具有孔径相关的共聚焦显微镜的制作方法

本发明涉及一种具有孔径相关的共聚焦显微镜、以及一种用于其操作的方法和软件。

背景技术：

共聚焦显微术的一个主要优点是：通过排斥来自焦平面的外部的光，而获得具有在单层中的提高的对比度的被观察物体的分层图像。这允许物体的三维结构的重建。

共聚焦显微术的各种方法在现有技术中是已知的。被最广泛使用的是激光扫描共聚焦显微镜术。由于样品的单独点的扫描(逐个像素)捕获，因而需要相对较长的时间以便生成全体图像。

扫描系统同样地是已知的，其中并行地对若干个点进行检测。激光装置的使用意味着这些系统是昂贵的。另外，激光只具有窄带光谱，因而限制了图像信息的光谱评估。

用于图像原始数据的解调的软件算法必须对信号的调制部分进行滤波并且对来自不同遮罩位置的若干图像进行计算从而形成全体图像。

由于共聚焦转盘的使用所带来的成像的速度相关优点在孔径相关得到使用。与此同时，却能够避免由于共聚焦转盘或者例如侧向扫描缝隙掩模的使用所造成的缺点。在孔径相关中，破坏性的串扰(因在检测期间而不是在暴露期间通过另一个针孔而影响共聚焦的光)被接收。在孔径相关中，通过使用非共聚焦图像的计算而实际上消除串扰。在共聚焦转盘中，串扰将会最终导致光学伪像，该光学伪像也显示于随后要进行计算的形貌中。

这种方法也描述于DE 6970454T2。不同部分的图像(合成图像和宽场图像)被相继地记录、进行减法运算和显示。因为合成图像和宽场图像的捕获是在转盘的旋转期间相继地进行并且仅在其后进行减法计算，所以显示程序最多可以是捕获程序的一半。以这种方式不能实现动态图像显示。

US 6,341,035B1公开了一种根据上述原理并且能够实现动态图像显示的方法。在此方法中，始终对最新的捕获图像和在即将捕获最新图像之前所捕获的图像进行计算。为了这个目的，在每种情况下判定最新图像是否为合成图像或宽场图像，并且相应地确定减法方向。各种触发信号控制了图像捕获和图像处理。标志被设置在转盘的边缘区上，并且允许局部图像的性质确定。所述文件中并未对一个物体的空间特征的提取进行描述，因为活动图像显示仅发生在焦平面中。

技术实现要素：

基于现有技术，本发明的目的是开发一种具有孔径相关的共聚焦显微镜，从而容易地实现形貌的产生或者叠层图像的生成。

该目的是通过以下显微镜方法、和计算机程序而实现。

一种共聚焦显微镜，包括：照明装置，用于照亮样品；转盘单元，包括可旋转的孔挡板，所述孔挡板具有任选地开放的第一部和用于对所述照明进行编码的结构化的第二部孔挡板；图像捕获单元，用于通过所述孔挡板或解码器挡板来检测第一图像和/或第二图像，所述第一图像分配给所述第一部，所述第二图像分配给所述第二部；可垂直地位移的载物台和/或可垂直位移的调焦控制器，其具有用于对所述载物台和/或所述调焦控制器的垂直位置(z1…z7)进行检测的位置检测装置；和图像处理器，通过计算被分配给所述第一部和所述第二部的所述第一图像和所述第二图像而生成共聚焦图像。其中，所述第一图像和所述第二图像利用它们的相关的垂直位置(z1…z7)各自被暂时地存储于所述图像捕获单元中；以及，为了在所述图像处理器中生成被置于所述载物台上的样品的共聚焦图像，对两个第一图像或两个第二图像进行插值从而产生中间图像，并且对其用基于其垂直位置(z1…z7)的所述第二图像或第一图像进行计算，从而生成共聚焦图像。

一种利用相关的转盘显微法来确定样品形貌的方法，所述方法包括以下步骤：在交替检测置于载物台上的样品的第一图像和第二图像期间，使载物台和/或调焦控制器垂直地移动，其中用于各图像的垂直焦点位置以元数据的形式进行存储；对两个第一图像或两个第二图像进行插值从而产生中间图像；和

