用于深层组织成像的大角度光学光栅扫描系统
背景技术：
：：1.与基于ccd(ccd-based)和单光子成像系统相比，非线性光学显微镜(nlom)的深穿透能力使其适合于三维(3d)成像。为了在中尺度体积(mesoscalevolumetric)的生物样本上采用高速光栅扫描，而期望非线性光学显微镜(nlom)的视场(fov)足够大。然而，为了扩展nlom的fov，或者增加扫描角度或者使用低倍率和低数值孔径(na)物镜，两者都降低了在光学分辨率方面的图像质量。相反，精细的亚微米(sub-micron)生物结构的三维可视化需要足够高的横向和轴向分辨率，从而需要采用高数值孔径(high-na)物镜，而且扩展的fov必须通过满足奈奎斯特准则的高速采样来解析，从而使具有亚毫微微升(sub-femtoliter)有效三维分辨率的超过1平方毫米的fov扩展(fov-extension)，在不在采集速度上折衷时，成为有挑战性的任务。2.以前曾报道过几种中尺度成像技术。巴卢，米哈拉等人著(balu,mihaelaet.al.)，“基于非线性光学显微镜快速扫描大面积组织的成像平台”(“imagingplatformbasedonnonlinearopticalmicroscopyforrapidscanninglargeareasoftissue”)，专利公开号：wo2018/075562al，公开了一种非线性光学(nlo)显微镜设计，其扩展fov为0.8×0.8mm2＝0.64mm2，即小于一平方毫米，由1600×1600的像素数来解析，因此对于跨过0.8×0.8mm2的完整fov的0.5±0.2μm的亚微米横向分辨率，不能满足像素尺寸为0.5μm的奈奎斯特准则。3.相当多的研究人员公开了几个通过采用低na(≤0.6)物镜将fov扩展到几平方毫米的非线性光学显微镜(nlom)，由此导致不良的轴向分辨率(以及由此导致不良的3d分辨率)，这是由于轴向分辨率对于物镜的数值孔径(na)具有平方反比关系(inversesquaredependence)。4.乔纳森·r·巴姆斯特德(jonathanr.bumstead)等人著，“使用光学不变量分析设计大视场双光子显微镜”神经光子学，5(2),025001(2018),doi:10.1117/1.nph.5.2.025001(“designingalargefield-of-viewtwo-photonmicroscopeusingopticalinvariantanalysis,”neurophoton.5(2),025001(2018),doi:10.1117/1.nph.5.2.025001)，公开了一种使用光学不变量分析的双光子显微镜，产生横向和轴向分辨率分别为约1.7μm和约28μm的直径为7mm的fov，其通过4x，0.22na的物镜实现。此外，为了解析跨越(across)直径为7mm的fov的约1.7μm的横向分辨率，即4.95×4.95mm2的方形fov(square-fov)，奈奎斯特准则需要多于5800×5800的像素数，但是，它们受到每秒百万样本(1msamplespersecond)的数据采集速度的限制。5.真一郎寺田(shin-ichiroterada)等人著，“具有在后物镜空间中移动的微光学器件的超宽场双光子成像”，《自然通信》(2018)9:3550,doi:10.1038/s41467-018-06058-8(“super-wide-fieldtwo-photonimagingwithamicro-opticaldevicemovinginpost-objectivespace”,naturecommunications(2018)9:3550,doi:10.1038/s41467-018-06058-8)，公开了一种在后物镜空间中使用微光学机械器件的双光子成像系统，其导致的fov为1.2×3.5mm2，使用多个远距离区域(》6mm)的连续成像进行拼接，x轴方向的横向分辨率为1.26±0.03μm，y轴方向的横向分辨率为0.88±0.07μm和轴向分辨率为9.96±0.12μm，其通过10x，0.6na的物镜来实现，进一步受数据采集速度限制。