分辨至少两个光谱范围的高分辨率扫描显微术的制作方法

本发明涉及样品的高分辨率扫描显微术的方法，其中由照明辐射激发该样品以发射荧光辐射，其中将该照明辐射聚焦到样品中或样品上的点以形成衍射受限照明斑，该点以衍射受限方式成像到空间分辨检测器装置(其具有分辨衍射图像的衍射结构的空间分辨率)上的衍射图像，该点相对于样品以小于照射斑直径的一半的增量位移到不同的扫描位置中，针对每个扫描位置从检测器装置读取强度数据，并且从该强度数据以及分配到其的扫描位置来产生样品的图像，所述图像具有增加而超过用于成像该点的分辨率极限的分辨率。

本发明还涉及高分辨率扫描显微术的显微镜，其包括样品空间、光学单元、照明装置、成像装置、扫描装置、评估装置，该样品空间接收可被激发以发射荧光辐射的样品；该光学单元具有位于样品空间中的焦平面和分辨率极限；该照明装置具有供应照明辐射的入口并且采用照明辐射经由光学单元照明样品空间，使得光学单元将照明辐射聚焦到焦平面中的点以形成衍射受限照明斑；该成像装置用于经由光学单元将焦平面中点的衍射受限成像到检测器装置上的衍射图像，该检测器装置的检测区域位于与焦平面共轭的检测器平面，其中检测器装置具有分辨衍射图像的衍射结构的空间分辨率；该扫描装置用于将点以小于照明斑的一半直径的增量来位移到不同的扫描位置；该评估装置，用于从检测器装置读取强度数据并且用于从强度数据和分配到其的扫描位置来产生样品的图像，所述图像具有增加而超过分辨率极限的分辨率。

背景技术：

用于检查生物制品的光学显微镜的一个经典应用领域是发光显微镜。这里，使用特定的染料(所谓的荧光体或荧光基团)来特定地标记例如细胞部分的样品。用代表激发辐射的照明辐射来照明样品，并且使用合适的检测器捕获由此已经激发的发光辐射。通过这种方式，可以在显微镜中表示单独的、不同颜色的细胞部分。当然也还可以使用不同的染料将制品的多个部分同时着色，所述染料特别地附着到制品的不同结构。这种方法被称为多发光。还可以测量自身发光的样品，即不加入染料。

如通常情况下，发光在这里被理解为磷光和荧光的涵盖性术语，即它涵盖了这两个过程。在提到荧光的情况下，这旨在以部分代表整体来理解而不是以限制的方式来理解。

为了检查样品，还已知使用激光扫描显微镜(也简称为LSM)，其使用共焦检测器装置(在这种情况下称为共焦LSM)，或非线性样品相互作用(称为多光子显微术)，以仅将位于物镜的焦平面中的平面成像。获得光学截面，并且在样品的不同深度处的多个光学截面的记录允许生成样品的三维图像，该样品的三维图像是由不同光学截面构成。激光扫描显微术因此适用于检查厚的制品。当然还可以使用发光显微术和激光扫描显微术的组合，其中使用LSM将发光样品成像在不同深度平面中。

原理上，光学显微镜的光学分辨率(包含LSM的光学分辨率)衍射受限于物理定律。这里术语“高分辨率”用于超过衍射极限的分辨率。

US 5043570描述了通过过采样来增加分辨率的尝试。在显微镜的衍射极限下，这不会导致显著增加的分辨率。

使用非线性灭绝过程，分辨率可以相对于衍射受限共焦LSM而提高到10倍。例如，在US 5866911中描述了这种方法。对于灭绝过程而言，不同的方法是已知的，例如在DE 4416558 C2、US 6633432或DE 10325460 A1中描述的那些方法。

在US 5867604中提到了另一种高分辨显微术，其中以周期性结构来扫描物体。在EP 1157297 B1提到了用于增加分辨率的相似方法。结构化照明使用非线性过程，例如荧光饱和。该方法需要用于图像生成的重构算法和对图像的多重记录的使用。

从WO 2006127692和DE 102006021317已知一种实现宽场中的高分辨率的方法。这个缩写为PALM(photo-activated light microscopy，光子激活光显微术)的方法使用了标记物，可以使用光学激活信号来激活该标记物。只有在激活状态下，才能使用激发辐射来激发该标记物以发射特定的荧光辐射。该激活实现为使得至少已激活的标记分子的特定部分布置在与邻近已激活的分子相距一距离处，使得以显微术的光学分辨率来测量，它们分开或者可以回顾地分开。在发光辐射的记录之后，对于所述分离的分子而言，确定由于分辨率极限而产生的它们的辐射分布的中心，并且在此基础上，通过比实际采用光学成像可能更高的精确度的计算来确定分子的位置。为了成像整个样品，通过引入激活辐射、随后激发和荧光辐射成像来分离子集中的标记的分子被不断重复，直到曾经包含在子集中的所有标记的分子(可能的话)已经被分离。

Hell于2007年在科学，316卷，1153-1158页发表的“Far-Field Optical Nanoscopy”中和在DE 102013017468 A1中描述了其他高分辨率方法。EP 2037255 A1涉及样品光的多光谱捕获。

