本申请要求于2015年11月1日提交的美国临时专利申请62/249,342、于2016年1月22日提交的美国临时专利申请62/286,108、于2016年1月23日提交的美国临时专利申请62/286,317，以及于2016年1月28日提交的美国临时专利申请62/288,122的优先权。美国临时专利申请62/249,342、62/286,108、62/286,317和62/288,122的公开内容通过引用并入此文。
本发明涉及显微镜，尤其涉及具有大视场的高分辨率双光子显微镜(tpm)。
背景技术：
双光子显微镜(tpm)即便在散射组织中成像时也可以提供高分辨率和高对比度。tpm可用于分辨单个细胞，例如在组织中达到1毫米深的神经元和亚神经元结构。tpm已被广泛用于测量完整脑内的神经元群体中的动态过程，例如钙动力学，甚至是在动物行为期间。多达数百个神经元被同时成像，但很大程度上局限于单个脑区域内的半毫米数量级的视场。
在点扫描的激光扫描显微镜(lsm)中，聚焦激光在三维空间内在样品上移动。在垂直于扫描光束的光轴的平面(x-y平面)中可以相对容易地实现激光扫描，但激光扫描沿着光轴(z)更具挑战性，激光扫描平行于光束的方向更具挑战性。在很多显微镜中，要沿光轴扫描光束，物镜会物理移动以改变焦点的z位置，但这涉及移动较大的物体，因此速度相对缓慢，限制了能够采集的图像类型以及实际可以设计的显微镜的类型。或者，支撑样品的台架可以沿着光轴移动，同时物镜的位置保持固定，但是这也涉及移动大的物体。
在保留细胞分辨率的同时，几类应用将从具有更大视场的显微镜中受益。即使是相对简单的动物行为也涉及多个大脑区域，这些大脑区域通常是非连续的。探索在空间上分离的这些大脑区域的相互作用需要几乎同时对多个大脑区域进行成像。在灵长类动物中，感兴趣的皮质区域通常在脑回中相隔几毫米。其他应用包括追踪发育胚胎中的细胞结构。使用标准显微镜不可能同时对多个大脑区域进行成像。高分辨率显微镜具有小视场，而大视场显微镜不具有细胞分辨率。神经活动的敏感蛋白质指标(如钙指标)和表达这些指标的转基因动物的出现为中尺度成像开放了可能。要注意的是中尺度显微镜定义为成像时具有细胞分辨率和跨越多个大脑区域或整个有机体(几毫米)的视场。
技术实现要素：
根据一个实施例的中尺度显微镜在本文中被描述为包括大约5mm数量级或更大的视场，其允许，例如对几乎共面的小鼠脑中的大部分皮层区域采样。显微镜具有更好的细胞分辨率，这意味着显微镜的双光子激发体积远小于体细胞的标准尺寸(例如，直径约为10μm)。对于一些实施例，选择0.6的显微镜激励的数值孔径(na)，其提供大约0.5μm的横向分辨率和大于4μm的轴向分辨率。显微镜在激发光束波长范围内(例如，在910-1070nm的波长范围内(例如，在基于绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，gfp)和各种红色的荧光蛋白的荧光蛋白传感器使用双光子激发来激发的波长范围内))产生衍射受限的性能和高双光子激发效率，但是也可以采用其他激发波长。此外，例如，通过使用大于激发数值孔径(na)(0.6)的聚集物镜na，显微镜具有用于聚集荧光信号的高聚集效率。
中尺度扫描显微镜的关键挑战是速度。更快的扫描提供了更好的时间分辨率来测量神经活动，减少光损伤，以及追踪更多神经元的可能性。快速扫描方法可以使用多个共振镜和多个声光偏转器(aods)。然而，多个共振镜和多个aod都具有相对较小的扫描角，从而在样品平面内产生不会跨越整个视场的扫描。本发明的一些实施例通过使用具有多个顺序连接的扫描器的扫描引擎来解决该问题。例如，在一些实施例中，共振扫描仪(例如，具有24khz线速率)可以产生大约0.5毫米的快速扫描，而较慢的检流计扫描仪(例如，具有1khz线速率)可以提供跨越显微镜整个视场的偏转。这就允许以随机路径的方式在样品上移动快速共振扫描，以便对在广泛分散的大脑区域中的活动进行几乎同时采样。
