一种多色多角度照明的高分辨显微成像系统的制作方法

本发明属于计算显微成像领域，尤其是涉及一种多色多角度照明的高分辨显微成像系统。

背景技术：

光学显微镜是利用的光学的原理，把微小物体放大成像，方便人们提取微细结构信息的一种光学仪器，它在生物学，医学等领域有着非常关键的作用。高分辨率是光学显微镜不断追求的目标之一，然而，随着当前微系统的功能和性能的不断更新，高分辨率和大视场的不兼容问题变得越来越突出，极大地限制了光学显微镜在许多领域中的应用。

实现高分辨率显微成像的障碍主要在于衍射极限的瓶颈，傅立叶叠层成像技术(fpm)是近年来发展出的能克服这一限制的最具代表性的光学显微技术。它通过交替迭代空域中的强度信息和频域中的相位映射关系来提供大视场和高分辨率成像的能力。在传统的fpm成像系统中，样品由来自led阵列的多角度的平面波照射，然后通过低数值孔径(na)物镜成像。来自多角度的平面波照射到二维薄物体上，物镜后浇面上的物体的频谱由于照射角度的不同被平移到相应的不同位置上，因此，一部分超出物镜na的频率被移动到物镜的na内，从而能够传递到成像面成像。以这种方式，可以使用低na和低放大率的透镜来得到更大的视场以及高分辨率的图像。最终重建的分辨率由频域中合成孔径的大小所决定。

传统的fpm技术使用led阵列照明，而将led阵列作为光源照明样本，则在重建高分辨率图像时要对样本进行分块，而且led的亮度会随着时间变化，位于阵列边缘的led的照明效率与中心位置的led的照明效率相比较低，会在重建高分辨率图像的过程中引入强度变化的误差，从而大幅度降低fpm算法的精度。传统的fpm使用依次点亮单个led光源的方法，得到大量的低分辨图像，使得恢复高分辨率图像的耗时较长，影响显微观察的实时性。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种多色多角度照明的高分辨显微成像系统，其采用激光与数字微镜阵列结合产生稳定的多角度照明，并对fpm算法进行适当的改进，从而减少了恢复高分辨率图像所需的低分辨率图像的数量，降低了获得高分辨率图像所需的时间。

本发明采用的具体技术方案如下：

一种多色多角度照明的高分辨显微成像系统，包括：

光学引擎，具有沿光路设置的激光光源、数字微镜阵列和会聚透镜；所述激光光源用于产生单色激光或多色激光；所述数字微镜阵列用于实现多角度的照明；所述会聚透镜用于将激光平行照射至样本平面上；

显微成像系统，包括物镜和镜筒透镜；所述物镜用于收集经过样本平面的平行光并生成低分辨率的图像；所述镜筒透镜用于再次放大把所述物镜所成的像；

图像接收处理装置，包括相机和计算机，相机用于拍摄所述的图像；所述的计算机利用fpm算法将拍摄的多幅低分辨率图像恢复成高分辨率图像。

本发明中，样本放在成像物镜工作距离处，在物镜后放置了镜筒透镜，用于对物镜像差进行校正，并扩大物镜的视域便于观察。

优选的，所述的激光光源为单色激光器。

激光器采用单色激光器以产生单色激光，避免了使用led光源会产生的强度漂移，照明强度不均匀，暗噪声限制检测等问题，扩束准直系统通过更换不同大小的针孔以调节扩束后的均匀光斑的大小。

为实现多色照明，并列优选的，所述的激光光源包括产生不同颜色激光的多个单色激光器，多个单色激光器发出的单色激光经分光镜合束为多色激光。

优选的，所述的激光光源与数字微镜阵列间设置有扩束准直系统，包括沿光路依次设置的针孔滤波器和成像凸透镜，用于光束的扩束和准直。

优选的，所述的数字微镜阵列集成在一反射模块内，所述反射模块内设置有反射镜，由第一侧面平行射入反射模块的激光经所述反射镜反射后照明数字微镜阵列表面，并由数字微镜阵列反射从与所述一侧面垂直的第二侧面水平射出。