从EP 2317362 A1已知在本文的开始所提到的类型的方法和显微镜。这已知为艾里(Airy)扫描显微术。本申请文件的图5中图示的所描述的实施例中，本申请文件将样品的衍射受限照明与面检测器结合，该面检测器分辨已照明的点的衍射图像。因此，在传统LSM的情况下，检测器位于针孔所在的平面中。扫描装置在样品上方位移照明斑，并且设计为使得由照明斑所照明的点的衍射图像停留在面检测器上。在EP 2317362 A1的构想下，面检测器提供了针孔平面中的空间分辨率，这参考成像比例来产生衍射图像的过采样，并且因此与特定信号处理一起允许衍射图像的衍射结构的采样。

EP 2317362 A1提供了可以进行颜色分析的实施例。由此多个检测器提供有位于特别光谱通道中的各个检测器。这些颜色通道由二向色性色彩分离器来提供。对于激光扫描显微镜而言，该方法早已众所周知。然而，其具有如下缺点：每个颜色通道需要其自己的色彩分离器和检测器。在传统的激光扫描显微镜(其在共聚焦针孔后使用了非空间分辨检测器)中，这一要求在很大程度上没有问题；但是根据EP 2317362 A1，使用过采样面检测器与相当大的费用关联，特别是因为这种面检测器是昂贵的。另外，根据EP 2317362 A1的过采样原理中，这些多个面检测器相对于彼此将需要以亚像素精确度来调节，因为否则在单独颜色通道中所产生的图像之间将出现色差，该像差将由偏移到扫描位置的面检测器的数据引起，对于高分辨率图像而言该像差相对于照明斑的直径以小增量来移动。只有在面检测器相对于所有颜色通道的光轴以亚像素精确度进行调节，单独颜色通道的图像才能相互配合。

DE 102013019378 A1提出了使得能够对从EP 2317362 A1已知的显微镜进行颜色分析的发展，其中两个空间分辨的面检测器由两个光纤束形成，该光纤束将辐射引导到具有多个检测器元件的检测器。检测器元件中的一半连接到一个光纤；另一半连接到另一光纤。光谱划分元件确保了两根光纤接收在不同光谱通道中的辐射。因此，以极大程度上降低空间分辨率为代价来获得颜色信息。随着颜色数量的增加，这个问题变得更糟。

DE 102012204128 A1、DE 102013015931 A1、DE 102013015932 A1、DE 102013019347 A1、DE 102013019348 A1、WO 2013/135487 A1和DE 102013015933 A1发展了EP 2317362 A1的构想。

在随后公开的德国申请DE 102014111167 A1中描述产生至少两个色调图像的艾里扫描显微术的发展。

技术实现要素：

本发明的目的是发展前面所陈述的类型的方法和显微镜，使得在减少或甚至不调节多个颜色通道的费用同时尽可能不降低所获得的空间分辨率的情况下可以获得颜色信息。多个颜色通道应该也是可能的。

根据本发明，由样品的高分辨率扫描显微术的方法来实现这个目的，其中样品由照明辐射激发以发射荧光辐射；其中将照明辐射聚焦到样品中或样品上的一点以形成衍射受限照明斑，将该点以衍射受限方式成像到空间分辨检测器装置的检测区域上的衍射图像；其中检测区域具有限定检测器装置的空间分辨率的空间通道，该分辨率分辨衍射图像的衍射结构，该检测器装置具有用于检测衍射图像的辐射的检测器元件；其中对于多个空间通道中的每一个而言，引导在这些通道中的辐射在光谱上被分到多个光谱通道中并且再合并在一起以形成混合通道；其中源自不同空间通道的辐射合并到每个混合通道且来自各种光谱通道的辐射也合并到多个混合通道，并且将每个混合通道引导到检测器元件中的一个；其中相对于该样品，该点以比照明斑的一半直径小的增量位移到不同扫描位置中，对于每个扫描位置，从检测器元件读取强度数据，并且从该强度数据和分配到其的扫描位置来产生样品的图像，所述图像具有增加而超过用于成像点的分辨率极限的分辨率；其中对于每个检测器元件考虑辐射的空间通道和光谱通道，并且以多光谱方式来产生样品的图像。

特别地，提供了样品的高分辨率扫描显微术的方法，其中样品由照明辐射激发以发射荧光辐射；其中将照明辐射聚焦到样品中或样品上的一点以形成衍射受限照明斑，将该点以衍射受限方式成像到空间分辨检测器装置的检测区域上的衍射图像；其中检测区域具有限定检测器装置的空间分辨率的空间通道，该分辨率分辨衍射图像的衍射结构，该检测器装置具有至少与空间通道一样多的检测器元件；其中衍射图像的辐射(其入射到空间通道)被引导到检测器元件，检测器装置具有光谱分束和混合装置，其将在各个空间通道中所接收的辐射分离到多个光谱通道中；其中对于光谱通道中的每一个，空间通道单独地分配到检测器元件，使得多个检测器元件接收在不同光谱通道中的辐射和来自不同空间通道的辐射；其中相对于该样品，该点以比照明斑的一半直径小的增量位移到不同扫描位置中，对于每个扫描位置从检测器元件读取强度数据，并且从该强度数据和分配到其的扫描位置来产生样品的图像，所述图像具有增加而超过用于成像点的分辨率极限的分辨率；其中对于每个检测器元件考虑分配到给定检测器元件的空间通道和光谱通道，并且以多光谱方式来产生样品的图像。