另一个挑战是控制激发光束沿显微镜的光轴(z轴)的扫描。在典型的扫描显微镜中，通过移动激发物镜来控制显微镜焦平面的z轴位置，其发生速度比焦平面内的x-y扫描慢两个数量级或更多。这对于中尺度成像是不可接受的，因为在不同大脑区域内几乎同时采样的感兴趣结构可以在z方向上相差数百微米的焦平面中。然而，本发明的一个实施例通过实施快速形式的远程聚焦来解决该问题。
在双光子激发显微镜中，已经设计了多种用于大视场的仪器。tsai等人(“ultra-largefield-of-viewtwo-photonmicroscopy”，opticsexpress23：13833-13847)设计了基于现成组件的扫描系统，它会产生10mm的扫描场。stirman等人(“widefield-of-view,twin-regiontwo-photonimagingacrossextendedcorticalnetworks.”，biorxiv)使用了一个定制的物镜，它容许3.5mm的视场。但是，这两种系统都不能提供细胞级的分辨率。这些装置依赖于标准和慢速的检流计镜(例如，具有290hz的线速率)，这对于许多类型的功能成像来说太过缓慢。此外，显微镜仅校正一个激发波长(分别为800nm和910nm)，限制其用于荧光分子的一小团。这些显微镜具有对于荧光聚集来说相对小的数值孔径，与标准tpm显微镜相比，这降低了信号产出(即检测到的荧光光子的比例)并且使信噪比降低了数倍。最后，这些显微镜不能实现快速的轴向扫描。
本文公开了双光子随机路径中视镜(2p-ram)的设计、构造和表征，其提供具有显微镜可见的分辨率的随机路径容量。2p-ram可以在x方向和y方向上的大于5mm的视场范围内提供衍射受限的分辨率，在z方向上远程聚焦约1mm数量级或更多，并且提供组织容量的随机路径扫描。
显微镜特定实施例的规格包括：
·5mm视场(fieldofview，fov)——例如，对应于小鼠大脑的扁平部分。
·910-1070nm激发光-当使用双光子激发时，与基于gfp和基于红色荧光蛋白(rfp)的荧光分子均兼容。
·具有激发na＝0.6的衍射受限的分辨率(点扩散函数，大约横向x0.6μm轴向4μm)-小于一个神经元。
·聚集na＝1.0；用于高效率信号检测。
·对三重保护玻璃(450μm的玻璃)的完整的校正。
·针对双光子激发进行了优化——这意味着所有视场点穿过显微镜光圈的传播时间延迟差＜20fs(rms)。
·工作距离＞3mm。
·在整个fov中斯特列尔比(strehlratio)＞0.8。
·通过对超过＞700μm深度范围的整个横向视场完全光学校正，进行快速远程对焦——可能由于样本物镜(这是样本旁边的浸液物镜)和远程聚焦物镜的定制、匹配设计。
为了用显微镜在平面内扫描光束，使用与多个较慢扫描仪顺序连接的的共振扫描，其用作中继设备并且还允许我们在整个视场范围内移动共振扫描的光束(例如在样品平面中+/-600μm)。例如，可以使用来回扫描，其中一组扫描仪定位共振扫描fov扫描。使用扫描镜作为中继设备可以大大减少像差，并可以使有效地大扫描角度成为可能。
这里公开了一种新形式的远程聚焦，其允许我们在大约几毫秒数量级的时间段内在z方向上移动激发光的焦点超过1毫米，这允许扫描大的三维fov，当感兴趣结构位于相距mm级的不同焦平面内时，这是尤其有用的。由于许多感兴趣的样本(例如大脑)包括弯曲的结构，因此需要执行快速z聚焦。传统显微镜在大视场和高分辨率之间做出妥协。大脑和其他器官具有大约为几毫米或更大的尺寸，但它们的细胞组分具有大小在微米数量级的结构。为了以细胞分辨率成像整个脑结构，本文所述的显微镜可用于在活体内成像。在一个实施例中，显微镜被设计用于在大约5mm的视场上具有衍射受限的分辨率(横向0.5μm；轴向4μm)的双光子显微镜。选择fov的大小是因为它对应于从老鼠到灵长类动物的许多物种中大脑兴趣部分的大小。该显微镜符合带有独特功能的显微镜设计标准：
