专利名称：大脑皮层局灶性缺血再灌注损伤动物模型的制作方法
技术领域：
本发明属于医疗评价、检测技术领域，具体涉及一种大脑皮层局灶性缺血及再灌注损伤动物模型的制作方法。
背景技术：
脑中风是目前全世界人类的第三大致死病，并有逐年增加的趋势。临床脑中风有三个特点1、临床上约80％病例的梗塞体积较小(28～80mm3)，约占同侧大脑半球体积的4.5～14％；其余20％病例为恶性的或致命的梗塞，其梗塞体积可达同侧大脑半球体积的39％以上。2、缺血后有明显的再灌注；3、损伤后的脑功能重建。
目前至少有10种啮齿类局部中风模型被用于实验研究，其中脑缺血再灌注损伤动物模型是在脑梗塞模型的基础上改进的，该模型的脑损伤在单纯脑缺血梗死基础上增加了血流再灌注，可进一步造成缺血区域的损伤，为研究脑缺血再灌注损伤的病理机制提供了一个很好的模型，也将成为开发新的改善再灌注损伤的药物的有力工具。大多数的局灶性脑缺血模型如MCAO模型，采用阻塞大脑中动脉的形式，在同侧的前脑形成大小不确定的病变区域，梗塞的范围近似于人类恶性的和致命的梗塞；光化学的方法虽然可建立定位准确的皮层梗塞模型，但是此模型对血管系统的损害较大，因而不适合研究缺血再灌注后的功能恢复。Wei等通过永久性地结扎供应大鼠桶状皮层的大脑中动脉的分支而建立的小中风(Ministroke)模型，其优点在于可以控制缺血病变在一个较小的范围和确定的区域，其缺点在于无法确定缺血后的再灌注，手术难度和风险较大。Shigeru Watanabe等采用铜环局部缓慢压迫皮质的方法建立的大脑局灶性皮质缺血模型，虽然也可以得到确定的缺血灶和再灌注，但是不利于实时观察缺血病变灶的范围和空间分布。而且上述两种方法为了达到较好的脑缺血效果都需结扎同侧颈总动脉，使得动物的手术创伤增大和制作模型的难度加大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大脑皮层局灶性缺血再灌注损伤动物模型的制作方法，该方法可以在动物大脑皮层特定区域形成梗死灶，并能在同一区域便利地实现缺血再灌注。
本发明提供的一种大脑皮层局灶性缺血再灌注损伤动物模型的制作方法，包括以下步骤(1)麻醉动物，暴露和确立要建立缺血再灌注的皮层区域；(2)在显微镜下将直径为50-1000微米的细线制成的线段或者闭合环，线段或者闭合环的形状和大小与上述皮层区域相匹配，再将线段或者闭合环放置在上述准备建立缺血再灌注的皮层区域，在此皮层区域的动脉供应支与细线相交的位置，用带线缝合针将脑膜、动脉供应支及细线一起结扎；(3)采用常规组织化学方法观察脑梗塞的位置和体积以及皮层细胞的病理变化，或者利用行为学实验评价功能缺损水平。
如需研究脑缺血后的再灌注损伤和保护机制就需进行下一步的缺血后再灌注处理，制作大脑皮层局灶性缺血再灌注模型，为此在上述步骤(2)和(3)之间，可以进行下述步骤在显微镜下切断细线上的手术线结，取下细线和切断后的线结，进行缺血后的再灌注。
本发明方法可用于研究脑缺血的损伤机理及损伤后的行为、特定的功能和结构的可塑性改变，并可用于评估不同药物和治疗手段对脑缺血以及缺血后功能恢复的影响及其影响的机制。采用本发明方法所制作的模型与其他用于中风康复研究的动物模型相比，简单、安全有效地结合了局部微动脉血管结扎和皮层局部压迫的双重作用，不需要通过夹闭和松开颈总动脉就可以形成稳定的大脑皮层缺血和再灌注病灶。这种模型可以提供良好的观察视野，有利于实时高分辨地观测缺血及其再灌注前后的血流血氧等参数的动态变化过程。
图1为刺激大鼠对侧的胡须时，采用内源信号光学成像技术所确定激活相应的桶状皮层区域图；a为刺激大鼠胡须时桶状皮层的空间激活模式；b为最大激活区(方框选取处)光强相对幅度的时间变化过程，刺激时程为2-4s。