6.因此，现有技术受到小于一平方毫米的fov或不良轴向分辨率和/或更慢的数据采集速度的限制来满足奈奎斯特准则，并且因此不适合作为高分辨率3d成像的候选，该高分辨率3d成像在跨越超过一平方毫米的视场(fov)上具有亚毫微微升(sub-femtoliter)满足奈奎斯特(nyquist-fulfilled)的有效3d分辨率。7.本领域需要提供一种克服上述问题的nlom。技术实现要素：8.本发明旨在提供一种用于深层组织成像的大角度光学光栅扫描系统，该系统具有多于一平方毫米的扩展fov，同时保持高的有效3d分辨率，该高的有效3d分辨率由完整fov的超越奈奎斯特准则的高速数据采集系统来解析。在这样做的同时，为了不在速度上折衷，将每个体素采集与来自具有高重复率的脉冲激光源的每个光学脉冲同步，从而将采集速度推到最大，即，受脉冲激光源的重复率限制。本发明采用的高na和低放大倍率物镜，而分辨率不折衷(uncompromised)。为了将fov扩展超过一平方毫米，发明了一种特殊的光学设计，该特殊的光学设计支持沿快速x轴和慢速y轴的大扫描角度，同时保持跨越fov的低光学像差。9.在扩展扫描角度(从而扩展fov)时，谐振扫描镜的非线性速度导致沿快速x轴的图像失真，迫使其(enforcingone)在非等距时间点采样并保持均匀的像素率，由此导致更低的像素数，不足以满足具有微光学分辨率的大fov的奈奎斯特准则。本发明涉及在等距时间点在整个扫描范围内的超越奈奎斯特采样(nyquist-exceededsampling)，并且随后借助于图形处理单元(gpu)加速的插值算法实时地修复(fixes)谐振扫描器引起的失真；同时与fov的中心相比，在边缘附近收集更多的数据点(由于谐振扫描镜的整个非线性运动中的等距采样)，由于物镜的有限场数，进一步补偿在fov边缘附近的渐晕引起的减小的信号强度。10.根据本发明，为了解决在现有技术中遇到的上述问题，公开了一种用于高速深层组织成像的大角度光学光栅扫描系统，该系统提供至少一平方毫米的视场(fov)，该视场具有通过由超越奈奎斯特(nyquist-exceeded)同步采样解析的亚毫微微升(sub-femtoliter)有效3d分辨率，该系统包括：11.一个或多个，即第1至第n个，脉冲激光源，该脉冲激光源用于发射一个或多个激光束，该激光束的第n个脉冲激光源的中心波长为λn并且该激光束的第n个脉冲激光源的超越奈奎斯特重复率为rn≥an×nn，其中an是奈奎斯特有限(nyquist-limited)采样率，该奈奎斯特有限采样率由水平fov的4倍乘以谐振扫描器频率除以理论物镜有限(objective-limited)横向分辨率给出，用于解析跨越大于1mm的水平fov的微光学分辨率，并且nn是大于等于1的整数且表示每个体素的激光脉冲数；12.谐振扫描镜，该谐振扫描镜光学耦合至该一个或多个脉冲激光源；13.检流计扫描镜，该检流计扫描镜光学耦合至该谐振扫描镜；14.扫描透镜，该扫描透镜光学耦合到该检流计扫描镜；15.专用镜筒透镜(dedicatedtubelens)，该专用镜筒透镜包括三个平凸透镜，每个平凸透镜的有效焦距为500mm，三个平凸透镜组合在一起并光学耦合至扫描透镜；16.高na(数值孔径)和低放大倍率物镜，该高na(数值孔径)和低放大倍率物镜光学耦合至专用镜筒透镜，用于光栅扫描体积组织样本(volumetrictissue-sample)和用于收集样本产生(sample-generated)的荧光信号，该荧光信号被引导至光电倍增管(pmt)以产生电信号；和17.数据采集系统，该数据采集系统被耦合以从该pmt接收电信号，在一个或在多个脉冲激光源的情况下，每个采样事件分别与来自该一个脉冲激光源或来自最高重复率脉冲激光源的每个光脉冲同步，18.其中扫描透镜和专用管透镜构成具有低放大倍率的光束扩展器，从而最大化视场(fov)，但同时在高na和低放大倍率物镜的后孔径上提供放大的光束尺寸，以保持高激发na(highexcitation-na)，从而提供高分辨率。附图说明19.本专利或申请文件包含至少一个以彩色绘制的图。具有彩色图的本专利或专利申请公开文件副本将由专利局根据请求和必要费用的付款而提供。