专利名称：高分辨率光纤荧光成像的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高分辨率光纤荧光成像的方法和装置，尤其是共焦成像；更具体涉及的预期应用领域是体内、原位成像。
观测到的荧光可来自外来化合物(一般为注入的标记物)或者生物组织的自生化合物(存在于细胞内)。
更具体地说，本发明的共焦成像方法是这样一类成像方法该方法包括在皮下的平面内逐点扫描组织，每点对应一个激发信号，该激发信号由连续源发射，依次偏转并注入到光纤束的一根光纤内，随后在所述光纤的出口处聚焦到所述平面内，所述每点转而发射荧光信号，该荧光信号由所述光纤收集，随后进行检测和数字化处理，以形成像素。
共焦特性可通过以下方法获得使用相同的光路(特别是使用用于空间滤波的同一根光纤)传输激发信号和响应激发信号而发射的荧光信号，并使用一个适合使组织内的焦点与所述光纤共轭的光学系统。
相应的共焦成像装置包括柔性的光纤束(通常称为传像束)，在它的近端设有-在一个或多个目标荧光体的激发波长上以连续或脉冲地发光的光源，一般为激光光源；-用以在光源产生的激发光束的时间内、在与传像束的入射截面对应的XY平面内的行和列内进行快速扫描的器件；-用以将激发光束注入某一光纤的器件；-用以检测荧光信号的器件；以及控制器件，尤其是用于扫描器件的控制器件。
还提供了适于根据各光纤上连续检测到的信号来形成并显示图像的器件。
在传像束的远端为光学头，该光学头设计成与被观测的组织相接触，使激发光束能够在给定深度(几十μm)聚焦，并由此形成皮下像。
在实际应用中，这种装置尤其具有以下优点-在传像束的远端只有一个聚焦光学元件，与和扫描器件结合的光学头相比，该聚焦光学元件不易碎且成本低，且可独立于扫描器件考虑这种光学头的替换；此外，该光学头可被小型化，这在内窥镜检查方法中是有利的，且一般会有助于增加定位的精确度；-由柔性光纤制成的传像束作为通向观测部位的进入臂(accessarm)，这对于原位原位操作(in situ application)很重要。
本技术领域中，已经描述了下列荧光方法和装置。
文献“Applied Optics”，Vol.38，No.34，December 1999，page7133-7144里介绍了一种共焦显微内窥镜，该共焦显微内窥镜使用柔性光纤束并在远端装配小型光学聚焦头；为了成行地扫描光纤束，该装置包括检测狭缝以及电荷传送(charge-transfer)型的线性CCD检测器。使用这类装置，可每秒获得4幅图像(4images/s)，每秒4幅图像对取决于受治疗者和操作者移动的原位成像来说太慢了。此外，成行(而不是逐点)扫描的事实降低了共焦特征，并导致分辨不良的图像。
文献“Optics Communication”，188(2001)，page267-273中介绍了一种共焦激光扫描台式显微镜和柔性光纤束的耦合，在光纤束的远端装配有小型光学头。想达到的目的是使显微镜和内窥镜兼容。扫描是逐根光纤进行的，但所使用的台式显微镜为标准设计，该台式显微镜设计成用来显示固定样品，不用关心获得图像所用的时间。该文献提出了2秒的照射时间，这对于实时原位成像来说太长了。
本发明的目的是提出一种用于高分辨率光纤荧光成像的方法和装置，具体是共焦成像，该成像方法使用由光纤制成的传像束，用连续发射的激发光束对光纤进行逐根扫描，所述方法和装置可获得体内部位的实时原位显示，即能够在不依靠受治疗者和操作者移动的情况下，每秒提供足够数量的逐点图像，尤其为了获得相当快速的检查。
本发明的另一目的是提出一种方法和装置，一般来说，该方法和装置可优化各图像的质量，尤其是为了获得极好的横向和轴向分辨率。
