺磁性，相邻电子之间存在很强的“交换耦合”，具有吸附常见微生物，发生力学转移作用，实现包装体系的病原菌由被动接触杀菌变为主动诱捕策略。

4、本发明通过铁载体介导fe³⁺跨膜转运系统，进入细胞内部，释放壳聚糖抗菌剂，干扰fe³⁺的吸收以及fe³⁺参与电子链传递等一系列系统代谢活动，引发微生物细胞代谢紊乱，达到杀菌效果，从而为解决鲜榨果蔬汁零添加冷杀菌产业难题提供新的解决方法。

附图说明

图1为抗菌膜中壳聚糖释放效果

具体实施方式

下面通过具体实施例对本申请作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能依次限定本申请的保护范围。

本发明针对鲜果汁热杀菌褐变失味、超高压冷杀菌投资大、直接添加杀菌剂二次污染和传统抗菌包装效果差等产业难题，本发明使用壳聚糖作为成纤基体，依据病原菌趋磁特性，以沉淀法制备fe3o4磁性粒子，再进一步电纺制备壳聚糖磁性纳米纤维膜，并将其用于鲜果汁保鲜盒的制备，将高分子材料学与食品科学相结合，为鲜果汁超高压冷抗菌保鲜包装提供了新的方法。

本发明采用共沉淀法利用fe²⁺+2fe³⁺+8oh^-→fe3o4↓+4h2o原理制备fe3o4纳米磁性粒子，然后通过共混包埋法技术制备fe3o4/壳聚糖复合流体，通过静电纺丝技术制备成纳米纤维膜，提高壳聚糖纳米粒子的稳定性，达到长效抗菌与高效利用的目的。

本发明涉及鲜果汁磁性纳米纤维保鲜盒制备方法，步骤如下:

包括:壳聚糖的选择和溶剂的配制、fe3o4纳米磁性粒子制备、复合电纺前驱体溶液配制、静电纺丝的制备、静电纺丝、获得纤维膜并制成保鲜盒。

具体包括以下步骤:

⑴fe3o4的制备方法：

将一定量的二价铁盐(feso4·7h2o)和三价铁盐(fecl3·6h2o)混合溶液，加入到三口烧瓶中，滴液漏斗中加入一定浓度的沉淀剂nh3·h2o，在氮气氛下将氨水溶液加到反应体系中，使体系的ph≥10，剧烈搅拌，水浴恒温。搅拌30min后结束反应，用蒸馏水反复洗涤直至中性，倾去上层清液，在60℃下真空干燥后，研磨即得纳米fe3o4粒子。

二价铁盐(feso4·7h2o)和三价铁盐(fecl3·6h2o)的浓度可以自己调整，推荐使用摩尔比例为1:2。

⑵fe3o4/壳聚糖复合流体的制备方法：

本发明采用共混包埋法将具有良好水溶性和生物相容性的壳聚糖包覆于磁性粒子表面，共混包埋法是指将磁性超微颗粒均匀地分散在亲水性高分子水溶液中，主要是通过范德华力、氢键、配位键和共价键等作用将水溶性的高分子物质缠绕在无机磁性颗粒表面，形成聚合物包被的核-壳式磁性高分子微球。

①称取制备的fe3o4纳米粒子溶于约2％的冰醋酸，

②将2wt％冰醋酸精确称量放入500ml塑料烧杯中，在室温下，使用旋浆式搅拌器将壳聚糖缓慢溶解在2％冰醋酸水溶液中，快速倒入上步液体中，在搅拌器搅拌过程中溶解均匀，即成fe3o4/壳聚糖复合流体。

⑶静电纺丝技术制备致病菌诱捕过滤抗菌膜：

静电纺丝装置为yfsp-t(m3t2qg)，10ml注射器安装在静电纺丝装置卡槽处，选用不粘型铝箔纸能达到将纤维膜更好分离铝箔的效果，实验中滚筒式收集器控制在80r/min，推柱速率为1mm/min，电压13-18kv，进样针至收集器垂直距离为10-20cm，连接注射器的不锈钢针头外观尺寸为0.7mm×32mm，直径0.390mm与注射器相连，在不锈钢针头处连接高压电场为实验提供高压电源，静电纺丝装置环境内温度50℃，连续静电纺丝6h。