20.图1(a)和1(b)分别示出了根据本发明的大角度光栅扫描和荧光检测光学器件。图1(c)描绘了控制和数据采集系统的方框图，其中包含了控制电子设备。21.图2(a)，2(b)和2(c)分别显示了在x方向上离轴±7.7°的、在x和y方向上离轴0°的、在y方向上离轴±7.7°的角度(在整个扫描透镜上)的光学传递函数(otf)与空间频率(周期/mm)之间的模数。22.图3(a)和3(b)分别显示了横向和轴向截面，横向和轴向截面分别平均具有25个球(beads)(其直径为220nm)，误差线表示标准偏差。高斯拟合(gaussian-fitting)分别产生0.483μm和1.997μm的有效双光子横向和轴向分辨率(即半峰全宽(fwhm))，即小于0.5毫微微升的有效3d分辨率，且横向分辨率的标准偏差和标准误差的平均值分别为0.0342μm和0.0068μm，轴向分辨率的标准偏差和标准误差的平均值分别为0.3027μm和0.0605μm。23.图4(a)和4(b)分别以倾斜和俯视图描绘了在本发明的大角度光栅扫描系统下扫描的tdtomato阳性离体小鼠髓质的体积组织样本的3d渲染体积(3drenderedvolume)。图4(c)描绘了从图4(b)所示的原始体积裁剪的3d缩放区域(3dzoomedregion)。图4(d)描绘了在约170μm至约173μm的深度范围内通过重叠10个帧而形成的图像，该图像是从图4(a)和(b)中描述的相同体积中提取的。图4(e)描绘了从图4(d)所示的原始图像裁剪的缩放区域。24.表1示出了根据本发明的具有全场(full-field)超越奈奎斯特(beyond-nyquist)可解析性(resolvability)的数据采集系统的性能。25.表2显示了数据采集系统与目前最先进的系统(徕卡sp8共焦(leicasp8confocal))的比较。表3示出了根据本发明的用于基于c++的gpu加速的(gpu-accelerated)控制和获取软件的软件依赖性和必备硬件(pre-requisitehardware)。具体实施方式26.根据本发明，使用zemax优化大角度光栅扫描系统(如图1(a)，1(b)所示)，在高na和低放大倍率物镜(olympus-xlumplanfl，20x，0.95w，有效焦距(efl)＝9mm)的后孔径上的扫描角度高达约±7.16°，产生高达1.6×1.6mm2的方形fov(square-fov)。为了实现大的扫描角度，本发明提供并优化一种专用镜筒透镜，该专用镜筒透镜结合了三个平凸透镜(admundoptic：86-925)，每个平凸透镜的通光孔径和efl分别为73.5mm和500mm，从而导致组合的efl为166.7mm，结合通用扫描透镜(thorlabs-lsm05-bb,efl＝110mm)可产生1.515倍的光束放大倍率；因此，要求在扫描透镜上的最大扫描角度高达～±10.8°，以实现1.6×1.6mm2的方形fov。27.使用直径为9.25mm而λ＝1070nm的输入光束并将高na和低放大倍率物镜视为近轴透镜，发现均方根(rms)波前误差(无散焦)和斯特列尔比(strehlratios)(对于x和y方向上的离轴0°和±7.7°的配置(在扫描透镜上))分别为小于0.07λ和大于80％，确认在1.6×1.6mm2的fov的边缘中心处的衍射极限性能(diffraction-limitedperformance)，表明大于78％的fov(即来自1.6×1.6mm2＝2.56mm2方形fov的π×0.82mm2＝2.01mm2圆形fov)是衍射极限(diffraction-limited)(maréchal准则)。图2(a)，2(b)和2(c)分别绘制了对于在x方向上离轴±7.7°的、在x和y方向上离轴0°的、在y方向上离轴±7.7°的角度(在整个扫描透镜上)，光学传递函数(otf)的模量与空间频率(周期/mm)的关系图。此外，对于在x和y两个方向上在所述扫描透镜上离轴0°和±7.7°的所有配置在0.1λ之下时，同时在固定图像平面处产生rms波前误差(无散焦)，表明系统的低场曲率。