专利名称：扫描共焦显微术中的改进以及与之相关的改进的制作方法
技术领域：
本发明涉及扫描共焦显微术，更特别地涉及对安装在扫描共焦显微系统中的样本的一个或多个区域的选择性照明(illustration)。
背景技术：
共焦显微镜通常用于观察半透明显微物体的内部细节，特别是在生物应用中，其通常采用荧光照明。这种显微镜的基本特征是利用通过小孔(pinhole)聚焦的光照射样本并且结合对通过相同小孔返回的光的观察，结果是检测到的光基本上与该小孔在样本内的特定像平面相关，而不是与样本上方或下方的平面相关。这样能够在该样本内获得准确的深度分辨率。通常，将激光器用于在小孔处提供非常紧聚焦的强光束。如上所述，这种系统给出了有关该样本中仅ー个点的信息。然而，利用两个可选的和全然不同的方法能够扩展这种原理，从而提供该样本的扩展像(image)。在第一种方法中，称作‘扫描光斑(scanning spot)’，在感兴趣的区域上对小孔进行光学扫描，记录返回的强度，以便重建样本的像。在第二种方法中，平行照射许多小孔，以同时给出整个感兴趣区域的信息。一种这样的配置是‘Nipkow盘(disk)’，其中将小孔设置在盘中，然后使该盘旋转以给出该区域的多次扫描的覆盖。这种方法特别适合应用于对活细胞的高速成像，这是目前生物学中相当受关注的课题。然而，本发明与各种形式的共焦扫描有关，但尤其涉及采用多个小孔的共焦扫描。ー些已知的分析技术涉及向样本的选定区域投送强光束，以便改变该选定区域中的样本材料属性。例如，在荧光显微术中所使用的许多染料在暴露于非常强的光源时会‘漂白(bleach)，。漂白特定的区域使该区域被‘标记’ 一使其与其他本来不可区分开的相邻区域区分开，从而允许该区域在移动和显影时被追踪。这种‘光致漂白后的荧光恢复(Fluorescence Recovery After Photobleaching)’(或者 FRAP)允许细胞内的传送机能被监视。通常，扩散过程将使漂白斑在一时间段之后恢复，该时间段是由扩散的速率決定的。对于粘性低的媒质，这ー过程会非常快，在微秒数量级。目标照射(targetedillumination)的第二个实例是光催化(photoactivation)。ー些染料在被非常强的光源催化时会改变其荧光色。同样，这使某一区域被‘标记’并且允许传送机能被研究。扫描光斑共焦系统非常适于目标照射应用。单个扫描光斑覆盖了样本的所有部分，所以在光斑位于感兴趣区域上方的同时提高激光功率产生了目标照射。尽管这种方法较慢且低效，但是ー些年来目标照射已经可用在扫描光斑系统中。然而，对于旋转盘系统并非如此，其中光学装置的平行照射无法显著提高指定区域上的光强度
发明内容
本发明提供了一种用于将光束输入到从扫描共焦显微系统的共焦扫描头延伸到显微镜的光路中以照射安装在显微镜中的样本的选定区域的组件，其中所述组件包括
一光输入端，用于接收来自光源的光束；
-射束(beam)引导装置，用于根据样本的选定区域的形状来控制光束的路径；以及-射束耦合器，用于将光束选择性地耦合到从共焦扫描头到显微镜的光路中，其中由射束引导装置来控制射束方向以便照射选定区域。特别地，光束的强度可足以漂白样本选定区域的荧光部分或者以其它方式改变其光学属性，使得例如FRAP或者光催化实验能够进行。该显微系统的安排(其中来自该组件的光束被选择性地输入到共焦头所使用的相 同端口中)是有益的，因为这允许耦合(切换)装置被设置在显微镜外。因此，能够在无需进入显微镜内部或者无需在显微镜内容纳附加部件的情况下实现本发明。为了留有足够空间供该组件插在共焦扫描头与显微镜端口之间，该组件可以包括光中继器(optical relay)，用以将在共焦扫描头与显微镜之间的光路上形成的样本像从该组件的显微镜侧中继(relay)到该组件的扫描共焦头侧。因此共焦扫描头的工作基本上不会因引入该组件而受到影响。优选的是，该光中继器包括在光路中限定了孔的挡板(baffle)，用以减少杂散光的透身寸(transmission)。