·在所有视场点上，显微镜孔径上的传播时间延迟差异较小，以保持较高的双光子激发效率。
·显微镜视场范围内斯特列尔比大于0.8。
·从激发绿色荧光蛋白的900nm到激发红色荧光蛋白的1070nm的大范围的激发波长达到以上标准。
·工作距离大于2.5mm，允许在没有空间障碍的情况下对＞1mm的脑组织进行成像。
·用于激发的高数值孔径，确保高分辨率的成像(例如，数值孔径na＝0.6)，提供亚细胞级的分辨率(横向0.6μm，轴向4μm)。
·用于荧光探测的数值孔径显著地高于用于激发的数值孔径(例如，na＝1.0)。
·对物镜和样品之间450μm的盖玻片进行完整的校正。厚玻璃的使用对于成像应用来说是典型的；2p-ram已经针对这种玻璃进行了校正。
·该扫描系统是基于顺序连接的两个扫描系统，以随机路径的方式在样品上用共振扫描系统产生的快速光栅扫描。这允许使用灵活且快速的扫描来获取整个视场。
·该系统采用了一种新颖的快速远程对焦形式。快速聚焦非常关键，因为大型结构很少是平面的，扫描深度需要随着横向扫描进行快速调整。
显微镜提供了大视场和高分辨率的独特结合，并且能够快速浏览比以前的显微镜大几个数量级的巨大的组织容量。
当样品物镜(so)(也称为激发物镜(eo))需要非常高的集光率时，例如对于0.6的na为和5mm直径的视场的多光子显微镜，可以在横向扫描光束之前将远程聚焦物镜(rfo)放置在光束路径中。这使rfo的集光率和尺寸、复杂性以及成本远远低于so。在其他实施方式中，可以在横向扫描光束之后将rfo放置在光束路径中。另外，rfo的光束路径下游的光学器件可以被制造成使得远程聚焦对于横向扫描是不变的，并且因此可以利用这种布置在大体积上实现衍射受限的聚焦。
请注意，术语集光率可以被认为是系统设计用于支持的光线的四维“体积”。对于在其视场(具有面积a)上具有恒定数值孔径(na)的显微镜，集光率由π*a*na2给出。假定成像性能在视场内是衍射受限的，则所支持的集光率与可获取的图像中可光学分辨的点(离散点)的数量成比例。
此外，远程聚焦是在具有非常大的视场的显微镜中使用的重要技术。首先，它允许整体光学设计具有相对较大的场曲；这个场曲可以通过远程聚焦动作实时补偿。例如，当在垂直于激发光的传播方向的平面中横向地扫描光束时，可以自动控制远程聚焦物镜以补偿激发光的光束路径中的光学器件的场曲，从而将激发光束的焦点保持在样品内的平面中。或者，未补偿的场曲会生成图像，在该图像中聚焦区域呈年轮形状。沿着z轴扫描采集的图像会生成一系列同心年轮，其可以相应地进行记录和组合。
除了通过消除rfo中的横向扫描所实现的简化，可容忍光学器件相对较大的场曲的光学设计简化了大集光率系统的光学设计，使得大视场显微镜成为可能。
本发明的一个实施例提供了一种显微镜系统，其包括：光源、样品物镜、远程聚焦单元、一个或多个光学元件以及探测器；其中样本物镜配置为用于将光聚焦在样品内的焦平面上；远程聚焦单元配置为用于沿着垂直于所述焦平面的轴线改变所述焦平面的位置；一个或多个光学元件配置为用于将所述聚焦光引导至所述焦平面内的位置；检测器配置为检测由所述样品内的所述焦平面发射出的光；其中所述一个或多个光学元件沿着从所述源到所述样本物镜的光的光束路径位于所述远程聚焦单元之后，从而在将聚焦光引导到焦平面内的位置之前执行沿所述轴线改变所述焦平面的位置。
本发明的一个实施例提供了一种横向扫描单元，其包括配置为用于在焦平面内扫描光束的第一可旋转镜、第二可旋转镜和第三可旋转镜；其中第一镜和第二镜的旋转在同一平面内扫描所述光束，使得所述光束围绕所述第一镜和第二镜下游的光瞳旋转；其中第三镜位于光瞳处；并且其中在与所述第一镜和所述第二镜扫描所述光束的平面正交的平面内，所述第三镜的旋转扫描所述光束。