⑷保鲜盒制备：

采用涂塑纸盒(纸-铝箔-聚乙烯复合材料)在成型-弃填-封合包装机上进行包装。将附有壳聚糖磁性纳米纤维的铝箔作为鲜果汁包装内层，制备250ml、500ml的鲜果汁保鲜盒。

电纺膜接触60分钟后的抗菌效果

大肠杆菌菌液原浓度：6.80×10⁵cfu/ml。

假单胞菌菌液原浓度：5.44×10⁵cfu/ml。

金黄色葡萄球菌菌液原浓度：5.20×10⁵cfu/ml。

1.电纺壳聚糖磁性纳米纤维抗菌膜杀菌机理

本发明以壳聚糖为抗菌剂，电纺磁性壳聚糖纳米纤维将形成壳聚糖包埋的壳聚糖磁性复合物，电纺壳聚糖磁性纳米纤维与铁载体介导的fe³⁺主动转运系统一定存在着某种程度复杂的耦合关系，通过铁载体介导fe³⁺跨膜转运系统，进入细胞内部，释放壳聚糖抗菌剂，同时干扰fe³⁺的吸收以及fe³⁺参与电子链传递等一系列系统代谢活动，引发微生物细胞代谢紊乱。

发明发现单一添加fe3o4纳米粒子对吸附病原菌ros影响，结果表明病原菌ros生成量显著增加，磁性诱导ros自由基反应增强。然而这些发明只是fe3o4对微生物作用产生的结果，并不是引起现象产生的本质原因。

ros产生遵循fenton反应，该反应存在于所有好氧微生物中，反应机制如下：

fe³⁺+h2o2＝2fe²⁺+o2·+oh^-

fe²⁺+h2o2＝fe³⁺+ho2·+oh·

由该反应机制可以看出，fe³⁺是直接参与ros反应的底物，因此，我们推断铁载体介导的fe³⁺跨膜转运系统与细胞膜上ros反应密切相关，在这种情况下，铁载体介导的fe³⁺主动转运系统为微生物供给的fe³⁺，很可能直接参与自由基的生成反应，磁性壳聚糖纳米纤维干预铁载体介导的fe³⁺主动转运系统，很大程度是ros反应增强的直接诱因，在ros反应体系中发挥重要的作用。

电纺壳聚糖磁性纳米纤维材料，能形成以天然抗菌成分壳聚糖为纤维骨架、纤维直径达纳米级的三维网状结构，不仅具有低阻力、高渗透性的多孔载体界面特性，而且壳聚糖由宏观颗粒转变为超微纳米粒子，具有高效抗菌的小尺寸“构-效”特性，能同时发挥反应界面与抗菌剂活性的双向增强优势。壳聚糖纳米纤维中包埋的fe3o4磁性纳米粒子具有超顺磁性(sp)，相邻电子之间存在很强的“交换耦合”，具有吸附常见微生物，发生力学转移作用，实现包装体系的病原菌由被动接触杀菌变为主动诱捕策略。现阶段，几乎所有涉及壳聚糖杀菌机理的发明都是以宏观体系的壳聚糖单一分子作为发明对象，壳聚糖纳米粒子与壳聚糖宏观颗粒作用机制作用差异亟待深入发明，特别是磁性fe3o4纳米粒子靶向介导“特洛伊木马”杀菌作用分子机理亟待明确。

本项目将从细胞水平阐明fe3o4纳米粒子协同壳聚糖超微功能粒子抗菌机理，对实现静态包装体系内病原菌“主动识别”、高效杀菌具有非常重要的意义。

2.fe3o4的制备原理

采用共沉淀法，即利用fe²⁺+2fe³⁺+8oh^-→fe3o4↓+4h2o反应，制备fe3o4纳米磁性粒子，再采用共混包埋法技术制备fe3o4/壳聚糖纺丝液。通过分析壳聚糖流体性质可知，特定溶剂溶解后的壳聚糖流体带正电荷，能够通过静电或氢键为主导，实现对磁性fe3o4粒子包埋形成稳定的分散胶体悬浮液，从而使复合体系呈现均匀分散体系。