可以在射束耦合器与显微镜之间提供场镜(field lens)以会聚光束。射束耦合器可以包括反射元件，该反射元件能被选择性地插入在共焦扫描头与显微镜之间的光路中，以促进透射的光束注射(inject)到光路中。反射元件可以采用反射镜(miiTor)的形式。有利的是，反射元件可以是分束器，以允许样本在该组件的照射期间被观察。在优选实施例中，该组件包括用于选择性地改变所透射光束的直径以调整在该样本处生成的照射光斑尺寸的装置。这可以通过在通过该组件的射束路径中选择性插入具有不同光学属性的望远镜来实现。优选的是，将前、后望远镜透镜安装在各自的可旋转支架上，以允许将每个支架上安装的透镜选择性地插入光束路径中。该组件还可以包括用于调整输入到该组件中的光束的方向和横向位移的装置。为此，可以安装输入射束准直器(collimator),以便允许改变其定向(orientation)以实现这些调整。在优选实施例中，该准直器具有与每一端相邻的圆柱形外表面，并且与这些表面中的每个表面相接触地提供两个螺纹调整器(adjuster)。所述调整器的轴优选基本上平行，并且适当操纵所述调整器以允许根据需要对光束路径进行调整。以平行配置(而不是以垂直调整器对)提供所述调整器使它们能够被安装成使得都能够由用户从该组件的一侧接近。在优选实施例中，射束引导装置包括两个枢转地(PiVOtably)安装的反射镜，它们的枢转轴(pivotal axes)基本上相互垂直，以允许在两个正交方向(即在该样本平面中的X和y方向)上改变射束的方向。此外，可以提供透镜以将射束的这些角偏转转变为平行射束位移。该引导装置可操作来将射束朝着样本上的一个或多个离散点引导，或者操纵射束以使得基本上均匀地照射预定区域。优 选的是，提供将枢转地安装的反射镜之一成像到另一个反射镜上的装置，例如光中继器。在一个实施例中，该中继器包括两个透镜对。可以在该枢转地安装的反射镜之间的光路中提供附加的反射镜，以减少其占用的空间的长度。特别地，附加的反射镜可以包括相互正交配置的一对平面反射镜，以便使入射在它们之一上的射束的方向反转。将它们安装为使得能够沿着平行于入射射束的线调整它们的位置，以提供聚焦调整。在优选配置中，提供瞄准透镜以将射束引导装置所引起的光束的角偏转转变为平行射束位移。可以如此安装瞄准透镜，以使得能够利用例如两个相互正交的螺纹调整器相对于通过它的光路横向调整其位置。这使得该组件所输入的光束与来自共焦头的观察射束对准(al i gnment)。可以在该组件的显微镜侧的像平面中的光路中选择性地插入目标(target)，以辅助该组件的校准。还提供了一种显微系统，其包括本文中所描述的显微镜、照相机、共焦扫描头、光输入组件，以及与该组件相耦合的光源，其中该系统包括用于控制射束引导装置和光源这二者的控制器，以便照射样本的选定区域。在优选实施例中，该控制器可操作来输出控制信号到射束引导装置，其将射束的运动限定为基本上等长的步进(step)序列。这可以用于以适当恒定的速度在样本上移动所引导的光束，使得对选定区域的照射基本上均匀。而且，这可以简化所需步进的计算。该控制器可以以大于该系统照相机分辨率的分辨率计算步进，从而提供射束的更平滑、更准确的运动。优选的是，该分辨率大约是60倍或更大。控制器中可以包括存储器，其配置为将用于控制光源的指令集与用于控制射束引导装置的指令集分开存储，使得这两个指令集能够相互独立地更新。在优选实施例中，该控制器可操作来并行处理用于控制光源的指令和用于控制射束引导装置的指令。该控制器可以包括FPGA，其被编程为计算将被输出到引导装置和光源的控制参数。特别地，其可以配置为并行运行计算这些参数的程序。这相对于使用两个或更多独立处理器提高了控制参数之间的同步性，因为这些程序能够根据公共时钟在FPGA上运行。本发明还提供了一种光开关，其用于在共焦头的光输入端与光束输入组件的光输入端之间选择性地切换光源所输出的光束。该光开关可以包括平面反射镜和用于改变反射镜定向的驱动器。该驱动器优选为直接驱动DC电机。其可以包括用于生成指示反射镜定向的信号的旋转编码器。