由高分辨率扫描显微术的显微镜来进一步实现这个目的。该显微镜包括样品空间、光学单元、照明装置、成像装置、空间分辨检测器装置、扫描装置、评估装置，该样品空间用于接收样品(其可被激发以发射荧光辐射)；该光学单元具有位于样品空间中的焦平面和分辨率极限；该照明装置具有用于接收照明辐射的入口，并且以照明辐射经由光学单元来照明样品空间，使得该光学单元将照明辐射聚焦到焦平面中的一点以形成衍射受限照明斑；该成像装置用于由光学单元将焦平面中的点衍射受限地成像到衍射图像；该空间分辨检测器装置具有在与焦平面共轭的平面中的检测区域，其中该检测区域具有限定检测器装置的空间分辨率的空间通道，该分辨率分辨衍射图像的衍射结构，该检测器装置具有用于检测衍射图像的辐射的检测器元件，该检测器装置具有分束和混合装置，其对于多个空间通道中的每一个，将引导到其的辐射在光谱上分离到多个光谱通道中并且再将这些合并在一起以形成混合通道，其中该分束和混合装置将源自不同空间通道的辐射合并成各个混合通道且还将来自各种光谱通道的辐射合并到多个混合通道中，并且将每个混合通道引导到检测器元件中的一个；该扫描装置用于将该点以比照明斑的一半直径小的增量位移到不同扫描位置中；评估装置用于从检测器元件来读取强度数据和分配到其的扫描位置，并且从该强度数据和分配到其的扫描位置来产生样品的图像，所述图像具有增加而超过光学单元的分辨率极限的分辨率，其中该评估装置针对每个检测器元件考虑供应有辐射的空间通道和光谱通道，并且以多光谱方式产生样品的图像。

特别地，提供了用于高分辨率扫描显微术的显微镜。该显微镜包括样品空间、光学单元、照明装置、成像装置、空间分辨检测器装置、扫描装置、评估装置，该样品空间用于接收样品(其可被激发以发射荧光辐射)；该光学单元具有位于样品空间中的焦平面和分辨率极限；该照明装置具有用于供应照明辐射的入口，并且以照明辐射经由光学单元来照明样品空间，其中该光学单元将照明辐射聚焦到焦平面中的一点以形成衍射受限照明斑；该成像装置用于由光学单元将焦平面中的点衍射受限地成像到衍射图像；该空间分辨检测器装置具有在与焦平面共轭的检测器平面中的检测区域，其中该检测区域具有限定检测器装置的空间分辨率的空间通道，该空间分辨率分辨衍射图像的衍射结构，该检测器装置具有用于检测衍射图像的辐射的检测器元件，该检测器装置具有至少与空间通道一样多的检测器元件，其中将衍射图像的辐射(其入射在空间通道上)引导到检测器元件，检测器装置具有光谱分束和混合单元，其将在各个空间通道中所接收的辐射在光谱上分到多个光谱通道中，其中该分束和混合单元针对光谱通道中的每一个将空间通道单独地分配到检测器元件，使得多个检测器元件接收在不同光谱通道中的辐射和来自不同空间通道的辐射；该扫描装置用于将该点以比照明斑的一半直径小的增量位移到不同扫描位置中；该评估装置用于从检测器元件来读取强度数据和分配到其的扫描位置，并且从该强度数据和分配到其的该扫描位置来产生样品的图像，所述图像具有增加以超过光学单元的分辨率极限的分辨率，其中该评估装置考虑分配给每个检测器元件的空间通道和光谱通道，并且以多光谱方式产生样品的图像。

从EP 2317362 A1已知且在此描述的显微镜和方法所基于的原理在检测平面中记录多个空间通道中的辐射。所述空间通道的尺寸使得衍射图像的衍射结构被分辨。为了实现空间分辨率，在专用的射束路径中检测每个空间通道的辐射。分束元件将多个空间通道的辐射分开到多个光谱通道中，并且然后将来自各种通道(优选的各种空间通道和各种光谱通道)的已分开的辐射进行混合以形成新的独立射束路径，即混合通道。因此，混合通道包含不同光谱通道中的辐射以及同时来自不同空间通道的辐射。然后混合通道中的每一个终止在检测器元件中，其测量在混合通道中的辐射的总强度。已知检测器元件从结合的空间通道与光谱通道接收辐射。使用该信息，信号分析过程可以获得空间数据(其超过了成像的衍射极限)和颜色数据的二者。

通过在光谱上将所接收的辐射分离到多个空间通道的多个光谱通道中来完成混合。在这个阶段，多个光谱通道可用于每个空间通道。然后，将这些光谱通道合并回到混合通道，理所当然，其中并不是一个空间通道的光谱通道再次结合，而是不同空间通道的光谱通道和/或不同光谱通道的空间通道重新结合。因此，分束和混合装置针对光谱通道中的每一个将空间通道单独地分配到检测器元件。然后，多个、特别是所有检测器元件接收在各种光谱通道中且来自各种空间通道的辐射。

这个光谱信息和空间通道的混合或重新分布可以在物理上被认为是对点扩散函数(PSF)的操纵。在检测区域上，通过成像或光学单元以衍射受限方式(例如已经提到的艾里斑(Ariy disk)的形式)来提供点扩散函数。目前，当将辐射发送到辐射敏感的检测器元件时，通过重新分布空间通道和光谱信息以如下方式来操纵该点扩散函数：在辐射敏感的检测器元件上混合颜色信息和空间信息，使得该颜色信息和空间信息与检测区域和针孔平面中相比不同地分布。然后，因为由于将扫描位置彼此间隔开的小增量，将样品中的点状发射器的每个衍射图像多次成像在检测区域上的不同位置处，并且由已经通过重新分布操纵的点扩散函数来捕获，所以解混和重构总是可能的且没有问题。