根据本发明的第一方面，提出了一种用于实现共焦荧光体内原位成像的方法，该方法使用由数千根光纤制成的传像束，并且该方法包括在皮下平面内逐点扫描组织，每点对应一个激发信号，该激发信号由连续光源发射，经偏转并注入到所述光纤束的一根光纤内，随后在所述光纤的出口聚焦到所述平面内，每点转而发射荧光信号，该荧光信号由所述光纤收集，随后进行检测和数字化处理，以形成像素，其特征在于以对应于每秒获得的图像数量足以满足实时使用的速度偏转激发信号，并以对应于光纤的最小逐根采样频率的检测频率检测荧光信号。
根据本发明的第二方面，提出了一种实现高分辨率荧光成像的方法，该方法使用由数千根光纤制成的传像束，激发信号由连续光源发射，依次偏转并注入到所述传像束的一根光纤内，并且响应激发信号而发射的荧光信号随后由用于激发的同一根光纤所收集，随后进行检测和数字化处理，以形成像素，其特征在于光纤端设计成处于与要成像的组织的表面直接裸露接触的状态，各光纤适合产生发散光束，该发散光束适合激发位于表面到最大深度之间的组织的微体积(microvolume)，最大深度特别取决于光纤的芯径，并且，以一对应于每秒获得的图像数量足以满足实时使用的速度偏转激发信号，并以对应于对光纤的最小逐根采样频率的检测频率检测荧光信号。
因此，这种方法与第一方面的方法的不同之处在于本方法不提供对各光纤出口处聚焦的信号的扫描，而是提供对各光纤出口处的发散信号的扫描。这种光纤出口处的非聚焦信号可以获得位于组织表面正下方的一定体积的图像，可对这些图像进行处理，从医疗观点看它们尤为有利。因为这些图像不是来源于已进行逐点扫描的皮下截面，所以它们不是“共焦的”，但是由于这些图像是来自对位于表面正下方的微体积的依次扫描，并且来自用于激发的同一根光纤对各微体积发射的荧光信号的空间滤波，所以这些图像仍可称作“高分辨率”的。这种装置的主要优点在于对于内窥镜应用，内窥镜探针的直径可以很小，仅取决于传像束的直径，因而取决于内窥镜的光纤数量。上述情况允许设计应用领域，例如神经学领域，其中内窥镜探针的尺寸是克服光学聚焦头小型化中内在的问题的关键因素。
本发明提出了一种实现体内、原位实时成像的解决方法(在光纤出口聚焦或不聚焦的方法)。本发明基于对光纤采样的考虑(根据香农标准)，该采样可获得与各光纤有效对应的逐点重构的图像。这种方法避免了当对所有光纤进行逐根采样同时还维持每秒的最小平均图像数时的信息损失，即在实际应用中，对于640×640像素的最大方式，至少每秒12幅图像。基于此最小采样的关系选择检测频率(检测器的通带)，使得每根光纤能够检测尽可能多的荧光光子数。
因而，根据一可能的实施例，使用具有大约30000根柔性光纤的传像束，采样频率和检测系统(雪崩光电二极管或同等产品)的通带固定为大约1.5MHz，近似地对应于每根光纤12个像素，因而可以640×640像素的最大方式最少获得每秒12幅图像。
在实际应用中，根据一有利的实施例(该实施例使实现光纤的适当快速扫描而获得实时图像成为可能)，光束的偏转通过确定共振“线”反射镜的快共振频率和检流计“帧”反射镜的慢共振频率来调节。
根据本发明，考虑到实时成像的获取，光纤发出的流量的检测周期是受时间限制的，并且该检测周期很短。因而，本发明还提供了优化部件，以在该有限的检测周期内收集并检测来自样品的最大流量，特别是-使用具有一定程度消色差能力的光学偏转部件、光学注入部件以及光学聚焦和光学检测部件(如果适当)，消色差取决于激发波长和最大荧光波长之间的波长差以及发射的荧光信号的谱宽。这种方法的好处是可优化在发射的荧光的整个谱带上收集的荧光流量；-如果适当，可选择组织上的聚焦光学元件的数值孔径(大约在0.5和1之间)，这种方法可以在光场尺寸和收集光子的数量之间获得较好的折衷；以及-选择要检测的荧光波长处的量子效率至少为50％的检测器。