通过在规定的垂直位置的所述中间图像与所述第二图像或第一图像之间的计算，而生成所述规定的垂直位置的共聚焦图像。

一种用于在共聚焦显微镜的图像处理器中执行的数据处理程序，其包括用于执行本发明方法的编码程序命令。

根据本发明的共聚焦显微镜首先以已知的方式包括用于照亮可以被置于载物台上的样品的照明装置。该照明装置可以是例如已知用于宽场显微镜的类型的常规照明。载物台优选地被设计成可在水平面中位移和垂直地位移。可替代地或另外，可以在物镜上设置调焦控制器，用以实现焦点变化。

将以同样的已知方式工作并且构造的转盘单元设置在照明装置与载物台之间。转盘单元包括可旋转的孔挡板，该孔挡板具有任选地开放的第一部和用于对照明进行编码的至少一个的结构化第二部，例如在DE 6970454T2中所描述。

由样品所反射或发出的辐射是通过物镜而被解码，该辐射经过孔挡板或者类似地结构化的解码器挡板并且被图像捕获单元所捕获。

第一图像(宽场图像)是由第一部的图像捕获单元所检测，而第二图像(所谓的合成图像)是由第二部进行解码和检测。然而，除共聚焦部分外，合成图像还包含宽场图像的部分。因此，通常必须从合成图像中减去宽场图像，从而获得共聚焦图像。

执行该步骤和其它处理步骤，从而利用根据本发明的方法在图像处理器中生成共聚焦图像。

本发明还包括一种数据处理程序，该数据处理程度具有程序编码手段并且可以在所述类型的共聚焦显微镜的图像处理器中被执行，从而以自动化的方式执行根据本发明的方法的方法步骤。

有利地，数据处理程序也可以在所述类型的共聚焦显微镜的图像处理器(例如，作为固件更新)中被执行从而产生样品的形貌。为了这个目的，图像处理器具有与显微镜的控制单元的通信接口，以便读出或者控制焦点位置。

为了生成样品的形貌，在各种垂直的焦点位置所捕获的堆栈图像是合适的。各种垂直的焦点位置可以通过载物台的垂直调整和/或通过物镜的调焦(调焦控制器)而设定。以这种方式，可以具体地用延长的焦深来显示几何结构、边缘等。

这尤其适用于用人工方法制作的表面的显示，例如用于确定粗糙度值。

根据本发明，在图像捕获期间，现在垂直方向上连续地驱动载物台和/或调焦控制器，同时以不断地交替的方式捕获第一图像和第二图像。对于各图像而言，优选地由位置检测装置所检测或者预先设置的载物台和/或调焦控制器的焦点位置是以元数据的形式在图像捕获时被存储。

用于各种图像类型的该存储可以在不同的或共同的堆栈中进行。

为了计算在规定的焦点位置的共聚焦图像，始终对三个连续地捕获的图像进行计算，其中对两个第一(宽场)图像或者两个第二(合成)图像进行插值以产生中间图像，并且用各自的其它图像类型的图像(第二或第一图像)进行计算以产生共聚焦图像，该共聚焦图像优选地连同相关的焦点位置以元数据被存储于图像堆栈中。当然，这里必须考虑减法的方法(合成图像减去宽场图像)。

现在可以以已知的方式基于在不同焦点位置的共聚焦图像来确定样品的形貌。这里形貌是基于对沿堆栈方向的强度的评估而产生。该过程的步骤描述于例如R.Leach的“表面形貌的光学测量”。

本发明的优点具体地在于：能够以快速和简单的方式计算各种焦点位置的聚焦图像，无需为此目的必须在各自情况下停留在一个焦点位置，这导致总测量时间的显著减少，尤其是在叠加成像中。

各种替代实施例可以应用于图像捕获。

在本发明的一个优选实施例中，第一和第二图像是以交替的方式被捕获于混合堆栈中。这两种图像类型的数目不必相同。

可替代地，第一和第二图像被捕获于不同的堆栈中，即存在宽场堆栈(第一图像)和合成堆栈(第二图像)。在这种情况下，可以将这些图像在相同方向或相反方向上存储于堆栈中。

为了提高精度，有利的是使用多于一个的复合堆栈和/或多于一个的宽场堆栈和/或多于一个的混合堆栈。

就用于各自的期望焦点位置的中间图像的计算而言，可以将第二图像(合成)插值到宽场图像的位置上，反之亦然。同样地，能够将第一和第二图像插值到共同的新位置上或者结合前述的可选择方法。这里所定义的中间图像与从光学系统中已知的中间图像没有关系。它仅仅起在两个或更多的处理步骤之间的“中间站”的作用。