数字微镜阵列中，为了控制微透镜的开启或关闭，需要将数字微镜阵列通过usb线直接与计算机相连，并通过配套软件设置微透镜的开启或关闭，以获得多角度照明的效果。

数字微镜阵列被放置在特定机械结构的反射模块内，反射模块内置一块反射镜，使得平行射入反射模块的激光以水平方向24度，俯仰方向45度的角度反射至数字微镜阵列，确保了经数字微镜阵列反射的光线能水平出射至组合透镜，减少了调整光路入射角度所需的多个反射镜，降低了系统的复杂度，以及激光光源的准直难度。

优选的，所述数字微镜阵列与会聚透镜间设置组合透镜，包括沿光路依次设置的第一凸透镜与第二凸透镜，用于将反射光会聚在所述会聚透镜的前焦面上。通过组合透镜，将数字微镜阵列的自定义亮斑引出到会聚透镜的前焦面上，便于实验的对准，保证了实验的精度。

优选的，所述组合透镜的中心焦点处设置有用于滤除衍射高级图像和杂散光的光阑。在组合透镜的中心焦点附近加入光阑，光阑精确位置由算法确定，以滤除衍射高级图像和杂散光，提高成像质量。

所述的图像接处理装置中，为了保存多角度照明时得到的低分辨率图像，需要将相机通过采集卡与工作站相连，并通过配套软件得到并保存相机拍摄到的图像。

优选的，所述的fpm算法的具体步骤包括：

步骤(101)，初始化样本的空间光谱和瞳孔函数o⁽⁰⁾(k)，p⁽⁰⁾(k)；

步骤(102)，假设使用第n-1幅低分辨率图像强度in(r)更新的空间光谱为o^(n-1)(k)，同时更新的瞳孔函数为p^(n-1)(k)，引入辅助函数φ⁽ⁿ⁾(k)＝o^(n-1)(k-kn)p^(n-1)(k-kn)，其中使用了具有空间平移kn的倾斜平面波作为照明场；

步骤(103)，φ⁽ⁿ⁾(r)＝f^-1{φ⁽ⁿ⁾(k)}，φ⁽ⁿ⁾(k)是模拟的低分辨率图像φ⁽ⁿ⁾(r)的空间光谱；

步骤(104)，用实验获得的第n幅图像的强度来更新低分辨率图像φ⁽ⁿ⁾(r)的振幅；

步骤(105)，通过对更新后的进行二维傅立叶变换，得到更新后的样本空间光谱

步骤(106)，更新后得到的低分辨率图像的空间光谱用于更新瞳孔函数o⁽ⁿ⁾(k)和样本光谱p⁽ⁿ⁾(k)，如下式：

其中，δ1，δ2为用于避免分母中出现零的正则化常数；

步骤(107)，判断只打开位于频率空间中的物镜数值孔径边缘的微透镜时所分别得到的所有低分辨率图像是否迭代完全，若没有迭代完全则重复步骤(102)-(106)；

步骤(108)，若迭代完全，则判断物体的高分辨率复振幅图像是否收敛，若未收敛则重复步骤(102)-(107)；

步骤(109)，输出即为最终得到的高分辨率图像的空间光谱。

优选的，在步骤(101)中，仅打开数字微镜阵列内位于频率空间中的物镜数值孔径边缘和中心位置的微透镜。

本发明还对fpm算法适当改进：只打开位于频率空间中的物镜数值孔径(na)边缘和中心位置的微透镜，在正确地恢复低频相位信息的同时，减少了恢复高分辨率图像所需的低分辨率图像的数量，使得系统工作时间大幅度减少。