依据本发明，为了从被检测的光子的有限流量获得高质量的图像，还对随后对检测的流量实施的图像处理进行了优化。这种优化可通过以下方法实施。
在实时获取图像之前，实施一系列步骤-检测选定的一组要使用的光纤(传像束的所有光纤或一个选定的子组)的各光纤位置的步骤，该步骤至少在传像束的每次改变时实施；-校准对各光纤的注入速率的步骤，即规定对每根光纤的注入率；以及-检测背景图像(在无样品的情况下)的步骤。
在操作过程中，在对检测信号进行数字化之后，图像处理的优化具体包括以下步骤以各光纤的注入率的函数形式进行校正并减去背景图像之后，限定各光纤所收集的实际流量(即仅来自样品的流量)，以获得校正信号；
随后，根据该校正信号进行图像的重构，尤其是为了将显出光纤拼图的图像转换成看不到明显光纤的图像。
根据本发明，最后两个步骤必须能够被实时执行。至于信号的校正，由于采用适合于观测信号的结构的处理和一种优化算法，信号的校正可实时进行。而图像的重构，可根据图像质量，通过选择每个像素的操作次数来进行。高斯低通滤波(Gaussian low-passfiltering)体现了处理的复杂度结果质量和计算时间之间很好的折衷。
为了节约时间并增加图像重构所对应的处理的复杂性，还可增加设备的处理能力，例如，通过使用特定的处理卡和/或并行的体系结构(例如多处理器结构)。
本发明还提出了一种适合于实现上述第一方面的方法的装置，该装置包括传像束；在至少一个目标荧光体的激发波长上连续发光的光源；用于在光源产生激发光束的时间内，在与传像束的入射截面对应的XY平面内逐行和逐列地进行快速扫描的装置和逐根光纤进行注入的部件；用于分离激发波长和荧光波长的部件；用于检测荧光信号的部件；以及用于处理可使图像得以形成的检测信号的部件；光学头设置在远端，设计成可与观测组织接触，使激发光束可被聚焦。
所述装置的特征在于扫描部件适于以与实时获得图像相对应的速度移动激发光束；以及检测部件的通带频率由其与光纤的最小逐根采样频率的关系加以确定；本发明还提出了一种用于实现依据本发明第二方面的方法的装置，该装置包括传像束；在至少一目标荧光体的激发波长上连续发光的光源；用于在与传像束的入射截面对应的XY平面上，对光源产生的激发光束进行快速扫描的部件和逐根光纤注入的部件；用于分离激发波长和荧光波长的部件；用于检测荧光信号的部件；以及用于处理可使图像得以形成的检测信号的部件；其特征在于各光纤的末端适合于产生发散光束，并且设计成处于与要观测的组织的表面直接裸露接触的状态；并且，扫描部件适于以与实时获得图像相对应的速度移动激发光束，并且所述检测部件的通带频率由其与光纤的最小逐根采样频率的关系加以确定。
根据后续的实施例描述并参照附图，可更好地理解本发明并且明白其它优点。
图1示意表示一个包括聚焦头的共焦荧光成像装置的实施例。
图2是图1的装置的框图。
图3示意表示一个高分辨率荧光成像装置的实施例。
图4是图3的装置的框图。
根据图1和图2中选择描述的实例，所述装置包括光源1；用于对激发光束整型的部件2；用于分离波长的部件3；扫描部件4；光束注入部件5；由柔性光纤构成的传像束6；光学聚焦头7；用于抑制激发光束的部件8；
用于聚焦荧光信号的部件9；用于对荧光信号进行空间滤波的部件10；用于检测荧光信号的部件11；以及用于对检测到的荧光信号进行电子和计算机处理并进行显示的部件12。
下面详细描述这些不同的单元。