3.电纺膜吸附特性

为实现静态抗菌包装体系内病原菌由被动接触杀菌变为主动诱捕策略，抗菌材料第一要素是实现对低浓度、高风险微生物的分离。由前文介绍的fe3o4磁性粒子广谱吸附致病菌作用机理可知，fe3o4的粒径对吸附效果起决定性影响。目前fe3o4磁性纳米粒子发明多以沉淀法制备fe3o4纳米磁性粒子为发明对象，但是，在本发明中fe3o4将经历电纺静电场高速剪切拉伸运动的2次成型，很有可能改变fe3o4纳米粒子磁畴结构，呈现特异吸附特性；在电纺过程中，纳米纤维的层层堆积将形成孔径介于纳米与微米孔径的微孔三维网状结构，具有更加独特的低阻力、高渗透的微孔吸附特性,此外，其他影响吸附动力的因素例如温度、壳聚糖磁性纳米纤维组分浓度、介质成分、病原菌扩散系数、ph均对吸附作用有重要调控作用。

基于此，本发明将以鲜榨果汁优势致病菌革兰氏阳性致病菌单增李斯特菌、革兰氏阴性致病菌大肠埃希氏菌、果蔬汁优势腐败菌酵母菌为典型病原菌，开展磁性壳聚糖纳米纤维对3种病原菌选择吸附差异性、磁性多孔纳米纤维界面不同组分、浓度、ph、温度的吸附动力学，25℃吸附热力学发明，构建磁性壳聚糖微孔纤维热力学吸附热力学数学模型和吸附动力学模型，全面分析磁性壳聚糖纳阐明磁性壳聚糖纳米纤维界面诱捕吸附效率和吸附差异，明确最佳构-效关系。进一步通过对比吸附前后zeta电位及亲和作用力傅里叶红外图谱，深入发明纤维中fe3o4纳米粒子与病原菌细胞相互作用，明确壳聚糖磁性纳米纤维“诱捕”吸附机理。

4.协同抗菌分子机制

细菌体内铁载体达500多种，其中异羟肟酸型铁载体在大肠杆菌中的吸收是迄今为止发明表征较好的细菌吸铁系统，特异性细菌自身周质空间转运蛋白fhud可以绑定和穿梭各种异羟肟酸型铁载体，是初级主动转运蛋白转运系统重要组成。超顺磁fe3o4强磁场与铁载体靶向吸附将介导铁载体与特异性受体蛋白结合反应，一方面，极大程度引起fhud蛋白二级结构域构象的重大变化。另一方面，铁载体参与的fe³⁺摄取过程很可能将“搬运”的fe³⁺作为底物，直接参与ros自由基的生成反应，产生更多活性氧自由基o2^-·，造成细胞膜过氧化伤害，进而影响细胞膜完整性、流动性等细胞超微结构的变化。一方面，本发明以肠致病性大肠杆菌作为致病菌代表，将分析大肠杆菌细胞内不同fhud-异羟肟酸型铁载体及其潜在磁性壳聚糖复合物的二级结构差异，进行分子动力学模拟，预测潜在复合物相互作用；另一方面检测活性氧自由基o2^-·动态变化规律，监测细胞膜结构、膜流动性超微结构变化，明确壳聚糖磁性纳米纤维与造成活性氧自由基o2^-·伤害互作关系。

5.复合流体形成

由于壳聚糖分子表面富含氨基和羟基,fe原子的3d空轨道与氨基的n原子上的孤对电子或羟基的o原子作用形成配位键，使得该复合过程得以进行，最终壳聚糖将fe3o4磁性纳米粒子包裹在内，形成壳聚糖/fe3o4复合纳米流体。