本发明的一个实施例提供了一种显微成像方法，包括：提供光源；通过样本物镜将光聚焦在样本中的焦平面上；通过远程聚焦单元沿垂直于焦平面的轴线改变焦平面的位置；由横向扫描单元将聚焦的光引导至焦平面内的位置；以及由检测器检测从样本内的焦平面发射的光；其中所述一个或多个光学元件沿着从所述源到所述样本物镜的所述激发光的光束路径位于所述远程聚焦单元之后，使得在扫描所述聚焦平面内的聚焦激发之前执行沿着所述轴线改变焦平面的位置。
本发明的一个实施例提供了一种用于在焦平面内扫描光束的方法，包括：旋转第一可旋转镜和第二可旋转镜，以便在同一平面内扫描光束，使得光束围绕第一镜和第二镜下游的光瞳旋转；将第三镜定位在光瞳处，并且旋转第三镜以便在与第一镜和第二镜扫描光束的平面正交的平面中扫描光束。
附图说明
图1示出了根据一个实施例的显微镜系统的框图；
图2示出了根据一个实施例的显微镜系统的示意图；
图3示出了根据一个实施例的扫描图案和扫描参数的示例，其用于在显微镜的整个fov上移动共振扫描光束；
图4举例说明了根据一个实施例的样本的随机扫描；
图5a-5d示出了根据一个实施例的包括实质上共轭的检流计对的扫描镜的布置；
图6a-6d举例说明了根据一个实施例的场曲的表征和校正；
图7是根据一个实施例的示例物镜的示意图；
图8是根据一个实施例的光电倍增管(photomultipliertube，pmt)的示意图，其在透镜前方具有聚光透镜并且在透镜与pmt之间具有浸液；
图9举例说明了根据一个实施例的大视场成像。
具体实施方式
根据本发明原理的说明性实施例的描述旨在结合附图来阅读，该附图被认为是整个书面描述的一部分。在这里公开的本发明的实施例的描述中，对方向或取向的任何提及仅仅是为了描述的方便，而不是以任何方式限制本发明的范围。诸如“下游”，“上部”，“水平”，“垂直”，“上方”，“下方”，“上”，“下”，“顶部”和“底部”，以及它们的派生词(例如，“水平地”，“向下地”，“向上地”等)应当被解释为指示如随后所描述的或如在讨论中的附图中所示的方位。这些相对术语仅仅是为了便于描述，并且不要求装置以特定的方向构造或操作，除非明确地如此指示。诸如“附接”，“粘贴”，“连接”，“耦合”，“互连”的术语及类似词是指一种关系，其中结构通过中间结构直接或间接地彼此固定或连接，以及两者为可移动或刚性的附件或关系，除非另有明确说明。此外，参考示例性实施例来说明本发明的特征和益处。因此，本发明明确地不应该限于这样的示例性实施例，该示例性实施例示出了可以单独存在或者在其他特征组合中存在的一些可能的非限制性特征组合；本发明的范围由在此附加的权利要求限定。
本公开描述了目前预期的实践本发明的最佳方式或多个方式。该描述并非旨在被理解为限制性意义，而是通过参考附图，提供仅为了说明性目的而呈现的本发明的实例，以向本领域普通技术人员提供本发明的优点和构造方面的建议。在附图的各种视图中，相同的附图标记表示相同或相似的部分。
重要的是需要注意，所公开的实施例仅仅是本文创新教导的许多有利用途的示例。一般而言，在本申请的说明书中做出的陈述不一定限制任何要求保护的发明。此外，一些陈述可能适用于某些创造性特征，但不适用于其他特征。一般而言，除非另有说明，单数元素可以是复数形式，反之亦然，不失一般性。
图1是根据一个实施例的显微镜系统的上位级框图。显微镜系统包括光源101、样本物镜104、远程聚焦单元102、照明光学器件103以及检测器106，其中样本物镜104用于将光聚焦在样本105内的焦平面上；远程聚焦单元102用于沿着样品物镜的z轴改变焦平面的位置；照明光学器件103用于引导焦平面内的聚焦光；检测器106用于检测从样本内的焦平面发射的光以响应聚焦的激发光。要注意的是，技术人员将能够使用一个或多个光学器件的配置或者等同物来将光引导到平面内的位置。