光源1是在某一激发波长上发光的激光器，该波长可激发大范围的荧光体，例如488nm。为了优化进入传像束6中的一根光纤的注入，激发光束为圆形，以能够注入到截面也为圆形的光纤内，并且为了优化注入率，激光器最好是纵向单模型激光器，以为向轻微多模(slightly multimode)光纤的注入提供尽可能好的波前。激光器以连续形式或脉冲形式发光，并且以稳定的方式发光(最小可能噪声＜1％)。可获得的输出功率的量级为20mW。例如，可使用量子阱激光器(VCSEL)、二极管泵浦的固态激光器、激光二极管或气体激光器(氩离子激光器)。
用于定形激发激光束的部件2设置在光源1的出口。该部件2由放大倍数不为1的远焦光学系统组成，该光学系统包括适用于改变激光束直径的两个透镜L1和L2。对放大倍数进行计算，以使光束的直径适合于光纤的注入部件5。
随后，经整型的激发激光束被导向到为分离激发波长和荧光波长而提供的部件3。例如，该部件3是激发波长的透过率为98-99％的分色滤光器，并且，该分色滤光器将其它波长光线基本上反射。因而，沿与激发信号相同的光路(共焦特征)返回的荧光信号几乎全部传输到检测光路(8-11)。设置在检测光路的抑制部件8用于完全消除向检测光路传播的激发波长488nm的1-2％的干扰反射。(例如，488nm的抑制滤光器，仅允许例如500-600nm的光线透射的带通滤光器，或允许500nm以上光线透射的高通滤光器)。
随后，扫描部件4获得激发光束。根据在图1中选择描述的实例，这些部件包括在4KHz共振的反射镜M1，该反射镜M1用于水平地折射光束，并由此实现图像的行；在15Hz处检流的反射镜M2，该反射镜M2用于垂直地折射光线，并由此实现图像的帧；以及两个具有单一放大率(unitary magnification)的远焦系统，AF1位于两个反射镜之间，AF2位于反射镜M2之后，这些远焦系统用于使这两个反射镜M1、M2的转动面与一根光纤的注入面共轭。根据本发明，确定扫描速度，以使对组织的实时体内原位观测成为可能。为此，扫描必须足够快，以对于640×640像素的显示方式，与最慢方式相对应的至少12幅图像显示在屏幕上。因而，对于像素较少的显示方式，每秒所获得的图像数始终大于12图像/秒。作为本例的变形，扫描部件可具体包括旋转反射镜、MEMs型集成元件(X和Y扫描镜)或声光系统。
在扫描部件的出口处进行折射的激发光束被导向到光学部件5，以注入到传像束6的一根光纤内。在这种情况下，所述部件5由两个光学单元E1和E2组成。第一光学单元E1适用于校正扫描部件4的光场边缘的部分像差，由此优化整个光场(中心以及边缘)上的注入。第二光学单元E2用来进行实际注入。对第二光学单元E2的焦距和数值孔径进行选择，以优化传像束6的光纤的注入率。依据一个可获得消色差标准的实施例，第一光学单元E1由一个双合消色差透镜构成，两个双合消色差透镜中的第二光学单元E2后随有一个靠近传像束设置的透镜。作为本例的变形，这种注入光学元件可由任何其它类型的标准光学元件(例如两个三片透镜)或折射率渐变透镜或显微透镜(然而成本较高)构成。
传像束6由大量(几万根)柔性光纤组成，例如30000根直径为2μm，间距为3.3μm的光纤。在实际应用中，可使用传像束的整组光纤或者这些光纤的选定的子组(例如，居中的选定子组)。