图2为皮层脑膜、血管与圆环或一段细线结扎示意图，虚线框内分别表示圆环上四处虚线处所获得的剖面图，其中，A硬脑膜，B软脑膜，C小动脉，D缝合线，E大脑中动脉，F锋利的刀片，G细线。
图3为皮层成像区域的白光图，其中a为结扎前的皮层白光图；b为结扎后的皮层白光图；c为再灌注后即时的皮层白光图；d为再灌注后24小时的皮层白光图。
图4为激光散斑时间衬比成像所得的皮层区域血流相对速度的分布图，其中a为结扎前桶状皮层区域的血流相对速度分布图；b为结扎后的血流相对速度的变化；c为再灌注后即时的皮层相对流速分布图；d为再灌注后24小时的皮层相对流速分布图。
图5为显示TTC染色结果图，其中a为左侧大脑皮层缺血灶； b为a中虚线对应位置的大脑冠状切片，箭头所指为皮层梗死区域。
具体实施例方式
本发明方法通过用带线缝合针将直径为50微米-1000微米的细线制成线段或者其他闭合形状(如圆环)连着硬脑膜和脑膜下的动脉一起结扎，以此压迫和阻塞供应此皮层区域的动脉。根据不同的实验目的，可以任意选择压迫皮层的特定位置如桶状皮层、运动皮层、前肢体感皮层和后肢体感皮层等。选择线环的尺寸或者细线截面的形状大小就可控制缺血区域的体积大小和缺血程度。缺血一段时间后在显微镜下用锋利的刀片(如剃须刀片)切断结扎的手术线结，就可以造成缺血后再灌注损伤。
本发明方法的具体步骤包括
(1)麻醉动物，暴露和确立要建立缺血再灌注的皮层区域先根据解剖图谱开颅窗暴露大脑皮层，建立皮层观测区域，然后确定特定的功能区域来建立缺血再灌注的皮层区域，如采用内源信号光学成像方法，电生理记录，解剖图谱等；(2)阻塞上述皮层区域的动脉供应支在显微镜下将直径为50-1000微米的细线制成的线段或者闭合环放置在上述准备建立缺血再灌注的皮层区域，根据该皮层区域的大小来确定细线制成的线段或者闭合环的形状和大小。在此皮层区域的动脉供应支与细线相交的位置，用带线缝合针将脑膜、MCA分支及细线一起结扎(见图2)。
(3)采用组织化学方法观察脑梗塞的位置和体积以及皮层细胞的病理变化，或者利用行为学实验评价功能缺损水平。
步骤(1)-(3)制作的大脑皮层局灶性缺血模型可用于研究脑缺血的损伤和保护机制，如需研究脑缺血后的再灌注的损伤和保护就需进行下一步的缺血后的再灌注处理，制作大脑皮层局灶性缺血再灌注模型。
在上述步骤(2)和(3)之间可以进行缺血后的再灌注皮层局部缺血处理完成后，在显微镜下用刀片切断细线上的手术线结，取下细线和切断后的线结，进行缺血后的再灌注。
实例1(大脑桶状皮层缺血再灌注模型)(1)麻醉大鼠和暴露和确立桶状皮层区域2％水合氯醛+10％乌拉坦(按1ml/100g，，腹腔注射)麻醉实验大鼠，实验中根据需要给予补充适量的麻醉剂。
将大鼠固定在脑立体定位仪上，切开头顶正中的皮肤，并将皮肤分离至的眼睛和耳朵上界的连线，钝性分离皮下的筋膜，暴露出覆盖在颞骨上的颞肌，向下分离颞肌至的眼睛和耳朵上界的连线，并剪去部分颞肌。在分离肌肉的过程中如有出血较多，用电烙铁止血。
用牙科钻小心打磨顶骨与颞骨之间的骨嵴至平坦，然后打磨骨嵴上方的顶骨和其下方的颞骨四周至很薄很软，打磨颅骨的过程中经常用冰冻的生理盐水冷却牙科钻头。用镊子的尖端撬起并掀去这部分的颅骨，产生约8mm×6mm大小的颅窗，暴露硬脑膜及其下的血管。
大鼠脸上的胡须排列成行和列，每根胡须对应对侧桶状皮层的一个特定区域，而桶状皮层是由大脑中动脉(middle cerebral artery，MCA)的小分支来供血，利用内源信号光学成像方法可确定刺激大鼠胡须时被激活的桶状皮层区域。用本实验室自行设计的刺激器刺激胡须，刺激电极钩住动物右侧的C3胡须根部，参考电极插在刺激电极邻近的皮下，刺激胡须条件刺激频率为5HZ；刺激幅度为2V；刺激波宽为1ms，刺激间隔时间为2s；刺激持续时间为2s。