光谱分离的质量实质上由在光谱分束和混合元件中的光谱分割来支配，而不是在获得数据信息(即，基于数据的解混)时的误差来支配。作为示例，可以在检测器平面中(即，检测区域位于的平面中)由光纤耦合器进行混合，因此可以以虚拟地无串扰的方式来平行放置空间通道的射束路径，并且可以如所期望那样将该空间通道的射束路径重新分布。随后，存在光谱分束，即对于单独空间通道的色彩分割。

理想地，空间通道的光谱通道然后再混合在一起，使得合并到混合通道中的光谱通道的有效点扩散函数区别尽可能地大。这样，为获得空间和颜色信息(解混)而形成的方程组包含许多线性无关方程。

根据本发明的程序包含从一个检测器装置获得光谱数据，而不减少空间通道的数量。最终，空间通道的数量影响了如何超过光学单元的空间分辨率来很好地分辨所产生的图像。在先技术的方法中，其中专用检测器用于每个光谱通道，检测器元件的数量等于空间通道的数量和光谱通道的数量的乘积。相比之下，本发明优选的是：所采用的检测器元件的数量小于该乘积。特别优选地，检测器元件的数量等于空间通道的数量。

例如，可以在本发明的范围内从仅仅一个单光谱通道和一个单空间通道的辐射为一些检测器元件馈送辐射，例如以便于产生可以用于归一化的光谱参考信号或中性参考信号。然而，鉴于最大的空间和光谱分辨率，每个检测器元件可优选地从至少两个光谱通道(优选地从所有光谱通道)来接收辐射。

从在先技术已知的方法是使用检测器来记录衍射图像，通过提供形式为光纤束的重新分布元件，其中入口分面位于该束的入口区域并且形成检测区域，在该检测区域中，检测器的几何结构偏离了所需要的像场。因此，光纤的入口分面限定空间通道。在这个已知构想的发展中，光谱分束和混合装置设置在光纤的下游且具有单独分束元件，其中将单独分束元件分配给每个空间通道，使得每个光纤将因此引导的相应空间通道的辐射引导到单独分束元件中的一个，并且这个分束元件将这个空间通道的辐射分到光谱通道中。随后，然后可以像自由射束光学一样将辐射引导到具有检测器元件的检测器，其中布置该检测器元件的几何结构和布置单独分束元件的几何结构是相互匹配的。作为示例，如果检测器现在被用作检测器，则单独分束元件也按行排列。替代地，可以将辐射耦合到在单独分束元件之后延伸的光纤中，并且然后这些光纤中的每一个通向检测器元件中的一个。

当在圆形光阑处衍射光束时，出现艾里斑。其呈现为中心极大的艾里斑，由逐渐减少辐射强度的环围绕该艾里斑。即使根据几何光学定律是理想的显微镜(即，甚至没有成像像差)也不可能将点准确地成像在一点，而是由于孔径处光的衍射成像为模糊斑。这称为衍射受限成像。相同道理适用于点的衍射受限照明的情况。在经典射束光学中，如果将两个点的图像在衍射图像中的最大值以至少艾里斑的半径r来间隔开，则可以根据所谓的瑞利判据将两个点分开。斑的形状具有与孔径的形状成倒数的关系，特别地该斑的尺寸与孔径的尺寸成反比例。艾里斑的尺寸来自于第一类贝塞尔函数的第一零点，其大约处于r＝0.6098。以英国天文学家乔治·比德尔·艾里(George Biddell Airy)命名艾里斑(即，中心衍射斑)。在扫描显微镜中，由光学单元的圆形安装件给定的孔径在照明中和成像中是圆形。因为艾里斑的尺寸还取决于波长，所以用于激发目的的衍射受限照明与用于斯托克斯位移(即，较长波长的荧光辐射)相比，艾里斑的尺寸更小。术语“衍射受限”这里旨在不限于根据阿贝理论的衍射极限，但是还覆盖了出于实际不足或限制的原因理论最大值损失了20％的情况。这里，单独图像甚至具有被称为衍射结构的结构。它是过采样的。

因为，根据EP 2317362 A1的重构方法中，由于具有小于照明斑的尺寸的增量的扫描位移，样品中的每个单独点可获得多个测量，这产生了建立且求解的超定方程组。所以，不仅可以来获得具有高分辨率的单独点的轨迹性质和强度，而且可以获得光谱区域(即，颜色)的具体说明。

根据本发明的构想还可以针对多个斑以平行形式来同时执行，如已知的激光扫描显微术。然后，扫描样品上的多个斑，并且多个斑的单独图像彼此邻近地静止在检测平面中。以示例性方式，以下描述专注于单一点斑扫描。然而，这不应该理解为是限制，并且所解释的特征和原理还等同地适用于多个点斑的平行扫描和线斑的使用。理所当然，线斑仅仅在横向于线的方向上衍射受限，并且因此本说明书在该方面的特征则仅仅在一个方向上(横向于线的范围)适用。