为了有效收集荧光信号，使用了缩倍因子为3.75的的中继系统(图1(b))，从而产生在整个扫描范围约4mm的聚焦光斑直径，该聚焦光斑直径足够小以位于pmt光敏区域内。28.获取奈奎斯特准则要求的最小像素数是搜索最佳光学分辨率的关键。1.6×1.6mm2的fov需要7459×7459的像素数才能解析约429nm的理论双光子横向分辨率(λ＝1070nm,na＝0.95)，其像素尺寸为214.5nm。本发明引入了一种超越奈奎斯特采样数据采集系统，该超越奈奎斯特采样数据采集系统能够以高达每秒125m样本(msps)的采样率同时对四个通道进行采样，对于四个通道达到15720×16000的单帧象素数，导致每帧约1十亿像素(gigapixels)，同时保持约0.5fps(帧/秒)。在本发明中，通过每光脉冲1体素的同步采样来实现每秒70m样本的采集速度，该光脉冲来自从毫微微秒(femtosecond)激光源(相干保真-2光纤激光器(coherentfidelity-2fiberlaser))，该毫微微秒(femtosecond)激光源具有70mhz的重复率，具有扫描1.6×1.6×1.6mm3体积的能力，具有8800×8800×2000(×4通道)，即，619.52十亿体素(giga-voxels)，以0.8μmz步长在小于39分钟内捕获约1.13万亿字节(terabyte)的具有14位分辨率的16位原始数据，并保持小于27阿升(attoliter)、大于1750μm3/ms和大于12mm/ms的超越奈奎斯特体素尺寸(nyquist-exceededvoxel-size)、超越奈奎斯特体积扫描速度(nyquist-exceededvolume-scanningspeed)和超越奈奎斯特线扫描速度(nyquist-exceededline-scanningspeed)，同时保持以高达小于500nm的有效横向分辨率小于40ns的有效像素停留时间。在本发明中，进一步利用来自毫微微秒激光源(铬-镁橄榄石激光器)的每个光学脉冲1体素的同步采样实现以每秒95m样本的采集速度，该毫微微秒激光源具有95mhz的重复率，具有扫描1.6×1.6×1.6mm3体积的能力，具有12000×12000×2000(×4通道)，即1.152万亿体素，以0.8μmz步长在小于53分钟内捕获约2.1万亿字节的具有14位分辨率的16位原始数据，并保持小于15阿升，大于1288μm3/ms和大于12mm/ms的超越奈奎斯特的体素尺寸、超越奈奎斯特的体积扫描速度和超越奈奎斯特的行扫描速度，同时以高达小于420nm的有效横向分辨率保持小于35ns的有效像素停留时间。29.本发明进一步利用一种多线程控制算法，该多线程控制算法用于使慢y轴与快速x轴同步，在每帧完成后不发送外部电帧触发信号，从而实现单帧像素数为15720×8(×4通道)的约983的帧速率，即在每秒125m样本采样率时125,760(×4通道)体素，包括实时存储具有14位分辨率的16位格式的所采集的数据，达到谐振扫描器有限帧速率，确认慢y轴同步的鲁棒性。表1和表2分别描述了本发明的数据采集系统的采集能力和其与目前最先进系统的性能对比，表明(concluding)与最先进的系统(leicasp8confocal)相比，本发明的系统提供比其大超过4倍(》4timeslarger)的fov和比其高约6倍的帧速率，同时保持比其高超过4.5倍(》4.5timeshigher)的像素数。30.表3描述了根据本发明的用于基于c++的gpu加速的(gpu-accelerated)控制和获取软件的软件依赖性和必备硬件(pre-requisitehardware)，其中列出了软件依赖性和硬件需求。31.本发明系统的分辨率分析使用直径为220nm的多荧光微球(multifluorescentmicrospheres)(polysciences公司(polysciences,inc.))。将球(beads)浸入0.7％琼脂糖溶液中固定，并将球扫描以用于1.6×1.6mm2的fov，单帧像素数为以8800×8800，保持像素和体素大小分别为约181.82nm和约9.92阿升(和300nm的z步长)。