在刺激的同时进行同步进行内源信号光学成像，为记录内源光学信号，选取波长550nm(Δλ＝20nm)的光源对观察区域加以照明，导光束从两侧呈一定倾斜角度(约45°)照射，反射光由连接在体视显微镜(Olympus SZ60，Japan)上的12bit快速CCD相机(PixelFly VGA，PCO，Germany)获取，成像条件放大倍数1×16/20＝0.8Binning2×2240×320；曝光时间20ms；在线平均2；成像帧数250；成像时间10s。将获取的图象保存到计算机。
在Matlab计算平台下对实验中的采集的图像序列进行分析处理，确定激活的桶状皮层区域。
(2)将供应桶状皮层的动脉进行阻塞实验材料11-0的带线缝合针、14cm显微持针钳、显微手术镊、显微手术剪、Olymbus显微镜、直径0.168～0.25mm的尼龙线制成的直径约3～4mm的圆环、激光散斑衬比成像系统。
先拍摄皮层白光图确定皮层血管的解剖形态(见图3a)，然后用激光散斑衬比成像记录结扎前桶状皮层区域的血流相对速度分布图(见图4a)。氦氖激光器(λ＝632.8nm，3mW)发出的光束直接耦合到直径为8mm的光纤束，均匀地照射在待测的血管区域，通过体视显微镜(Olympus SZ60，Japan)上的12bit快速CCD相机(PixelFly VGA，PCO，Germany)对该区域进行成像，成像条件曝光时间20ms，成像面积6mm×8mm，共成像10分钟，每分钟30帧，共计300帧。在Matlab计算平台下对实验中的采集的图像序列进行分析处理。
在显微镜下将尼龙线制成的直径约3～4mm的圆环放置在已确定的桶状皮层区域，在大脑中动脉(MCA)分支的近端与尼龙圆环相切的位置，用14cm显微持针钳夹持着11-0的带线缝合针将脑膜、MCA分支的近端及尼龙圆环一起结扎；(见图2)。并立即拍摄白光图观测血管形态变化和结扎的位置(见图3b，结扎的动脉血管直径变小)，然后进行激光散斑衬比成像，成像条件及图像处理同前，以观察结扎后血流相对速度的变化(见图4b，圆环内以及周边部分皮层区域相对血流速度明显变小，越亮的区域表示相对流速越大，反之越暗的区域相对流速越小)。
(3)缺血后的再灌注结扎后2小时在显微镜下用锋利的刀片(如剃须刀片或手术刀片)切断环上的手术线结，在缺血再灌注后即时和再灌注后24小时继续拍摄白光图监测血管形态的变化(见图3c和3d，3c为再灌注后即时的白光图可见结扎过的动脉直径变大，3d为再灌注后24小时的白光图可见观察区域的血管直径都变大)，然后进行激光散斑时间衬比成像，成像条件及图像处理同前，以观察再灌注后血流相对速度的变化(见图4c和4d，4c为再灌注后即时的皮层相对流速分布图，可见结扎过的动脉相对流速逐渐恢复到结扎前水平；4d为再灌注后24小时的皮层相对流速分布图，可见皮层缺血再灌注区域的相对流速显著增高)。
(4)TTC染色将大鼠断头取脑，剔去硬脑膜，用生理盐水冲洗脑表面，用0.5％triphenyltetrazolium chloride(TTC)，37℃染色30min，因TTC能与活细胞的线粒体中的脱氢酶反应而使细胞呈现红色，缺血梗死的细胞的线粒体中的脱氢酶已经失活而呈现白色，因此TTC染色能确定脑梗死的位置和体积。如图5所示，图5a显示左侧大脑皮层有白色直径约3～4mm的缺血灶(圆圈内区域)；图5b为5a中虚线对应位置的大脑冠状切片，箭头所指为皮层梗死区域。
实例2(大脑后肢躯体感受皮层缺血再灌注模型)(1)麻醉大鼠和暴露和确立后肢躯体感受皮层所在的区域
2％水合氯醛+10％乌拉坦(按1ml/100g，，腹腔注射)麻醉实验大鼠，实验中根据需要给予补充适量的麻醉剂。