在光纤的出口处，激发激光束由光学头7聚焦到样品13内的一点14上，该点14位于相对样品表面15的给定深度，该深度位于在几十μm到大约一百μm之间，该光学头设计成位于与样品表面15相接触的位置。例如，该深度可为40μm。因此，光学头可将传像束输出的流量聚焦到样品内，并且还收集从样品返回的荧光流量。光学头的放大倍数为2.4，样品上的数值孔径为0.5。选取这两个参数，是为了使返回信号只存在于传输激发信号的光纤内，不存在于邻近的光纤内，并由此保持利用一根光纤的共焦滤波。利用这些放大倍数和数值孔径值，轴向分辨率的量级为10μm，横向分辨率的量级为1.4μm。还可选择数值孔径，以便优化回收的光子数，该光子数必须尽可能大。光学头可由具有适于共焦的光学性质和色差品质(即，使像差最小化)的标准光学元件(双合透镜、三合透镜、非球面透镜)和/或梯度折射率透镜(GRIN)和/或衍射透镜构成，否则，特别是会导致光场深度的降低，并由此导致成像装置的轴向分辨率的降低。光学头设计成在操作过程中与样品13接触。后者是生物组织或细胞培养物(cell culture)。以注入的荧光体(系统荧光)或通过修改基因由细胞本身产生荧光体(转基因荧光)的方式实现荧光表示。在这两种情况下，荧光体均在更宽或更窄的谱带上再发射光子，该谱带宽度可在几十纳米到大于一百纳米的范围内变化。
在检测光路上，从抑制滤光器8输出的荧光信号随后由部件9(例如，由检测透镜构成的部件)聚焦到空间滤波部件10的滤波孔内。计算检测透镜的焦距，以使来自光纤的荧光信号的尺寸与滤波孔相同或略小于滤波孔。后者使得可以仅保留来自被入射光束照射的光纤的荧光。滤光孔使得可以抑制否则会被耦合到与被照射光纤相邻的光纤内的光。计算滤波孔的尺寸，以使光纤的图像完全适合该滤波孔。在本实施例中，滤波孔为20μm。此外，还是为了优化通过滤波孔的光子数量和由此产生的检测流量，扫描部件4、注入部件5、光学头的聚焦部件7以及检测部件8、9和10按照检测荧光体作了调整上述部件被选择为充分地消像差，以便在最宽的荧光体发射带上收集光子。
检测部件11在被调查的荧光波长处的灵敏度最大。例如，可使用雪崩光电二极管(APD)或光电倍增管。此外，依据本发明，对通带作了选择，以优化荧光信号的积分时间。该通带为1.5MHZ，对应于具有各像素上优化积分时间的传像束的最小采样频率。
用于控制、分析和数字化处理检测信号并进行显示的电子和计算机部件12包括下述卡-同步卡20，该同步卡用于-以同步方式控制扫描，即控制行反射镜M1和帧反射镜M2的移动；-在任意时刻获知这样被扫描的激光点的位置；以及-并通过其自身可被控制的微控制器管理所有其它的卡；-检测器卡21，该检测器卡包括具体进行阻抗匹配的模拟电路、模-数转换器以及对信号进行整型的可编程逻辑元件(例如，FPGA电路)；-数字获取卡22，该数字获取卡22适于以可变频率处理数字数据流(flux of digital data)及其在屏幕23上的显示；以及-图形卡24。
作为本例的变形，可使用结合这些不同卡的功能的单个卡。
通过以下方式进行图像处理。
当传像束放置在所述装置内时，实施第一操作，以确认传像束中的光纤的设计结构(design)，并由此获知要使用的各光纤的实际位置。
在使用所述装置前，还实施以下操作-用均匀样品确定各光纤的注入率，各光纤之间的这种注入率可发生变化。
-测量背景图像，该测量在没有样品的情况下进行。
可以根据装置使用的频度来定期执行这两项操作。所获得的结果将用于对检测器卡输出的数字信号的操作中的校正。
根据发明2，在操作过程中，在探测器卡输出的数字信号上实施处理组第一组处理存在于校正数字信号的第一步，尤其是为了考虑所述信号来自的光纤的实际注入率，并为了从该信号上减去与背景图像相对应的那部分流量。这样可以仅处理与观测样品真正对应的信号。对于该处理组，使用一种标准计算算法，该算法可进行优化，以顾及实时这一约束条件。
随后，第二组包括从校正的信号中重构数字图像，该图像由医生来显示。所实施的处理的目的是为显示器提供重构的数字图像，该数字图像不是分别与并排放置的光纤的校正的数字信号对应的像素的简单拼图，而是提供不再显示光纤的重构数字图像。为此，使用在各像素上实施一定数量的操作的算法，选择该算法是为了满足实时这一约束条件，即，该算法必须在所需操作的复杂性、可获得的结果质量和计算时间之间体现很好的折衷。例如，可使用高斯低通滤波算法。