附图说明

图1为基于fpm算法得到高分辨率图像的流程图；

图2为实施例1中多色多角度照明的高分辨显微成像系统最基本的结构图；

图3为实施例2中多色多角度照明的高分辨率显微成像系统的结构图；

图4为实施例3中多色多角度照明的高分辨显微成像系统的结构图；

图5为放置数字微镜阵列的反射模块的结构图。

具体实施方式

为透彻的理解本发明，在接下来的描述中陈述了很多特定细节。而在没有这些特定细节时，本发明则可能仍可实现。然而，应理解：不存在将本发明的各种实施例限于在此公开的特定实施例的意图，而是应将本发明理解为涵盖落入本发明的各种实施例的精神和范围内的所有调整、等同物和/或可选方案。

此处所称的“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。此外，表示一个或多个实施例的方法、流程图或功能框图中的模块顺序并非固定的指代任何特定顺序，也不构成对本发明的限制。

实施例1

图1示出了一个基于fpm算法的实施例。该算法是一种交替迭代空域中的强度信息和频域中的相位映射关系得到高分辨率图像的算法，其循环迭代的基本步骤如下：

步骤101，初始化样本的空间光谱和瞳孔函数o⁽⁰⁾(k)，p⁽⁰⁾(k)。一般选择仅打开数字微镜阵列中中心位置的微透镜时，即产生垂直入射的平面波时，所对应的低分辨率图像进行插值，作为样本的初始估计；

步骤102，假设使用第n-1幅低分辨率图像强度in(r)更新的空间光谱为o^(n-1)(k)，同时更新的瞳孔函数为p^(n-1)(k)，引入辅助函数φ⁽ⁿ⁾(k)＝o^(n-1)(k-kn)p^(n-1)(k-kn)，其中使用了具有空间平移kn的倾斜平面波作为照明场；

步骤103，φ⁽ⁿ⁾(r)＝f^-1{φ⁽ⁿ⁾(k)}，φ⁽ⁿ⁾(k)是模拟的低分辨率图像φ⁽ⁿ⁾(r)的空间光谱；

步骤104，用实验获得的第n幅图像的强度来更新低分辨率图像φ⁽ⁿ⁾(r)的振幅；

步骤105，通过对更新后的进行二维傅立叶变换，得到更新后的样本空间光谱

步骤106，更新后得到的低分辨率图像的空间光谱用于更新瞳孔函数o⁽ⁿ⁾(k)和样本光谱p⁽ⁿ⁾(k)，如下式：

其中，δ1，δ2为用于避免分母中出现零的正则化常数；

步骤107，判断只打开位于频率空间中的物镜数值孔径(na)边缘的微透镜时所分别得到的所有低分辨率图像是否迭代完全，若没有迭代完全则重复步骤102-106；

步骤108，若迭代完全，则判断物体的高分辨率复振幅图像是否收敛，若未收敛则重复步骤102-107；

步骤109，输出即为最终得到的高分辨率图像的空间光谱。

实施例2

图2为多色多角度照明的高分辨显微成像系统最基本的结构图。

本实施例中的高分辨显微成像系统主要包括光学引擎，显微成像系统和图像接收处理装置。

其中，光学引擎包括沿光路布置的：

激光器201，用以产生单色激光；

针孔滤波器202和成像凸透镜203，组成扩束准直系统，用以准直扩束激光器发出的单色激光；

数字微镜阵列204，用以产生多角度照明；设有用以放置数字微镜阵列204的反射模块205，简化实验系统的搭建；

组合透镜，包括凸透镜206与凸透镜207，用以引出数字微镜阵列的焦点至会聚透镜的前焦面208；

会聚透镜209，用以产生平行光照明样本平面210。

显微成像系统包括：

物镜211，用以产生低分辨率图像；

镜筒透镜212，用以放大所产生的像；

图像接收处理装置包括：

相机213，用以拍摄产生的低分辨率图像；

计算机214，控制数字微镜阵列204中微透镜的打开或关闭，并用于储存并处理接收到的低分辨率图像，最终得到样本的高分辨率图像。

本实施例中的反射模块205结构如图5所示的，反射模块接收光的窗口501，用于接收经扩束准直系统准直扩束的激光。反射镜502使得经过反射模块窗口的激光以水平方向24度，俯仰方向45度的角度反射至数字微镜阵列503，并经数字微镜阵列503反射后以水平方向出射，如此单独设计反射模块，就可以减少光学引擎的复杂度，便于以后光源的更换。