图3(a)和(b)分别描绘了横向和轴向横截面，分别具有25个球(beads)，误差线表示标准偏差。应用高斯拟合(gaussian-fitting)，发现有效双光子横向和轴向分辨率(即半峰全宽(fwhm))分别为0.483μm和1.997μm，导致小于0.5毫微微升(femtoliter)的有效3d分辨率。横向分辨率的平均值的标准偏差和标准误差分别为0.0342μm和0.0068μm，轴向分辨率的平均值的标准偏差和标准误差分别为0.3027μm和0.0605μm。32.参考本发明，图1(a)和1(b)显示了大角度光栅扫描系统及其荧光检测光学器件，分别具有101：输入激光束，102、103：分别为谐振扫描镜和检流计扫描镜，104、107：分别为扫描透镜和专用镜筒透镜，109：高na和低放大倍率物镜，110：焦平面，111：分色光束分离器，112、115：聚焦透镜，116：pmt感光区域，105、106、108、113、114:转向镜。图2(a)、2(b)和2(c)分别显示对于在x方向上离轴±7.7°的、在x和y方向上离轴0°的、在y方向上离轴±7.7°的角度(在整个扫描透镜上)，光学传递函数(otf)的模量与空间频率(周期/mm)的关系图。图3(a)和3(b)分别显示了横向和轴向截面，横向和轴向截面分别具有25个球(beads)(直径为220nm)，并且误差线表示标准偏差。高斯拟合导致分别为0.483μm和1.997μm的有效双光子横向和轴向分辨率(即半峰全宽(fwhm))，即小于等于0.5毫微微升有效3d分辨率，且横向分辨率的平均值的标准偏差和标准误差分别为0.0342μm和0.0068μm，轴向分辨率的平均值的标准偏差和标准误差分别为0.3027μm和0.0605μm。图4(a)和4(b)分别以倾斜和俯视图描绘了3d渲染体积，其体积尺寸为1.6×1.6×0.5mm3，在本发明的大角度光学光栅扫描系统下被扫描，具有8800×8800×1711体素，即总共132.5十亿体素(giga-voxels)保持300nm的z步长尺寸，以tdtomato阳性离体小鼠髓质用作双光子成像的体积组织样本，其用在中心波长1070nm、重复率为70mhz的毫微微秒激光源(coherentfidelity-2光纤激光器)来激发，使用amira5.3.2(视觉图像公司(visageimaginginc.)，加州圣地亚哥)软件进行3d渲染，没有应用拼接和/或镶嵌。图4(c)描绘了从图4(b)中所示的原始体积裁剪的3d缩放区域，即由图4(b)中的白色虚线框标记的区域。图4(d)描绘了在约170μm到约173μm的深度范围内由10帧重叠形成的图像，该图像从图4(a)和4(b)中描述的相同体积中提取，二维(2d)fov为1.6×1.6mm2，超越奈奎斯特的像素尺寸为约181.82nm。图4(e)描绘了从图4(d)所示的原始图像中裁剪的缩放区域，即图4(d)中由白色虚线框标记的区域，其解析的微光学分辨率具有约181.82nm的超越奈奎斯特像素尺寸。33.大角度光学光栅扫描的光机械设置：34.fov的最大化需要扫描透镜和镜筒透镜对的低放大倍率比率。同时，物镜的激发na的最大化要求入射光束满足其后孔径，需要最大可能的(largestpossible)光束直径来击中(hit)扫描透镜，以达到最优条件。因此，选择了来自剑桥科技(cambridgetechnology)的4khz谐振扫描器(图1(a)-102)以用于快速x轴扫描，该谐振扫描器具有12mm×9.25mm的大通光孔径。对于慢y轴，选择了来自剑桥科技的具有14mm通光孔径的检流计扫描器(图1(a)-103)。使用以70mhz重复频率操作并以1070nm为中心的脉冲激光源(coherentfidelity-2光纤激光器)，或/和以95mhz重复率操作并以1260nm为中心的脉冲激光源(铬-硅酸镁石激光器)作为源(图1(a)-101)以用于体积组织样本的非线性激发。放大倍率为1:5的光束扩展器用于充分扩展光束，以过度填充谐振扫描镜。