在一种实施方案中，反射镜能够在第一位置与第二位置之间切换，在第一位置处光束未入射在反射镜上，而是直接穿过该开关到达共焦头输入端，在第二位置处光束转向透射到光束输入组件的光输入端。有利的是，可以在通过光开关的每个光路中提供光中继器，以降低对于开关的角度失准的敏感性。该中继器把输入到开关组件的光转移(transfer)到其输出端，并且将所输入的射束聚焦到输入端与输出端之间的点。优选的是，该点接近于该开关的反射镜(当处于第二位置吋)。该中继器可以是位于开关组件的输入端和两个输出端处的透镜的形式。优选的是，在输入端和输出端中的每ー个处提供一对消色差透镜(例如Edmund X08-050)。优选的是，反射镜能够在两个止端(end stop)之间切换并且控制装置与驱动器耦合，以使反射镜在其止端之间的行程(travel)的第一部分期间加速并且在其行程的第二部分期间减速。可以在单点共焦扫描显微系统中采用该组件，但是其特别针对多点共焦扫描显微系统。根据另ー个方面，本发明提供了一种校准包括本文所述的光输入组件的显微系统的方法，包括以下步骤
(a)根据预定的射束引导装置设置来依次照射至少六个点中的每个点；
(b)利用照相机记录姆个点的位置；
(C)确定每个点的照相机像素位置；以及
(d)将像素位置(X，y)和射束引导装置设置(U，V)对输入到以下方程中
权利要求
1.ー种光开关，用于在路径之间选择性地切換光束，其包括用于接收来自光源的光束的光输入端；至少两个输出路径，姆个输出路径导向相应的光输出端；用于选择性地插入光束中以将光束引导到选定的输出路径的平面反射镜；用于改变反射镜的定向的驱动器;以及在通过光开关的每个光路中提供的光中继器，以减少对于开关中的角度失准的敏感性，其中每个中继器被安排为将输入到开关的光转移到相应的选定输出路径，并且将输入射束聚焦到输入端与输出端之间接近于反射镜的点，其中所述中继器包括在光输入端处的聚焦透镜和在每个光输出端处的相应的准直透镜，其中所述反射镜能够在两个终点止动装置之间切換，并且控制装置耦合到驱动器以在反射镜的在所述终点止动装置之间的行程的第一部分期间加速反射镜并且在其行程的第二部分期间减速反射镜。
2.根据权利要求I所述的光开关，其中在输入端和输出端的每个处提供一对消色差透镜。
3.根据权利要求I或2所述的光开关，其中所述驱动器包括直接驱动DC电机。
4.根据前面任一项权利要求所述的光开关，其中所述光开关包括用于生成指示反射镜的定向的信号的旋转编码器。
5.根据前面任一项权利要求所述的光开关，其中所述反射镜能够在两个终点止动装置之间切換，并且控制装置耦合到驱动器以在反射镜的在所述终点止动装置之间的行程的第一部分期间加速反射镜并且在其行程的第二部分期间减速反射镜。
6.根据前面任一项权利要求所述的光开关，其中通过驱动器使得所述反射镜相对于每个终点止动装置偏置。
7.根据前面任一项权利要求所述的光开关，其中所述反射镜能够在第一位置与第二位置之间进行切換，其中在第一位置处光束不入射到所述反射镜，而在第二位置处光束被所述反射镜转向。
全文摘要
本发明提供了用于将光束输入到从扫描共焦显微系统的共焦扫描头(102)延伸到显微镜(104)的光路中以照射安装在显微镜中的样本的选定区域的组件(100)和方法。所述组件包括光输入端，用于接收来自光源的光束；射束引导装置(8、12)，用于根据样本的选定区域的形状来控制光束的路径；以及射束耦合器(16)，用于将光束选择性地耦合到从共焦扫描头(102)到显微镜(104)的光路中，其中由射束引导装置来控制射束方向以便照射选定区域。本发明还描述了一种包括这种组件的扫描共焦显微系统，以及校准该系统的方法。此外，公开了一种用于在两个路径之间选择性地切换光束的光开关。
文档编号G02B21/00GK102914861SQ201210236769
公开日2013年2月6日 申请日期2007年9月14日 优先权日2006年9月14日
发明者R.A.霍尔特, G.R.西利 申请人:珀金埃尔默新加坡私人有限公司