将大鼠固定在脑立体定位仪上，切开头顶正中的皮肤，并将皮肤分离至的眼睛和耳朵上界的连线，钝性分离皮下的筋膜，暴露出覆盖在颞骨上的颞肌，向下分离颞肌至的眼睛和耳朵上界的连线，并剪去部分颞肌。
用牙科钻小心打磨顶骨与颞骨之间的骨嵴至平坦，然后打磨骨嵴上方的顶骨和其下方的颞骨四周至很薄很软，打磨颅骨的过程中经常用冰冻的生理盐水冷却牙科钻头。用镊子的尖端撬起并掀去这部分的颅骨，产生约8mm×6mm大小的颅窗，暴露硬脑膜及其下的血管。
根据解剖图谱确定后肢躯体感受皮层所在的区域。
(2)将供应后肢躯体感受皮层的动脉进行阻塞先用激光散斑衬比成像记录结扎前后肢躯体感受皮层区域的血流相对速度。氦氖激光器(λ＝632.8nm，3mW)发出的光束直接耦合到直径为8mm的光纤束，均匀地照射在待测的血管区域，通过体视显微镜(Olympus SZ60，Japan)上的12bit快速CCD相机(PixelFly VGA，PCO，Germany)对该区域进行成像，成像条件曝光时间20ms，成像面积6mm×8mm，共成像10分钟，每分钟30帧，共计300帧。在Matlab计算平台下对实验中的采集的图像序列进行分析处理。
在显微镜下将一小段尼龙线放置在已确定的后肢躯体感受皮层区域的MCA分支的动脉上，用14cm显微持针钳夹持着11-0的带线缝合针将硬脑膜、MCA分支动脉及小段尼龙线一起结扎；并立即进行激光散斑时间衬比成像，成像条件及图像处理同前。以观察结扎后血流相对速度的变化。
(3)缺血后的再灌注结扎后2小时在显微镜下用锋利的刀片(如剃须刀片或手术刀片)切断环上的手术线结，进行缺血后的再灌注，再灌注立即和再灌注24小时、48小时、72小时后激光散斑衬比成像，成像条件及图像处理同前。观察后血流相对速度的变化，了解再灌注的损害程度。
(4)H&E.染色将大鼠麻醉，用4％多聚甲醛磷酸缓冲液经心脏灌注固定后，断头取脑，用石蜡进行包埋、切片。H&E.染色，光学显微镜下观察脑梗死的区域、体积。
(5)行为学观察缺血再灌注3天后观察动物的行为反应，如倾倒，转圈等。
实例3(大脑桶状皮层缺血模型)(1)麻醉大鼠和暴露和确立桶状皮层区域2％水合氯醛+10％乌拉坦(按1ml/100g，，腹腔注射)麻醉实验大鼠，实验中根据需要给予补充适量的麻醉剂。
将大鼠固定在脑立体定位仪上，切开头顶正中的皮肤，并将皮肤分离至的眼睛和耳朵上界的连线，钝性分离皮下的筋膜，暴露出覆盖在颞骨上的颞肌，向下分离颞肌至的眼睛和耳朵上界的连线，并剪去部分颞肌。在分离肌肉的过程中如有出血较多，用电烙铁止血。
用牙科钻小心打磨顶骨与颞骨之间的骨嵴至平坦，然后打磨骨嵴上方的顶骨和其下方的颞骨四周至很薄很软，打磨颅骨的过程中经常用冰冻的生理盐水冷却牙科钻头。用镊子的尖端撬起并掀去这部分的颅骨，产生约8mm×6mm大小的颅窗，暴露硬脑膜及其下的血管。
大鼠脸上的胡须排列成行和列，每根胡须对应对侧桶状皮层的一个特定区域，而桶状皮层是由大脑中动脉(middle cerebral artery，MCA)的小分支来供血，利用内源信号光学成像方法可确定刺激大鼠胡须时被激活的桶状皮层区域。用本实验室自行设计的刺激器刺激胡须，刺激电极钩住动物右侧的C3胡须根部，参考电极插在刺激电极邻近的皮下，刺激胡须条件刺激频率为5HZ；刺激幅度为2V；刺激波宽为1ms，刺激间隔时间为2s；刺激持续时间为2s。
在刺激的同时进行同步进行内源信号光学成像，为记录内源光学信号，选取波长550nm(Δλ＝20nm)的光源对观察区域加以照明，导光束从两侧呈一定倾斜角度(约45°)照射，反射光由连接在体视显微镜(Olympus SZ60，Japan)上的12bit快速CCD相机(PixelFly VGA，PCO，Germany)获取，成像条件放大倍数1×16/20＝0.8 Binning2×2 240×320；曝光时间20ms；在线平均2；成像帧数250；成像时间10s。将获取的图象保存到计算机。