该装置进行如下操作光源1产生波长为488nm的圆形平行激发光束，该光束随后在远焦系统2中进行整型，以给出尽可能最大地注入到光纤纤芯的适当尺寸。该光束随后送入到分色分离系统3中，该系统反射激发波长。随后，由反射镜的光机扫描系统4成角度地将入射光束经时间反射到空间内的两个方向上，并利用光学注入部件5将入射光束注入到传像束6的光纤的一根光纤内。电子部件12用于控制在一给定时刻传像束光纤中一个光纤的注入，通过反射镜在给定行上逐点偏转光束角度，并逐行地进行地，以构成图像。在传像束的出口，通过光学头7将从被注入的光纤射出的光聚焦到位于给定深度的一点处，该给定深度在大约几十μm和大约一百μm之间。由于扫描，样品被逐点照射。因而，在每一时刻，光点照射的组织发射其特征为向较大波长方向偏移的荧光信号。由光学头7获取该荧光信号，随后，该荧光信号沿激发光束的反向光路传输到分色滤光器3，该分色滤光器将荧光信号传输到检测光路。随后，在激发波长处形成的干扰反射由抑制滤光器8抑制。最后，荧光信号聚焦到滤光孔10，以只选择来自受激光纤的光，并通过雪崩光电二级管11检测光子。随后，检测信号被数字化并进行校正。使用上述的图像处理方法对检测信号逐一进行实时处理，以能够实时地重构在屏幕上显示的图像。
根据图3和4中选择描述的实施例，除了光学聚焦头7外，该装置包括的部件与图1和图2的装置相同。在这些附图中，相同的部件使用相同的附图标记，因此，在本实施例中不再详细描述。
该装置使用的传像束6可由大约5000-100000根柔性光纤制成，光纤数取决于所想要的传像束的外径，外径本身决定于预期的应用(内窥镜检查法、所要求的光场尺寸等)。例如，它们可为FUJIKURA销售的传像束。光纤的芯径最好在1到4μm之间。对于空气中的数值孔径为0.42的情况，这种芯径会导致光束在光纤的出口处的发散角大约是18°。可通过拉伸整个传像束的端部的方法获得1μm的芯径。传像束6的端部被抛光，并且不包含光学部件。抛光的目的是给出传像束表面，因而使裸光纤与组织接触，相同的表面条件一方面可使获得的图像背景尽可能均匀，另一方面，抑制光纤与组织的任何粘着问题，光纤与组织的粘着将破坏组织。抛光面可光滑或修圆，以便适应组织的形状。各光纤的数值孔径最好选择得尽可能大(即，例如0.42)，以收集最多的荧光光子。芯间距给出获得图像的横向分辨率(图像的两点之间的距离)。该芯间距越小，分辨率越高，但是这会损害要成像的光场的尺寸。因而，应该在传像束的光纤数和光纤间的芯间距之间找到较好的折衷办法，以获得具有适于观测所要求的组织的光场尺寸的较好的横向分辨率(2-8μm)。
下面给出本发明适用的两例传像束
DCT数据储存在块层。它先从比特流(VLC)解码，使用曲折或交互扫描模式而逆向扫描，然后反量化。内部DC系数可从dct_dc_differential和预测器(预测器可根据MPEG-2规格而重新设定)决定。在跳越宏块中的DCT系数设定成零。
权利要求
1.一种用于实现共焦荧光体内原位成像的方法，该方法使用由数千根光纤制成的传像束，并包括在皮下平面内逐点扫描组织，每点对应一个激发信号，该激发信号由连续光源发射，经偏转并注入到所述光纤束的一根光纤内，随后在所述光纤的出口聚焦到所述平面内，每点转而发射荧光信号，所述荧光信号由所述光纤收集，随后进行检测和数字化处理，以形成像素，其特征在于以与每秒获得的图像数量充分满足实时使用相对应的速度偏转激发信号，并以与光纤的最小逐根采样频率相对应的检测频率检测荧光信号。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于聚焦光学元件的数值孔径大约在0.5到1之间。