将至少三个图像用于共聚焦图像的计算，其中相同类型的至少两个图像和其它类型的至少一个图像是必需的。

中间图像是通过任何期望类型的适当插值而生成。本领域技术人员能够选择适合于此目的的插值。这里所提及的例子是：多项式插值、不同程度的样条插值、最近邻插值、谢别德插值和阿克玛插值。外推法同样是可行的。

优选的是载物台和/或调焦控制器的垂直调整是连续地进行，尽管在本发明的其它实施例中它也可以发生变化；例如，可以在使用或不使用用于图像捕获的控制回路的情况下接近利用图像数据所存储的固定的预定焦点位置。

可以以所有可想到的方式(通过编码系统机械地、光学的、声学的或磁性或电容的距离测量)，而获得焦点位置的位置数据。同样地能够利用颜色来获得焦点位置，例如在彩色共聚焦显微术(波长扫描)的情况下。

就合成图像和宽场图像而言，垂直行进的速度和因此图像之间的垂直距离可以是相同或不同的。可替代地，能够修改摄像机的帧率。

根据本发明的方法也可以与DE 10 2012 007 045A1中所描述的彩色孔径相关结合。

此外，在变型实施例中，能够使用多个用于图像捕获的传感器。这些图像捕获未必必须是同步的。

附图说明

下面参照附图对根据本发明的方法的优选实施方式进行更详细的说明。在附图中：

图1示出了根据本发明的方法的第一实施方式的示意图，以经插值宽场图像作为中间图像的；

图2示出了根据本发明的方法的第二实施方式的示意图，以经插值合成图像作为中间图像；

图3示出了根据本发明的方法的第三实施方式的示意图，具有各种类型的中间图像；

图4示出了在任意焦点位置的根据本发明的方法的第四实施方式的示意图。

具体实施方式

图1至图4中示意性地示出了根据本发明的方法的各种实施方式的顺序。在各种情况下，将载物台和/或调焦控制器的垂直移动显示为z-轴01。将各种焦点位置z1、z2…z7和za标绘于z-轴01上。

根据本发明，利用一个或多个图像传感器以交替的方式在各焦点位置z1…z7捕获宽场图像(WF)02和合成图像(Com)03，并且将这些图像存储于在图像堆栈04中的它们各自的焦点位置z1…z7。当然，也可以将多个图像堆栈用于该存储。这些焦点位置可以以规定的方式接近，或者可以在连续的载物台移动中进行检测。

在根据图1的第一实施方式中，为了在图像处理器中在焦点位置z2生成共聚焦图像(CF)05，利用已知的图像处理装置对两个宽场图像02(这两个图像已各自在另一Z位置z1或z3被检测)进行插值从而形成在位置z2的宽场中间图像(iWF)06。

现在以已知的方式，通过从合成图像03中减去宽场中间图像06而生成焦点位置z2的共聚焦图像05。

将多个共聚焦图像05存储于在共聚焦堆栈图像07中的它们的相关焦点位置z2、z4、z6。

在根据图2的第二实施方式中，，对存在于相邻的焦点位置z2和z4(或者z4和z6)的两个合成图像03进行插值，从而产生在焦点位置z3(或z5)的复合中间图像(iCom)08，作为焦点位置z3(或z5)的中间图像，其中宽场图像02存在于图像堆栈04中的该焦点位置。然后，通过从复合中间图像08中减去在焦点位置z3(或z5)的宽场图像来计算各共聚焦图像05。

根据图3的第三实施方式是上述两个实施方式的组合。各记录是直接地和在插值之后用于共聚焦图像05的计算。在此实施方式中，可暂时地存储混合的中间图像堆栈09。

图4示出了如何生成用于焦点位置za的共聚焦图像05，其中在该焦点位置za不存在相关的宽场图像02也不存在相关的合成图像03。本发明方法的适应性可以通过这种方式得到增强。在此第四实施方式中，对在位置z4和z6的各相邻的合成图像03进行插值从而产生合成中间图像08，并且对在位置z3和z5的相邻的宽场图像进行插值从而产生宽场中间图像06。通过从两个中间图像08、06中的减法而计算共聚焦图像05。

附图标记的列表

01 z-轴

02 宽场图像

03 合成图像

04 图像堆栈

05 共聚焦图像

06 宽场中间图像

07 共聚焦堆栈图像

08 合成中间图像