在Matlab计算平台下对实验中的采集的图像序列进行分析处理，确定激活的桶状皮层区域。
(2)将供应桶状皮层的动脉进行阻塞实验材料11-0的带线缝合针、14cm显微持针钳、显微手术镊、显微手术剪、Olymbus显微镜、直径0.168～0.25mm的尼龙线制成的直径约3～4mm的圆环、激光散斑衬比成像系统。
先拍摄皮层白光图确定皮层血管的解剖形态，然后用激光散斑衬比成像记录结扎前桶状皮层区域的血流相对速度分布图。氦氖激光器(λ＝632.8nm，3mW)发出的光束直接耦合到直径为8mm的光纤束，均匀地照射在待测的血管区域，通过体视显微镜(Olympus SZ60，Japan)上的12bit快速CCD相机(PixelFly VGA，PCO，Germany)对该区域进行成像，成像条件曝光时间20ms，成像面积6mm×8mm，共成像10分钟，每分钟30帧，共计300帧。在Matlab计算平台下对实验中的采集的图像序列进行分析处理。
在显微镜下将尼龙线制成的直径约3～4mm的圆环放置在已确定的桶状皮层区域，在大脑中动脉(MCA)分支的近端与尼龙圆环相切的位置，用14cm显微持针钳夹持着11-0的带线缝合针将脑膜、MCA分支的近端及尼龙圆环一起结扎(见图2)，并立即拍摄白光图观测血管形态变化和结扎的位置(见图3b，结扎的动脉血管直径变小)，然后进行激光散斑衬比成像，成像条件及图像处理同前，以观察结扎后血流相对速度的变化。
(4)TTC染色将大鼠断头取脑，剔去硬脑膜，用生理盐水冲洗脑表面，用0.5％triphenyltetrazolium chloride(TTC)，37℃染色30min，因TTC能与活细胞的线粒体中的脱氢酶反应而使细胞呈现红色，缺血梗死的细胞的线粒体中的脱氢酶已经失活而呈现白色，因此TTC染色能确定脑梗死的位置和体积。
权利要求
1.一种大脑皮层局灶性缺血再灌注损伤动物模型的制作方法，其步骤包括(1)麻醉动物，暴露和确立要建立缺血再灌注的皮层区域；(2)在显微镜下将直径为50-1000微米的细线制成的线段或者闭合环，线段或者闭合环的形状和大小与上述皮层区域相匹配，再将线段或者闭合环放置在上述准备建立缺血再灌注的皮层区域，在此皮层区域的动脉供应支与细线相交的位置，用带线缝合针将脑膜、动脉供应支及细线一起结扎；(3)采用组织化学方法观察脑梗塞的位置和体积以及皮层细胞的病理变化，或者利用行为学实验评价功能缺损水平。
2.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于在步骤(2)与(3)之间进行下述步骤缺血处理完成后，在显微镜下切断细线上的手术线结，取下细线和切断后的线结，进行缺血后的再灌注；
全文摘要
本发明公开了一种大脑皮层局灶性缺血及再灌注损伤动物模型的制作方法，包括①麻醉动物，暴露和确立要建立缺血再灌注的皮层区域；②在显微镜下将直径为50－1000微米的细线制成的线段或者闭合环，并放置在上述准备建立缺血再灌注的皮层区域，在此皮层区域的动脉供应支与细线相交的位置，用带线缝合针将脑膜、动脉供应支及细线一起结扎；③采用组织化学方法观察脑梗塞的位置和体积，或者利用行为学实验评价功能缺损水平。还可以在显微镜下切断细线上的手术线结，取下细线和切断后的线结，进行缺血后的再灌注。本发明所制作的模型可以提供良好的观察视野，从而有利于实时高分辨地观测缺血及其再灌注前后血流血氧等参数的动态变化过程。
文档编号G09B23/00GK1911187SQ200610019640
公开日2007年2月14日 申请日期2006年7月14日 优先权日2006年7月14日
发明者骆清铭, 骆卫华, 王珍, 李鹏程 申请人:华中科技大学