3.一种用于实现高分辨率荧光成像的方法，该方法使用由数千根光纤制成的传像束，激发信号由连续光源发射，依次偏转并注入到所述传像束的一根光纤内，并且响应激发信号而发射的荧光信号由用于激发的同一根光纤所收集，随后进行检测和数字化处理，以形成像素，其特征在于光纤端设计成用来与要成像的组织的表面直接裸露接触，各光纤适合产生发散光束，所述发散光束适合激发位于表面到最大深度之间的组织的微体积，最大深度特别取决于光纤的芯径，并且，以与每秒获得的图像数量充分满足实时使用相对应的速度偏转激发信号，并以与对光纤的最小逐根采样频率相对应的检测频率检测荧光信号。
4.如上述权利要求中任意一项所述的方法，其特征在于，通过确定共振线反射镜的快速共振频率和检流计式帧反射镜的慢速共振频率来调节所述激发光束的偏转速度。
5.如上述权利要求中任意一项所述的方法，其特征在于，所使用的光学偏转部件、光学注入部件、光学聚焦部件和光学检测部件存在一定程度的消色差，所述一定程度的消色差使得在受激荧光体的整个发射带上收集光子成为可能。
6.如上述权利要求中任意一项所述的方法，其特征在于，要检测的荧光波长处的检测量子效率至少为50％。
7.如上述权利要求中任意一项所述的方法，其特征在于，包括检测要被使用的所述传像束光纤的位置的预先步骤。
8.如上述权利要求中任意一项所述的方法，其特征在于，包括确定针对每一根光纤的实际注入率的预先步骤。
9.如上述权利要求中任意一项所述的方法，其特征在于，包括确定与背景图像相对应的被收集光通量的预先步骤。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，包括通过减去与背景图像相对应的光通量并调整光纤实际注入率来校正来自光纤的数字信号的步骤。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，包括从经校正的信号重构图像的步骤。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述重构图像的步骤包括高斯低通滤波。
13.一种用于原位体内光纤光学共焦荧光成像的装置，所述装置用于实施如权利要求1、2、4-12中任意一项所述的方法，所述装置包括传像束(6)；在至少一目标荧光体的激发波长处连续发光的光源(1)；用于在所述光源(1)产生的激发光束的期间，在与所述传像束(6)的入射截面对应的XY平面上逐行并逐列地快速扫描的部件(4)和逐根光纤注入的部件(5)；用于分离激发波长和荧光波长的部件(3)；用于检测荧光信号的部件(11)，以及用于处理检测信号而使图像能够实现的部件(12)；配置在远端的光学头(7)，所述光学头(7)设计成用来与被观测的组织(13)相接触，让所述激发光束聚焦，其特征在于所述扫描部件适于以与原位图像的获得相对应的速度移动所述激发光束；以及所述检测部件具有一通带，所述通带根据光纤的最小逐根采样频率来确定。
14.用于原位体内高分辨率光纤共焦荧光成像的装置，所述装置用于实施如权利要求3-12中任意一项所述的方法，所述装置包括传像束(6)；在至少一目标荧光体的激发波长处连续发光的光源(1)；用于在与所述传像束(6)入射截面对应的XY平面内，对所述光源(1)产生的激发光束进行快速扫描的部件(4)和逐根光纤注入的部件(5)；用于分离激发波长和荧光波长的部件(3)；用于检测荧光信号的部件(11)；以及用于处理检测信号而使图像能够实现的部件(12)；其特征在于各光纤的端部适合于产生发散射束，并且所述端部设计成用以与要观测的组织的表面直接裸露接触；所述扫描部件适于以与原位图像的获得相对应的速度移动所述激发光束；以及所述检测部件具有一通带，所述通带根据光纤的最小逐根采样频率来确定。