使用thorlabs-lsm05-bb作为具有110mm的efl的扫描透镜(图1(a)-104)和专用镜筒透镜，或定制设计的镜筒透镜，即三个平凸透镜(admundoptics:86-925,efl＝500mm)的组合(图1(a)-107)，其具有的组合efl为166.7mm，实现光束放大倍率为1.515倍，导致在高na和低放大倍率物镜(olympusxlumplanfl，20x，0.95w，efl＝9mm，瞳孔直径为约17mm)的后孔径上(图1(a)-109)大于14mm的光束尺寸(高达18mm)。35.信号收集光电系统：36.图1(b)示出信号收集光学设计的斜视图，是大角度光栅扫描系统的一部分。在焦平面(图1(b)-110)处从体积组织样本中出射的荧光信号由高na和低放大倍率的物镜(图1(b)-109)收集并通过分色光束分离器(ff801-di02，semrock)(图1(b)-111)朝向检测单元反射。检测单元包括一个具有两个透镜的中继系统，该两个透镜分别具有150mm(admundoptics：32-982，双凸透镜(admundoptics:32-982,bi-convex))(图1(b)-112)和40mm(admundoptics：48-654，平凸透镜(admundoptics:48-654,plano-convex))(图1(b)-115)的efl并且分别具有49mm和39mm的通光孔径。将高na和低放大倍率物镜收集的出射荧光光束缩小3.75倍，从而在整个扫描范围内提供约4mm的聚焦光斑直径，该直径小到足以位于pmt的感光区域内(图1(b)-116)(r10699，滨松，感光面积＝24×8mm2)。带通滤波器(ff01-580/60-25-d,semrock)放置在pmt光电阴极之前，以确保对tdtomato双光子荧光信号的检测。来自pmt的信号经过跨阻抗放大器(c6438-01，滨松)以用于电流至电压的转换，其输出使用具有14位分辨率的alazartechats9440数字化仪进行数字化。37.使用zemax进行性能分析：38.如图1(a)所示，谐振扫描镜和检流计扫描镜(分别标记为图1(a)-102和图1(a)-103)以2mm毫米的距离分隔，导致x和y方向上的不同(non-identical)性能，因为这两个镜都不能与扫描透镜等距(图1(a)-104)。为了优化设计，使用zemax对光栅扫描系统进行完整的3d模拟，同时分别为x和y方向配置谐振扫描镜和检流计扫描镜的不同扫描角度(即相对于光轴在x和y方向上离轴0°和±7.7°的配置(在扫描透镜上))。将高na和低放大倍率物镜(图1(a)-109，olympus-xlumplanfl，20x，0.95w)视为efl为9mm的近轴透镜，系统在1070nm处被优化。光学系统的性能进一步取决于输入激光束的尺寸，事实上，对于填充物镜的后孔径以最大化激发na所需的较大输入光束直径，扫描透镜(图1(a)-104)和专用镜筒透镜(图1(a)-107)引起的光学像差特别是对于更大的扫描角度变得重要，并且整体性能下降。因此,为了评估扫描系统的实际性能，在进行模拟时使用了9.25mm的输入光束直径(即4khz谐振扫描镜的最小尺寸)。39.具有全场超过奈奎斯特(beyond-nyquist)分辨率的数据采集系统：40.图1(c)中描绘了设有控制电子装置的数据采集系统200。在数据采集系统200中，跨阻抗放大器(图1(c)-117)用于来自pmt(图1(c)-116)的输出信号的电流至电压的转换。使用来自alazartech的数字化仪ats9440(图1(c)-118a)将放大器的输出数字化。来自美国国家仪器(nationalinstrument)的控制卡pcie-6341(图1(c)-118b)用于使慢速y轴与快速x轴同步。谐振扫描镜控制器(图1(c)-119)和检流计扫描镜控制器(图1(c)-121)(电子驱动板)分别用于控制谐振扫描镜(图1(c)-102)和检流计扫描镜(图1(c)-103)。两个元件图1(c)-118a和图1(c)-118b都接收来自谐振扫描镜控制器(图1(c)-119)的同步信号(4khz数字信号，每个边缘代表谐振扫描镜运动方向的变化)。元件图1(c)-118b通过其控制器单元(图1(c)-119)控制谐振扫描镜(图1(c)-102)的振幅。