一种无扫描高超分辨光学三维显微成像方法与流程

本发明属于光学显微成像技术领域，具体涉及的是一种无扫描高超分辨率三维显微成像方法。

背景技术：

光学显微镜是一种精密仪器，已有300多年的历史，它具有非接触、低毒性的特点，非常适用于活体生物组织和细胞的成像。为了在生物组织内获得高对比度、清晰的图像，荧光显微技术成为光学显微镜发展的重要分支，成为生物高超分辨显微技术领域的主要研究方向。荧光显微技术的发展，一直追求三个方面的性能提升：分辨率、成像速度(动态成像)和成像景深(体成像)。在成像分辨率方面，远场光学成像受到阿贝衍射极限理论限制，传统最大横向分辨率约为光波长的一半。为了突破限制，目前主要发展了三类技术：1)单分子定位显微技术，如随机光学重建显微技术(storm)和光激活定位显微技术(palm)。此类技术结合单分子荧光激发、数据处理与重建获得超分辨图像，但图像重建时间长，难以实现实时成像和三维成像。(2)受激辐射损耗显微技术(sted)。该技术结合光激发与光损耗，可以实现高分辨率的成像，但实时性和三维成像性能较弱。(3)结构光照明显微技术(sim)。该技术基于频域信息处理方法，分辨率较高，但实时性较低，三维成像能力较差。在成像速度方面，随着分辨率提高，数据处理量增大，导致成像速度降低，因此要求在器件性能和后续数据算法方面突破。在三维信息获取方面，目前主要基于z扫描模式，需要机械移动样品或物镜沿z轴移动，进一步影响成像速度。

技术实现要素：

基于以上不足之处，本发明的目的是提供一种无扫描高超分辨率三维显微成像方法，本方法是一种无需机械扫描即可实现一定深度的高超分辨三维显微成像方法，该方法适用于荧光显微成像，以及结构透明、可自发光样本的显微成像系统。

本发明所采用的技术如下：一种无扫描高超分辨光学三维显微成像方法，如下：

(1)光路结构

将样品在倒置荧光显微镜系统的像面形成的放大像，经第一透镜、反射式或透射式空间光调制器、第二透镜，由ccd相机成像，其中，第一透镜和第二透镜相同，光阑与第一透镜、第一透镜与空间光调制器、空间光调制器与第二透镜、第二透镜与ccd相机之间的距离均为第一透镜的焦距f；

(2)光场调制图样设计

(2.1)在空间光调制器上产生主图案，所用的公式为：

k(x,y)＝exp{iβ[(x+y)³+(x-y)³]}

公式中，x,y为平面坐标，x,y的范围由空间光调制器的像素数决定，β为调制系数，根据成像深度不同β取值为(0，1)区间；

(2.2)用阶跃光栅图案覆盖空间光调制器图案的两侧部分，形成带状中心主图案；

(2.3)按整数间隔旋转中心带状图案一周360°，每旋转一个角度，在ccd相机上采集一幅图像，形成供图像重建使用的投影图像序列；

(3)图像重建

对不同的调制图像得到的ccd投影图像进行数据重建，从而得到原物的三维图像，其重建步骤如下：

(3.1)对各ccd投影图像进行拉东变换，并定义一个统一的坐标系(u,v,w)，所依据的公式为：

其中，(x',y',z')是各投影面的坐标，θ是投影方向与光路主轴的夹角，是各投影图像旋转的角度；

(3.2)针对各投影图在统一坐标系的分布，进行傅里叶变换，得到像空间的三维分布(xt,yt,zt)，所依据的公式为：

(3.3)对像空间坐标进行矫正处理，得到物空间真实坐标分布(x,y,z)

其中，m为显微镜放大倍数，由物镜决定；k＝2π/λ，λ是成像光波波长；r是系统点扩散函数艾里光斑主瓣的直径，由实验测得。

步骤2.3中旋转间隔采集次数不少于6。

本发明的优点及有益效果：本发明基于频域调控，可以控制光场俘获z轴信息，是一种新的成像机制，结合光束自弯曲传播特性与无衍射特性，通过投影图像重建，能够实现无扫描高超分辨率三维显微成像。本发明的光路可基于传统倒置荧光显微镜系统搭建，因此与传统显微镜技术兼容。本发明适用于荧光显微成像领域，包括生物显微应用、透明晶体自发光显微应用。由于无需机械扫描，因此成像速度较快，按照当前商用的空间光调制器60hz技术，三维成像速率可到5hz，成像深度可达10微米以上。