15.如权利要求13或14所述的装置，其特征在于，所述光源(1)产生的激发光束是纵向单模光束，所述纵向单模光束提供最适于注入到轻微多模光纤中的波前质量。
16.如权利要求13-15中任意一项所述的装置，其特征在于，光纤的横截面为圆形，所述光源产生的激发光束为圆形，以优化各光纤的注入。
17.如权利要求13-16中任意一项所述的装置，其特征在于，在所述光源(1)的出口处设有将所述光束整形的部件(2)，对激发光束进行整形而使所述激发光束适合所述传像束(6)的注入部件(5)。
18.如权利要求13-17中任意一项所述的装置，其特征在于，用于分离所述激发波长和荧光波长的部件中，包括在所述激发波长处具有最大效率的分色滤光器(3)。
19.如权利要求13-18中任意一项所述的装置，其特征在于，抑制部件(8)设置在所述检测部件(11)的上游，适于消除所述激发波长。
20.如权利要求13-19中任意一项所述的装置，其特征在于，所述扫描部件(4)包括共振线反射镜(M1)、检流计式帧反射镜(M2)、第一远焦光学系统(AF1)、第二远焦系统(AF2)，所述第一远焦光学系统具有单一放大率，适合于使两个所述反射镜共轭，所述第二远焦系统具有单一放大率，适合于使两个所述反射镜的转动面与所述光纤中的一根光纤的注入面共轭。
21.如权利要求13-20中任意一项所述的装置，其特征在于，所述光学头(7)、扫描部件(4)、注入部件(5)和检测部件提供适合于在所述荧光信号的整个谱带宽度上收集光子的一定程度的消色差。
22.如权利要求13-21中任意一项所述的装置，其特征在于，所述注入部件(5)包括两个光学单元(E1、E2)，所述第一光学单元(E1)适合于校正所述扫描部件(4)的光场边缘的像差，并且所述第二光学单元(E2)适合于进行对所述传像束(6)的光纤的一根光纤的实际注入。
23.如权利要求22所述的装置，其特征在于，所述第一光学单元(E1)包括一个双合透镜，并且所述第二光学单元(E2)包括两个双合透镜，且后随一个透镜。
24.如权利要求13-23中任意一项所述的装置，其特征在于，在所述检测器(11)的前面放置一滤光孔(10)，选择所述滤光孔(10)的直径，以使一根光纤的图像通过所述滤光孔(10)。
25.如权利要求24所述的装置，其特征在于，设有用以将所述荧光信号聚焦到所述滤光孔(10)上的部件(9)。
全文摘要
本发明涉及一种使用传像束方法，该传像束包括数千根光纤，激发信号由光源发射，依次偏转并注入到所述传像束的光纤内。在光纤输出中的人体组织的各激发点转而发射荧光信号，该荧光信号由所述光纤收集，随后，经探测以及数字化处理，形成像素。根据本发明的第一方面，所述方法用以在光纤输出内聚焦光束，以激发表皮下平面，产生共焦图像。根据第二方面，所述方法用以在光纤输出中产生发散光束，该光束能够从表皮开始激发组织的微体积。本发明的特征在于所述方法是以一定速度偏转激发信号，该速度对应于每秒获得的图像数足够实时使用，并以一定探测频率探测荧光信号，该探测频率对应于最小的对光纤逐根采样的频率。本发明使得体内原位实时成像的实现成为可能。
文档编号G02B26/10GK1681432SQ03821815
公开日2005年10月12日 申请日期2003年7月11日 优先权日2002年7月18日
发明者M·格内特, B·维伊勒罗贝, F·伯里尔, S·克拉德 申请人:莫纳基技术公司