通过扫描平面内的位置，可以执行扫描显微镜。图2中示出了根据一个实施例的显微镜系统的具体实施方式。如图2所示，激发源202(例如，ti：saphh)提供激发光。电光调制器(eom)204用于快速调制光束强度。基于棱镜的预啁啾结构206用于补偿由显微镜的折射光组件引入的群延迟色散(gdd)。光束通过四分之一波片(qwp)208进入多级潜望镜210。显微镜212被机动化以允许灵活地接近样品。在一个实施例中，显微镜可以在x、y上移动，围绕穿过样品平面并平行于显微镜长轴的轴旋转，并且沿着光束轴上下移动以进行粗略聚焦。由于显微镜相对于激光器移动，所以光束通过多级潜望镜210穿入显微镜。在显微镜的最重要的部分，光束首先通过偏振分束立方体(pbs)214和四分之一波片(qwp)216进入远程聚焦单元(rfu)222。rfu222包括远程聚焦物镜(rfo)218和安装在可移动的镜台220上的小镜子260。该光束穿过rfo218并被镜子260反射回rfo218。然后，qwp216和pbs214将光束导向横向扫描单元(lsu)224中。
在一个实施例中，可移动的镜台220包括音圈，该音圈沿着rfo218的轴线前后移动镜子260。在其他实施例中，例如，使用压电设备替代音圈或与音圈结合，来移动镜子的位置。
rfu222用于在沿着样本中的激发光的传播方向的方向上控制样本中的激发光的焦点的位置。rfo的入口孔径与成像物镜(io)的入口孔径共轭。镜子260大致与样本平面中的焦点共轭。镜子260的轴向移动改变了样本中焦点的轴向位置。
在反射离开安装在可移动的镜台上的镜子之后，激发光束可以被分束器反射并且被引导至共振扫描镜230，然后被一个或多个检流计镜反射。扫描镜可以在与样本中的激发光的传播方向垂直的方向上(例如，在x方向和y方向上)扫描样本内的激发光的焦点。
在共振镜和检流计镜之后，激发光束被分色分束器248反射并被样品物镜(so)250聚焦到样品252内的焦点。激发光束可以充满小于样品物镜的背面光瞳的整个表面，激发光学器件的数值孔径可以约为0.6。
从样品发出的荧光发射光由样品物镜收集，然后经由分束器242提供给一个或多个检测器(pmt)240、244。样品物镜的整个背面光瞳用于收集荧光发射辐射，使得检测光学器件的数值孔径可以约为1.0。
由于使用rfo来移动激发光的焦平面，可以选择rfo的光学特性来补偿引入给激发光束的球面像差和色像差，该激发光束由于向样本物镜的背面光瞳提供会聚/发散、非平面波而被提供给样本。
在图2中还示出了用于中继成像光瞳平面的示例性光学元件226、232和236。
图3示出用于在显微镜的整个fov上移动共振扫描光束的扫描图案和扫描参数的示例。扫描图案可以使用各种不同数量的条纹，其中从一个条纹移动到另一条纹涉及用相对缓慢的扫描仪移动光束，同时在条纹内的线上扫描光束涉及用相对快速的共振扫描仪移动光束。例如，在达到大约600μm宽的小块上可以进行快速共振扫描(例如每个扫描线的时间为42μs；对应于24khz线速率)。每个小块的时间可以是42μs×行数，整个视场可以覆盖9个条纹。慢速(例如1.5hz)、高分辨率的扫描则每个条纹可以有多达5000行。一个更快的(4.3hz)、低分辨率的扫描则每个条纹可以有多达500行。其他扫描可能涉及以高分辨率和帧速率对多个更小的小块进行采样。
图4是示出随机路径扫描的示例的示意图。例如，整个成像体积可以包括具有5mm直径和1mm深度的圆柱体。可以在垂直于激发光束的传播方向的多个不同平面中进行快速扫描，并且可以通过使用rfo在平面之间移动来到达不同平面，以在样本体积内改变焦点在z方向上的位置。
大多数激光扫描显微镜采用两个扫描镜来控制激光束以到达视场的不同部分。如果扫描镜未被制成彼此共轭(其中可以实现共轭，例如通过用中继成像光学器件将一个扫描镜成像到另一个扫描镜上)，当镜被扫描时，则光束/波前将相对于下游光学光瞳横向移位，引起显著的光学像差。