如在典型的LSM中，以扫描的方式实现样品的期望区域的成像。因为照明和成像装置或对应的装置具有公共的光学扫描装置(其将照明斑引导在样品上，并且同时关于检测器来扫描与照明斑重合且在该处样品成像的点)，所以可以将变焦光学单元放置在照明和成像装置的公共部分中。所述单元允许将衍射图像适配于面检测器的尺寸，并且附加地允许，在安装件上没有吸收的情况下，将可用的照明辐射完全地耦合到物镜光瞳中，该物镜光瞳的尺寸可以随着物镜的选择而变化。

单独图像的衍射结构的分辨率附加地允许检测斑的移动方向，在扫描样品时，斑沿着该移动方向位移。尽管原则上从扫描仪的机制(例如扫描反射镜或可移动扫描台的机制)得知该移动方向，但是由于机械的原因存在残留不准确性。可以借助于通过互相关来评估检测器阵列的单独像素的信号来消除这些残留不准确性。这里，使用如下事实：虽然由于照明点的衍射受限成像，样品中相关的邻近图像像素以一定程度重叠，但是该照明点中心彼此邻近。如果这种图像像素的信号经受互相关分析，则可以减少或完全地消除残留不准确性，其由于扫描机制的不可避免的公差而保持。

在这里所描述的方法的情况下，在显微镜的操作期间，例如控制装置的评估装置实施这些方法步骤。

理所当然地，在不会背离本发明的范围的情况下，上述特征以及下面将要解释的那些特征可以不仅以所指定的组合来被使用而且以其他组合来被使用，或以它们自身来被使用。

附图说明

下面例如基于公开了本发明必要特征的附图来更详细地解释本发明。附图中：

图1示出了高分辨率显微术的激光扫描显微镜的示意图；

图2示出了如何将辐射从各种空间通道和各种光谱通道混合在图1所示的显微镜的检测器元件上的示意图；

图3示出了输入到图1的显微镜的检测器装置的点扩散函数的示意图，针对两种颜色描绘点扩散函数；

图4示出了从图1中所示的显微镜的分束和混合装置产生的点扩散函数的示意图；

图5示出了图1中所示的显微镜的分束和混合元件的实施例的示意图；以及

图6示出了由图1中所示的显微镜执行的显微术方法的流程图，该显微术方法用于在至少两个光谱带之间区分的高分辨扫描显微术。

具体实施方式

图1示意性示出了配置为用于样品2的显微术的激光扫描显微镜1。激光扫描显微镜(下面称为LSM)1由控制装置C控制并且包括照明射束路径3和成像射束路径4。照明射束路径照明在样品2上的斑，并且成像射束路径4以衍射受限方式来成像所述斑，用于检测。照明射束路径3和成像射束路径4共享光学单元。

使用所提供的激光射束5在LSM1中照明样品2，经由偏转反射镜6(其在其他情况下在功能上不是必要的)和透镜7将该激光射束5耦合到反射镜8。反射镜8确保激光射束5以一反射角入射在输入耦合元件(例如，发射滤波器9)上。为了简明，针对激光射束5仅描绘了主轴。

在激光射束5在发射滤波器9反射之后，由扫描仪10将该激光射束5双轴地偏转，并且使用透镜11和12且穿过物镜13将该激光射束5以衍射受限照明斑14的形式聚焦在样品2中的焦平面29中。这里，图1中的图示中的照明斑14是点状的，然而线形式的照明斑也是可能的。将在照明斑14的位置(例如点)处所激发的荧光辐射引导离开焦平面29经由物镜13以及透镜11和12而回到扫描仪10，这之后在成像方向上再次呈现静态光束。该射束穿过发射滤波器9，该发射滤波器9在此附加地具有如下功能：关于该荧光辐射的波长来选择照明斑14中的荧光辐射，并且阻挡激光射束5的可以例如用作激发辐射的照明辐射。此外，提供了用于阻挡照明辐射的可选的发射滤波器15。总体上，透镜16确保将照明斑14的位置成像到位于检测平面18中的衍射受限衍射图像17。检测平面18是与焦平面29共轭的平面，样品2中的照明斑14位于该焦平面29中。

由检测器装置19将照明斑14的衍射图像17记录在检测平面18中。这空间地分辨斑14在检测平面18中的衍射受限图像17，即实现了针孔平面中的过采样。

控制装置C控制LSM1的所有部件，特别是扫描仪10和检测器装置19。正如下面将要解释的那样，控制装置针对不同扫描位置捕获每个单独图像17的数据、分析其衍射结构并且产生样品2的高分辨率完整图像。

作为示例，图1中的LSM1图示为用于样品上被扫描的单一照明斑14。然而，LSM1还可以同时用于根据垂直于图1的附图平面延伸的线照明斑的扫描。图1中的LSM1还可以配置为使得在样品中扫描彼此邻近地设置的多个点照明斑。在该情况下，它们对应的衍射图像17同样彼此邻近地设置在检测平面18中。然后，检测器装置19对应地配置为检测衍射图像17，该衍射图像17彼此邻近地设置在检测平面18中。

检测器装置19包括光纤束20，该光纤束20在插入分束和混合单元30的情况下馈送至检测器阵列24。光纤束20由单独光纤21构成。光纤21的入口分面26形成光纤束入口，该光纤束入口位于检测平面18中。光纤21的入口分面26因此提供了空间通道或像素的入口，通过该空间通道或像素的入口接收照明斑14的衍射图像17。