实施例3

图3为另一多色多角度照明的高分辨率显微成像系统的结构图，内增设光阑207，具有滤除高级衍射亮斑和提高成像清晰度的作用。

本实施例中的高分辨率显微成像系统主要包括光学引擎，显微成像系统和图像接收处理装置。

其中，光学引擎包括沿光路布置的：

激光器301，用以产生单色激光；

针孔滤波器302与成像凸透镜303，组成扩束准直系统，用以准直扩束激光器发出的单色激光；

数字微镜阵列304，用以产生多角度照明；设有用以放置数字微镜阵列304的反射模块305，简化实验系统的搭建；

组合透镜，包括凸透镜306与凸透镜308，用以引出数字微镜阵列的焦点至会聚透镜的前焦面309；

光阑307，用以滤除衍射高级图像和杂散光，提高成像质量；

会聚透镜310，用以产生平行光照明至样本平面311。

显微成像系统包括：

物镜312，用以产生低分辨率图像；

镜筒透镜313，用以放大所产生的像；

图像接收处理装置包括：

相机314，用以拍摄产生的低分辨率图像；

计算机315，控制数字微镜阵列304中微透镜的打开或关闭，并用于储存并处理接收到的低分辨率图像，最终得到样本的高分辨率图像。

本实施例中的反射模块305结构如图5所示的，反射模块接收光的窗口501，用于接收经扩束准直系统准直扩束的激光。反射镜502使得经过反射模块窗口的激光以水平方向24度，俯仰方向45度的角度反射至数字微镜阵列503，并经数字微镜阵列503反射后以水平方向出射，如此单独设计反射模块，就可以减少光学引擎的复杂度，便于以后光源的更换。

实施例4

图4为多色多角度照明的高分辨显微成像系统的结构图，采用多色激光器观察彩色样本。

本实施例中的高分辨显微成像系统包括光学引擎，显微成像系统，图像接收处理装置。

其中，光学引擎包括：

单色红光激光器401，单色蓝色激光器402和单色黄色激光器403，产生的三束单色激光由分光镜404和分光镜405合成多色激光；

针孔滤波器406与成像凸透镜407，组成扩束准直系统，用以准直扩束出射的多色激光；

数字微镜阵列408，用以产生多角度照明；设有用以放置数字微镜阵列408的反射模块409，简化实验系统的搭建；

组合透镜，包括凸透镜410与凸透镜411，用以引出数字微镜阵列的焦点至会聚透镜的前焦面412；

会聚透镜413，用以产生平行光照明至样本平面414。

显微成像系统包括：

物镜415，用以产生低分辨率图像；

镜筒透镜416，用以放大所产生的像；

图像接收处理装置包括：

相机417，用以拍摄产生的低分辨率图像；

计算机418，控制数字微镜阵列408中微透镜的打开或关闭，并用于储存并处理接收到的低分辨率图像，最终得到样本的高分辨率彩色图像。

本实施例中的反射模块409结构如图5所示的，反射模块接收光的窗口501，用于接收经扩束准直系统准直扩束的激光。反射镜502使得经过反射模块窗口的激光以水平方向24度，俯仰方向45度的角度反射至数字微镜阵列503，并经数字微镜阵列503反射后以水平方向出射，如此单独设计反射模块，就可以减少光学引擎的复杂度，便于以后光源的更换。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。