在许多激光扫描显微镜中，这种光瞳偏移会在高场点产生光晕(部分阻障)，除了光学上最简单的激光扫描显微镜(其中所有光学光瞳均可看到平面光束波前)之外，这种光瞳偏移都会导致显著的光学像差。在大多数显微镜中，用于使扫描镜共轭的唯一方法是采用中继成像光学器件(通常为4f设计)。在采用普通物镜的显微镜中，这通常不是问题，因为相对简单的光学设计，即采用普通件可获取的光学器件也能够充分执行该中继成像并保持衍射受限性能。然而，相对于常规显微镜，设计成采用非常大的集光率的显微镜(例如具有5mm视场(fov)和0.6na的双光子激光扫描显微镜)，4f成像中继透镜将必须自定义设计，这使得它们相对较大且生产成本较高，并且可能是显微镜最复杂和最昂贵的部分。
然而，通过使用三个扫描镜而不是两个扫描镜来扫描样品内的x和y维度的激发光束，可以避免该光学中继所增加的尺寸和成本，使得x扫描和y扫描的光瞳是一致的，而不需要使用任何额外的光学器件。在一个实施例中，在同一平面内同时扫描两个镜子，使得光束围绕两个镜子下游的光瞳旋转。这个光瞳被放置在第三镜子上，第三镜子在正交方向上被扫描。如果连接前两个镜子的扫描位置的函数是一个严格的比例，则下游的光瞳可以在较大的扫描范围内大体上保持平稳。其他高阶函数可用于使光瞳在大扫描范围内任意平稳。
图5a-5c是两个扫描镜501、502示意图，该两个扫描镜501、502共同作用以产生可以改变光束方向的虚拟光瞳。光束从左上角进入，虚拟光瞳在右下角。图5a-5c举例说明了对应于不同场/扫描位置的不同光线路径。两个镜子被同时扫描，围绕平行轴旋转，以在同一平面内扫描光束，使得光束的方向围绕虚拟光瞳旋转。例如，如图5a-5c所示，由于两个上游的镜子不同的角定向，在右下方的虚拟光瞳处的不同光线示出了具有不同方向但在相同平面(例如，x-z平面)中传播的入射光束。扫描正交平面(例如，y-z平面)中的光束的扫描镜可以放置在右下方的光瞳处。
图5d是示出全部三个扫描镜的示意图，其包括两个上游的扫描镜501、502，两个上游的扫描镜501、502共同起作用以沿着下游的扫描镜503旋转光束的方向，下游的扫描镜503沿着与光束在虚拟光瞳处被旋转/扫描的方向正交的方向扫描光束。前两个镜子501、502之间相互协同作用，使得虚拟光瞳维持在第三镜子503的位置处。前两个镜子之间相互协同作用以在虚拟光瞳处的第一平面旋转光束的方向，从而穿过虚拟光瞳时光束细微平移，而第三个镜子被操作以在垂直于第一平面的第二平面中旋转光束的方向。当前两个镜子以这种方式被操作时，前两个镜子的组合实际上与第三个镜子共轭。
在点扫描激光扫描显微镜(lsm)中，聚焦激光在三维空间内移动到样品上方。激光扫描可以在光轴的横向方向上容易地实现，但沿着光轴(z)更具挑战性。在绝大多数显微镜中，物镜被移动来移动焦点的z位置。这些移动涉及大质量，因此相对较慢，限制了可以获取的图像类型以及可以实际设计的显微镜类型。本发明的一个实施例使用非横向扫描的远程聚焦显微镜来沿光束轴线快速移动焦点。物镜以及放置在该物镜的焦点空间中的镜子用于在激光束被横向扫描之前先在轴向空间中扫描激光束。然后光束通过不同的物镜聚焦为lsm刺激样品。在传统的远程对焦中，光束先被横向扫描，然后再被发送到双目标远程对焦系统。
在一个如图1所示的实施例中，该系统包括具有至少一个处理器的计算机系统107，该计算机系统107用于自动控制检流计镜，以在垂直于样本中的激发光的传播方向的方向上扫描样本内的焦点。在另一个实施例中，计算机系统107还用于自动控制远程聚焦系统102，使得当焦点在垂直于传播的方向上被扫描时，样本中激发光焦点的位置保持在垂直于传播方向的平面内。
例如，激发光学器件的场曲可以通过假定聚焦激发光束经过样本物镜进入薄标定样品来参数化，该薄标定样品具有响应于激发光束的已知的荧光发射。然后，当光束在垂直于传播方向的方向上被扫描时，来自标定样本的荧光发射响应可以被监测以确定激发光学器件的场曲，或者确定当光束在平行于一平面的方向上被扫描时，焦点从该平面处在z方向上移动多少。