作为示例，由于图1的实施例中的照明斑14是点斑，衍射图像17是艾里斑，该艾里斑的范围位于图1中检测平面18所示出的圆内。应当注意的是，图1包含在这方面的简化。光纤束入口的范围很大，以致于覆盖了衍射图像17的范围。

光纤束20中的单独光纤21采用它们的输出连接到分束和混合装置30，图5中示出了分束和混合装置30的实施例。从那里，具有光纤28的另外的光纤束27延伸到例如拉长的插头23，其中光纤28的输出侧端彼此邻近。插头23具有匹配于检测器排24的几何布置的实施例，即光纤28的每个输出侧端正好位于检测器排24的检测器元件25的前面。

参考如下事实：关于分束和混合装置30的耦合和集成，检测器装置19的实施例是示例性的。原则上，检测器装置19就足够了，该检测器装置19承担在检测平面18中的衍射图像17的过采样并且经由分束和混合装置30将因此创建的空间通道引导到检测器元件25。特别地，这还可以是具有实现检测器元件的像素的矩形检测器区域。

在没有分束和混合装置30的情况下，在焦平面29中由照明斑14所照明的点的衍射受限成像的情况下，由于物镜13的圆形孔径将在相关联的共轭检测平面18中出现为艾里斑的衍射图像17。在本说明书的总则部分已经解释了如何形成这种艾里斑。如在EP 2317362 A1中所描述的显微镜技术中，通过过采样并且与具有相对于照明斑14的最小尺寸较小的增量的扫描位置结合分析衍射图像17的结构，可以存在超过衍射受限成像的分辨率极限的结构分辨率。

为了解释这个原理，两个假设位置被认为在焦平面29中紧密地在一起，以致于他们不能在衍射受限分辨率内被分辨。当采用相对于照明斑的直径较小的增量来扫描照明斑14(其在该假设位置实验中是圆形)时，两个位置中的一个首先进入照明斑。衍射图像17中的辐射强度随着该第一位置越来越多地进入照明斑14而增加。由于照明斑14的衍射受限性质，照明斑14具有朝中心增加的强度。因此，衍射图像14中的辐射的强度增加到被认为的第一位置越来越多地移动到照明斑14的中心的程度。一旦照明斑14的中心已经迁移超出被认为的位置，那么来自该第一位置的辐射的强度再次降低。如果不存在邻近的假设位置的第二位置，那么衍射图像17中的辐射强度将会再次衰减，衍射图像17中的辐射强度正好与照明斑14的照明强度的分布(考虑到增量和第一位置的荧光灵敏度)相关地增加和降低。然而，由于第二位置呈现得非常靠近，因此该第二位置同样地开始将荧光辐射增加到衍射图像17，更加精确地说，照明斑14的中心越靠近那里。在其他情况下，与应用于第一位置正好一样的相同原理自然地应用于第二位置。总体上，在衍射图像17中获得增量位置的照明强度，该增量位置与只呈现单一荧光位置相比不同。即使仅以衍射受限分辨率不可分辨这两个位置，但是通过评估面检测器19的数据并且考虑当前扫描位置，因此可以数学地检测两个位置在焦平面29中发荧光以及还有它们之间的间隔。对本领域技术人员已知的技术实施方式中，出于评估面检测器19的数据的目的，针对每个扫描位置来建立方程，所述方程包含多个未知数，特别是焦平面29中位置的强度和间隔。由于多个扫描位置，获得超定的方程组并且该方程组允许确定荧光位置的辐射强度和间隔(即，因此还确定了荧光位置的位置)。这将在下面更进一步地解释。

分束和混合装置30操纵给定在检测平面18中的点扩散函数。射束轮廓逐个空间通道地(逐个像素地)重新分布。为了使该重新分布更加容易理解，在具有十个空间通道的情况下，两个色调的光谱数据(即，两个光谱通道的使用)被认为是简单示例。使用阿拉伯数字1至10指示空间通道。十个空间通道对应于十个检测器元件25，为了解释通过I至X将其编号。相似地，光纤束20那么具有总共十个输入分面26，换言之，十个空间通道通向分束和混合装置30。分束和混合装置30将这些空间通道中的每一个分成两个光谱通道(例如红色光谱通道R和绿色光谱通道G)中。然后，分束和混合装置30将来自两个不同空间通道的两个不同光谱通道(总是成对的)混合，并且因此形成十个混合通道。将这些十个混合通道引导到检测器元件25。图2示意性示出了在该情况下所获得的状态。在此，具有编号I......X的十个检测器元件25示意性地描绘为盒，对于该检测器元件25中的每一个，将来自不同空间通道的光谱通道R和光谱通道G重新组合。在检测器排25下方描绘的是编号1至10的空间通道，光谱通道G的辐射源自于该编号1至10的空间通道。在检测器排24上方描绘的是对应的编号1至10的空间通道，光谱通道R的辐射源自于该对应的编号1至10的空间通道。作为示例，具有编号I的检测器元件25包含来自空间通道编号1的绿色光谱通道G以及来自空间通道编号6的红色光谱通道R。

图3和4示出了逐个空间通道地再分类的效果。图3以简化的形式示出了检测器平面18中的点扩散函数，作为具有编号1至10的空间通道上的线性截面示意图。在此，点扩散函数32a应用于红色光谱通道R，点扩散函数32b应用于绿色光谱通道G。分束和混合装置在这些点扩散函数上的效果可以参见图4。红色光谱通道R的点扩散函数现在基本上不同于绿色光谱通道G的点扩散函数。