附图说明

图1为反射式成像光路结构图；

图2为透射式成像光路结构图；

图3为调制图像；

图4为图3旋转45°的调制图像；

图5为厚度为8微米的体结构量子点成像结果图；

图6为厚度为10微米的小鼠肾管成像图；

图7为x,y,z三个方向分辨率测量数据图；

其中，1、样品、2、物镜，3、光源，4、二向色镜，5、管镜，6、反射镜，7、光阑，8、ccd相机，9、第二透镜，10、第一透镜，11、反射式空间光调制器，12、透射式空间光调制器。

具体实施方式

下面根据说明书附图举例对本发明做进一步的说明：

实施例1

一种无扫描高超分辨光学三维显微成像方法，如下:

(1)光路结构

如图1-2所示，将样品在采用倒置荧光显微镜系统成像，再经过反射式成像光路结构或透射式成像光路结构，光路结构具体如下：光源经二向色镜反射后通过物镜系统激发样品的发光物质，样品发光经物镜、二向色镜、管镜后在光阑处形成样品的放大像，该像的放大倍数由选用的物镜倍数决定，此后经第一透镜、反射式或透射式空间光调制器、第二透镜，由ccd摄像机成像，其中，第一透镜和第二透镜相同，光阑与第一透镜、第一透镜与空间光调制器、空间光调制器与第二透镜、第二透镜与ccd相机之间的距离均为第一透镜的焦距f；

(2)光场调制图样设计,本发明的实现，需要多次改变空间光调制器的图案，形成ccd图像序列，进而通过数据重建得到原物的三维像。按照如下步骤产生光场调制图案：

(2.1)在产生空间光调制器上产生主图案，所用的公式为：

k(x,y)＝exp{iβ[(x+y)³+(x-y)³]}

公式中，x,y为空间光调制器平面坐标，x,y的范围由空间光调制器的像素数决定，β为调制系数，根据成像深度不同β取值为(0，1)区间；

(2.2)如图3所示，用阶跃光栅图案覆盖空间光调制器图案的两侧部分，形成带状中心主图案；可削减艾里光束的尾部，得到能量集中的主极大分布，使点扩散函数在数据重建时更容易计算。实际应用中调制图案压缩的大小可根据成像强度和分辨率需求设定。图3中的圆圈部分为光照区域。

(2.3)按整数间隔旋转中心带状图案一周360°，每旋转一个角度，在ccd相机上采集一幅图像，形成供图像重建使用的投影图像序列；其中，间隔角度根据重建三维图像的效果进行选择，通常选择可被360整除的旋转次数，根据实验经验，获得较好重建效果的旋转间隔采集次数不少于6，如图4是旋转45°的结果，即一周的间隔采集次数为8。

(3)图像重建

对不同的调制图像得到的ccd投影图像进行数据重建，从而得到原物的三维图像，其重建步骤如下：

(3.1)对各ccd投影图像进行拉东变换，并定义一个统一的坐标系(u,v,w)，所依据的公式为：

其中，(x',y',z')是各投影面的坐标，θ是投影方向与光路主轴的夹角，是各投影图像旋转的角度；

(3.2)针对各投影图在统一坐标系的分布，进行傅里叶逆变换，得到像空间的三维分布(xt,yt,zt)，所依据的公式为：

(3.3)对像空间坐标进行矫正处理，得到物空间真实坐标分布(x,y,z)

其中，m为显微镜放大倍数，由物镜决定；k＝2π/λ，λ是成像光波波长；r是系统点扩散函数艾里光斑主瓣的直径，由实验测得。

实施例2

本实施例利用图1的反射式光路，基于647波段的激光光源，分别对厚度为8微米的体结构量子点和厚度10微米的小鼠肾管进行成像，利用公式(1)产生调制图像，β值取0.5，旋转角度为30°，即一周旋转12次，图3-4中遮挡后剩余中间的调制图案占该方向线度的三分之一，根据上述图像重建算法，得到重建图像如图5和图6所示。如图7所示，经过分辨率测量，x,y方向分辨率约为0.5微米，接近传统光学分辨率极限；z方向分辨率约为1.5微米，超过传统光学分辨率极限。