一旦激发光学器件已被参数化，在垂直于光束传播方向的方向上扫描光束时，就可以使用该参数化以将光束的焦点保持在一平面中。例如，随着光束的焦点在x方向和y方向上被横向扫描，远程聚焦系统可以沿z方向动态地控制焦点的位置以将焦点的位置保持在平面内，尽管可能由激发光学器件引入场曲。因此，远程聚焦系统不仅可以用于将激发光的焦点在z方向上移动到不同的平面(例如，以创建样本的3d图像)，还可以用于当焦点在平面内被扫描时，校正样本物镜的场曲。在一些实施方式中，当光束被检流计镜扫描时rfo可以被实时控制，以响应由检流计镜所致的光束的位置，而rfo不被控制用来响应共振扫描镜的方向。在一些实施方式中，当光束被检流计镜扫描时rfo可以被实时控制，以响应检流计镜所致的光束的焦点位置和由共振扫描镜的方向所致的焦点位置。
图6a-6d举例说明了场曲的表征和校正。图6a示出了使用薄荧光素样品(例如，夹在显微镜载物片和450μm厚盖玻片之间的11.2μm厚的荧光素样品)测量的场曲。在特定的远端聚焦位置，样品的图像是荧光环，这是由于光学器件的场曲导致只有激发光束的年轮才激发来自荧光素样品的荧光发射光。环的直径可以根据远程焦点位置的函数来测量。图6b是没有对场曲进行任何校正的样品图像的示意图，其中样品表现为细环。图6c是测量的场曲的示意图(实线：场曲校正之前；虚线：场曲校正之后)。图6d是当远端聚焦镜被编程为补偿场曲时获得的样品图像的示意图。使用一行中谐振镜的平均位置作为校正点，基于逐行进行补偿。在图6d所示的例子中，场曲补偿沿着每个条纹校正场曲，但不校正谐振扫描内的场曲，因为谐振镜移动的速度比rfo的动态响应更快，rfo的动态响应能够跟踪。
在一些实施例中，当用于双光子激光扫描显微术(tpm)时，样品物镜可以具有提供给样品的双光子激发辐射的第一na和高于第一na的第二na，用于荧光辐射聚集。例如，物镜可具有大约0.6(在直径5mm的fov上)的激发na和大约1.0的聚集na。物镜中的物理孔径允许na1.0聚集，而如果进入物镜的激发光束具有对应于较低激发na的宽度，则物镜仅支持衍射受限成像。
tpm系统中的物镜起到双重作用——既将激发光束聚焦到可能的最小点(以实现有效的双光子激发和高分辨率)，并从双光子激发聚集所产生的荧光用于转移到光检测器。聚焦作用要求物镜在理想情况下具有衍射受限的光学性能，对于有用的na和视场(fov)规格，这需要复杂的光学设计和难以满足的制造偏差。随着物镜na的增加，这些困难会超线性增长，因此选择激发na需要平衡所需的双光子激发效率和分辨率，其随着na、镜头成本和可制造性而增加。
高na对于有效的荧光收集也很重要，因为收集的光量大致按照(na)2增加。然而，与激发相反，用于收集的物镜的性能可能比衍射受限的激发性能所需要的要差几个数量级(就波前差而言)，因为收集的光没有成像，而是简单地收集到单一的、大的感光面(通常是pmt光电阴极)上。因此，用于tpm成像的理想物镜设计将支持高于其激发na的收集na。这可以通过选择足够厚的单个物镜来实现，使得它们的最大通光孔径(受边缘厚度限制)可以支持较大的收集na，同时物镜在少于由激发光照亮的物镜的整个后方光瞳时，还能支持由单个物镜提供的激发辐射的衍射受限性能，。
图7是示例物镜的示意图，该示例物镜提供衍射受限激发，其具有比当它用于收集来自样品的荧光发射光时的na更低的na。虚线704示出了na为0.6处衍射受限的激发路径。实线702显示了na为1.0处的聚集路径。需要注意的是，激发和聚集路径具有不同的光瞳位置。例如，两条激发路径(用虚线示出)示出了将激发光束的焦点提供给样品内的不同位置，以说明可以在样品内的相对宽的fov上扫描激发光束。激发路径(虚线)704还示出激发如何不充满物镜的整个后方光瞳，而是仅照射了后方光瞳的子部分，从而获得衍射受限的性能，且具有比若整个光瞳被照射时应存在的na更小的na。荧光路径(实线)702示出了使用比给样本提供激发光的物镜的有效na更大的na的物镜如何收集发射光。