作为示例，如果扫描期间照明斑在检测区域18之上迁移，在编号为I至X的单独检测器元件25处强度减少或增加的顺序，对于在红色通道R中发荧光的物点而言相对于对于在绿色通道G中发荧光的物点而言显著地不同。举例而言，在红色通道R的情况下，编号为I至III的检测器元件25将首先指示高辐射强度，之后跟随着其他检测器元件25；然而，在绿色通道G中发荧光的物点的情况下，编号为IV至VI的检测器元件将首先指示高强度。

由于点扩散函数的这种强烈的颜色相关调制，在建立方程组时，可以简单解混在检测器排25上的颜色信息。充当评估装置的控制装置C知道分束和混合装置30在分束和混合期间进行的分配，因此控制装置C不仅在图像产生期间产生具有超过显微镜1的光学分辨率的空间分辨率的图像，而且同时供应关于光谱通道的信息。

理所当然，基于具有两个颜色通道和十个空间通道以及十个检测器元件25的图2和4的解释仅是示例性，并且应该仅用于理解本发明的原理。理所当然，还可以使用更大数量的颜色通道以及不同数量的空间通道和检测器元件。

图5以示例性方式示出了分束和混合装置30的可能实现方式。其包括输入耦合器31，将光纤束20的光纤21耦合到该输入耦合器31。如图5所示的，光纤21已经可以进行再分类，使得所期望的空间通道彼此邻近地位于输入耦合器31处。那么，光纤束20是分束和混合装置30的功能零件。

从输入耦合器31，将每个空间通道中的辐射32引导到单独分束元件(例如不同棱镜34和35)的排33。这里对于两个颜色通道R和G再次以示例性方式所描绘的，这些棱镜将辐射引导到输出耦合器34，将光纤28连接到该输出耦合器34。在根据图5的设计中，这些光纤28通向单独检测器元件25。应该示出的是，一组单独的(即独立的)检测器元件25还可以用来代替检测器排24。替代地，还可以由检测器排替换输出耦合器34。然后，单独分束元件34、35的排33应该可选地由下游光学单元(例如微型透镜光学单元等)来补充，该下游光学单元将辐射引导到检测器排。

分束和混合装置30从空间通道将辐射分到不同光谱通道(在这种情况下，光谱通道为R和G)中，并且将分开的辐射再混合在一起使得获得了混合的通道。作为示例，图5的图示中最下面的通道包含源自一空间通道的辐射32中的红色光谱通道R，该空间通道连接到输入耦合器31的最下面的连接器。另外，该混合的通道包含源自被馈送到在输入耦合器31中直接位于上方的连接器的空间通道的辐射32的绿色光谱分量G，该空间通道。与由光纤束30完成的重新分布结合，这通过分束和混合装置30实现了实质上可自由确定的分开和重新分类。

为了更好地解释方程组构造的数学分析，首先，仅通过引入来考虑没有分束和混合装置30的情况。如果O(r)表示物、E(r)表示激发的点扩散函数(PSF)、以及H(r)表示检测的PSF，对于每个像点，获得下面公式来作为信号D(r，p)，其中r表示与照明斑的位置p的距离：

相对于位置p的D(r，p)的傅里叶变换为：

D(r，ω)＝O(ω)FT_r′{E(r′)H(r′+r)}

在实空间中的乘积变成了以下傅里叶空间中的卷积：

如果在位置r处引入支撑函数：

EH(r，ω)＝FT_r′{E(r′)H(r′+r)}

则从公式(2)得出以下公式：

D(r，ω)＝O(ω)EH(r，ω)

(3)

通过Wiener滤波器将面检测器上的不同位置r结合(参见http://en.wikipedia.org/wiki/Wiener_deconvolution)，

其中(|O(ω)|²>和<|n(ω)|²＞是信号(“O”)的和噪声(n)的对应的光谱功率密度。

艾里扫描显微术中重新结合的公式(2)应用于一种颜色(下面，术语“颜色”用作术语“光谱通道”的更简化表述)。在每个位置r处混合多个颜色，其中加权因子起到分束和混合装置30将单独光谱通道和空间通道结合到混合通道的作用。然后，获得以下公式：

这里，b是偏移，并且B(ω)是偏移光谱；

偏移可以被认为是附加的颜色O_c+1(ω)＝b，该颜色的权重是EH_c+1(r，ω)＝B(ω)。因此，公式(5)可以改写为以下形式：

可以通过对于每个频率EH_c+1(r，ω)＝B(ω)的线性回归来解混颜色。

考虑O_x(ω)的值而最小化公式(8)导致每个频率EH_c+1(r，ω)＝B(ω)的线性方程组：

如果偏移被展开，获得以下公式：

其中x穿过将要分辨的所有颜色。在矩阵形式中，公式(9)读取如下：

这里，例如，A(ω)是切趾滤波器。

如果仅呈现一个颜色，以类似于公式(4)的方式来获得以下公式：

由矩阵限定颜色分辨率能力。在受噪声影响的数据的情况下，矩阵的行/列必须是线性无关的，以分辨颜色。如果不同颜色的点扩散函数是不同的，则这已经得到满足。基于使用两个颜色的示例的图3和4，已经对这进行了解释。在该情况下，可分辨的颜色的数量比增量位置r的数量小一个。

在带噪声的数据的情况下，由矩阵的条件数给出可解性的鲁棒性。总体上，矩阵S的条件数限定为κ(S)＝||S||||S^-1||。这里，||·||指示矩阵的范数。条件数越多，相对于输入数据误差(即，相对于噪声)的解的弹性越小。对于无噪声的数据，有限条件数(即任意小于无限的大小的数值)将已足够用来分辨颜色。然而，实际中呈现受噪声影响的测量数值，这就是为什么矩阵设计为使得其具有尽可能少的条件数。为了实现这个设计，由于分开和混合由颜色的单独点扩散函数所产生的各种颜色的贡献中的差异，应该在每个检测器元件处尽可能大。在图4的示例中，这由点扩散函数的近似正交设计来实现。

作为更通常的规则，将为每个颜色指定分配函数，所述分配函数连接点扩散函数内的检测位置r与检测器元件25的数量，该检测器元件25的数量由n给定：n＝M_c(r)。在此，检测器元件的几何结构不重要；特别是，所描述的排状的检测器元件是可能的。然后，以下公式出现作为检测器元件n上的混合通道的信号：

这里，还未设定分配函数。为了选择在公式(15)中出现的分配函数M_c(r)，或者其求逆应该以矩阵的条件数尽可能小的方式来做出选择。如果鉴于分配函数各个颜色对所有检测器元件n和对所有频率ω的贡献差异变成极大的，则实现该选择。这引出以下公式：

可以基于该公式简易地限定分配函数，即分束和混合装置30的效应。作为示例，图5的构造中，以公式16最大化的方式来选择单独光纤21的互换(即，它们在输入插头31处的分配)和单独分束元件33的效应。

由公式(16)所提供的的措施是用于分配的选择的一种可能条件。另外，同样适用替代的分配标准。作为示例，代替对频率ω的积分，还可以限定某一频带，颜色分离在该频带中比其他频带中更加灵敏。最终，关于分束和混合装置如何必须将光谱上分开的空间通道合并到混合通道并且应该如何完成解混，公式(16)或替代的程序提供清楚的分配规则来由本领域技术人员实施。

以示例性方式，图6示出了例如可以由来自图1的显微镜执行的显微术方法的流程图。在步骤S1中，如本领域技术人员从前述EP 2317362 A1已知的，执行传统艾里扫描显微术。也就是说，以衍射受限方式照明样品上的点，并且将该点以多个扫描位置的衍射受限方式成像在与焦平面共轭的平面上。

在步骤S2中，在各种空间通道中分辨衍射图像。该步骤S2还可以理解为像素化。因此，对于每个空间通道产生专用射束路径。

在步骤S3中，空间通道的这些单独射束部分在颜色上分开，分开的数量设定光谱通道的期望的数量。

在步骤S4中，以预定方式将分开的光谱通道合并回混合通道。在上面基于公式(16)的微分来解释用于选择该混合过程的标准。

随后，步骤S5中，检测在混合通道中的辐射，并且评估信号以产生高度分辨的多光谱图像。

对于上面图示的构想，以下的偏离或增强是可能的。

就上面仅描绘两个颜色通道R、G来说，这仅仅是示例性的。理所当然，可以等同使用更大数量的颜色通道。

步骤S2中分开到空间通道中、步骤S3中颜色分开和步骤S4中限定的混合还可以以组合方式来组合或者以不同顺序部分地执行。基于图5对以下提供解释：通过光纤束20的合适配置及其到分束和混合装置30的分配，空间通道的再分类已经可以是步骤S4的限定的混合的部分。重要的是，不依赖于空间通道的射束路径形成，在颜色上分束并且再次以不同方式混合。图5的实施例中，该混合过程已经由光纤束20的参与来准备。然而，这是可选的。作为示例，例如通过使用光纤组合器，还可以在光谱分束之后切换至其他光纤束中，所述其他光纤束将不同光谱通道合并入所期望的混合中。

在与焦平面29共轭的平面中光纤耦合器的使用致使可以以无串扰方式使空间通道并行。此外，首先形成空间通道并且然后执行光谱分束和混合是有利的，是由于分到大量的多个光谱通道中是较容易的。然而，凭借于通过在与焦平面20共轭的平面的上游的色彩分离器将辐射分离到多个光谱带中，还可以将光谱分束和空间通道形成的顺序互换，即交换步骤S3和S2。然后，例如由检测器元件25处的多次占用，可以将这些射束通过微型透镜成像在光纤束中，然后在空间中再次混合在一起。

上面描述了所有空间通道(即衍射图像17的所有辐射)经受光谱分束和混合的过程的实施例。然而，凭借这些甚至未经由分束和混合装置30进行引导的或者凭借将一个或空间通道的辐射再次合并入一个混合通道中的分束和混合装置30，还可以留下未改变的单独或多个空间通道。这可以是有利的，例如以便进行强度参考。

上面存在对于每个混合通道包含不同光谱通道的辐射的进一步解释。鉴于解混，有利的是，其中如果每个混合通道包含仅来自不同光谱通道的辐射，则是特别地有利。然而，在此同样的是，如果多个相同光谱通道与源自不同空间通道的辐射一起合并入单独混合通道中，则可以有利于参考或归一化信号。

除了所描述的产生高分辨的图像的操作模式以外，显微镜1还可以以不产生高分辨图像而只产生光谱的方式进行操作。至此，针对扫描位置读取检测器元件25的强度数据，并且考虑分配到每个检测器元件25的光谱通道来获得样品的光谱。