在双光子激光扫描显微镜中，物镜的荧光聚集的集光率应该匹配或不超过光检测器(例如光电倍增管(pmt))的集光率，使得信号光子不被浪费并被检测器收集。在大多数显微镜中，大多数pmt用于显微镜，这不是问题，因为这些pmt具有比物镜视场(fov)大得多的有源光电阴极区域，并且支持相当大的的收集角度。然而，对于这里描述的用于体内成像的大视场高分辨率显微镜(2p-ram)，物镜在直径为大约6mm的fov上使用1.0的na来聚集荧光，并且这个聚集的发射光的集光率超过了已使用的现在最顶尖的pmt(例如gaasp光电阴极pmt)的集光率，其仅具有直径5mm的有效收集区域和大约0.9的可用na，使得它不可能检测到所有这些荧光。在pmt上添加聚光透镜同时在透镜和玻璃pmt外壳之间具有浸液，允许pmt的聚集na超过1.0——在一个实施例中，当在聚光透镜和pmt之间采用油浸，pmt中的荧光能够达到1.4的na，并且由物镜聚集的全部荧光(不计反射损失)可以投射到pmt上进行检测。
在一些实施方式中，定制的聚光透镜可以用于将荧光发射光聚焦到结合了中间光学浸液(例如浸油，其充满了荧光发射光在其中传播的透镜和pmt之间的空间)的光电倍增管上。定制设计的金属零件用于将透镜刚性连接到pmt以获得机械稳定性。
图8是pmt802的示意图，其在透镜前面具有聚光透镜812和在透镜和pmt之间具有浸液808。荧光发射光814被聚光透镜聚焦到pmt检测器的光电阴极806。当高折射率液体放置为与光电阴极和透镜之间的聚光透镜的平坦侧面接触时，即使从透镜边缘聚集的光也可以离开透镜并传播到pmt，而不是在透镜的平坦表面处由于全内反射停止。
图9举例说明了根据一个实施例的大视场成像。不是图6a-6d中所示对样本物镜场曲的校正，而是图9显示了未补偿的场曲产生聚焦区域呈年轮形状的图像。沿z轴扫描收集的图像会生成一系列同心年轮，其可以被记录以及进行相应的组合。
本文公开的本发明的实施例相对于现有系统和技术具有独特的优点。如上所述，远程聚焦显微镜技术在一个物镜(远焦点物镜，rfo)的焦点空间中使用成对的物镜和轴向移动的镜子，以允许另一物镜(样品物镜，so)的焦平面为以最小的光学像差快速变化。该技术的现有实施方式在横向扫描光束之后将rfo放置在光束路径中，使得rfo和so具有相等的光学集光率。当市场上能买到已经支持相同光学集光率的物镜被用作rfo和so时，这种布置是最佳的。然而，当需要so具有非常高的光学集光率时，优选根据实施例的布置，其中在横向扫描光束之前将rfo放置在光束路径中。这使rfo的集光率以及尺寸、复杂性和成本远远低于so。在一个实施例中，在rfo之后的光学器件被制造成使得远程聚焦对于横向扫描是不变的，并且因此利用该配置在大体积上实现衍射受限聚焦。此外，远程聚焦是在具有非常大视场的显微镜中使用的特别重要的技术，因为它允许整个光学设计具有相对大的场曲；这个场曲可以通过远程聚焦移动实时补偿。除了通过消除rfo中的横向扫描而实现的简化之外，具有场曲的光学设计显著地简化了大集光率系统的光学设计。
虽然已经用一些篇幅以及相对几个所述实施例所具有的一些特征描述了本发明，但是不旨在它应该限制于任何这样的细节或实施例或任何特定实施例，而是应该参照所附权利要求书进行解释，以便根据现有技术提供对这些权利要求的尽可能宽泛的解释，从而来有效地涵盖本发明的预期范围。
虽然在此提到了显微镜的特定实施例中使用的特定参数，但应理解，本发明不限于已经与特定实施例使用的任何特定参数。在此叙述的所有示例和条件语言旨在用于教导目的，以帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进技术而贡献的创造，并且应被解释为不限于这些具体描述的示例和条件。此外，本文阐述本发明的原理、方面和实施例的所有陈述以及其具体示例旨在涵盖其结构和功能上的等同设备。另外，意图是这样的等同设备包括当前已知的等同设备以及将来开发的等同设备，即，开发的执行相同功能的任何元件，而无论结构如何。