16位数模转换器(dac)(图1(c)-120)用于将由图1(c)-118b(由控制和采集软件图1(c)-122计算和命令)生成的16位数字数据字转换为电压并将该特定电压提供至检流计扫描镜控制器(图1(c)-121)，产生慢y轴镜(图1(c)-103)的特定方向/角度。元件图1(c)-122是定制开发的基于c++的gpu加速控制和采集软件，其可以控制这些元件：图1(c)-118a、118b、119、120、121、102和103。41.开发的控制和采集软件(图1(c)-122)是用c++和c#(使用visualstudio2017)编写的多线程应用程序，集成了来自alazarapi和nidaqmx的c/c++支持，分别提供对ats9440(来自alazartech)的控制(图1(c)-118a)和pcie-6341(来自美国国家仪器)(图1(c)-118b)。数字化仪ats9440(图1(c)-118a)能够以高达每秒125m样本的采样率和14位分辨率同时对4个通道进行采样，进一步提供双端口内存支持，从而能够同时在正在进行的数据采集期间将数据传输至主机内存。定制开发的控制和采集软件利用了nvidiacuda(计算统一设备架构)(版本：10.1)加速opencv(图像处理库)(版本：4.1.1)，以用于采集数据的高速处理。使用具有coretmi7-9800x处理器和nvidiaquadrortx8000显卡的计算机来运行控制和采集软件。42.定制开发的控制和采集软件进一步涉及使慢速y轴与快速x轴同步的多线程控制算法，在每帧完成后不发送外部电帧触发信号。16位dac模块(来自剑桥科技的模型6757)(图1(c)-120)与micromaxtm系列671(来自剑桥科技的检流计扫描镜的驱动器模块)(图1(c)-121)连接(interfacedwith)以用于慢速y轴的精确移动。为了将16位数据字发送至所述6757dac模块(图1(c)-120)，控制卡pcie-6341(美国国家仪器，图1(c)-118b)(具有24个数字i/o引脚)直接连接至(interfacedto)计算机主板(computermotherboard)，从而能够直接控制来自控制和采集软件的慢速y轴运动。后台线程持续监控来自谐振扫描器的行触发信号(同步信号)并生成16位数据字，即使用16位分辨率的dac模块的角度定位步长(angle-positioning-steps)。以单帧像素数为15720×8(×4通道)即125,760(×4通道)体素，和采样率为每秒125m样本实现约为983fps的帧速率，包括实时存储具有14位分辨率的16位格式的采集数据，达到受谐振扫描器频率限制的最大帧速率，确认慢y轴同步的鲁棒性。43.参考图1(a)、1(b)和1(c)，本发明优选实施例的本质概括如下。本发明提供一种用于高速深层组织成像的大角度光学光栅扫描系统100，该大角度光学光栅扫描系统提供至少一平方毫米的视场(fov)，该视场具有通过由超越奈奎斯特同步采样解析的亚毫微微升有效3d分辨率，包括：44.一个或多个，即第1至第n个，脉冲激光源101，该脉冲激光源用于发射一个或多个激光束，该激光束的第n个脉冲激光源的中心波长为λn并且该激光束的第n个脉冲激光源的超越奈奎斯特(nyquist-exceeding)重复率为rn≥an×nn，其中an是奈奎斯特有限(nyquist-limited)采样率，该奈奎斯特有限采样率由水平fov的4倍乘以谐振扫描器频率除以理论物镜有限(objective-limited)横向分辨率给出，用于解析跨越大于1mm的水平fov的微光学分辨率，nn是大于等于1的整数且表示每个体素的激光脉冲数；45.谐振扫描镜102，该谐振扫描镜102光学耦合至该一个或多个脉冲激光源；46.检流计扫描镜103，该检流计扫描镜103光学耦合至该谐振扫描镜；47.扫描透镜104，该扫描透镜104光学耦合至该检流计扫描镜103；48.专用镜筒透镜107，该专用镜筒透镜107包括三个平凸透镜，每个平凸透镜的有效焦距为500mm，三个平凸透镜组合在一起并光学耦合至扫描透镜104；49.高na(数值孔径)和低倍率物镜109，该高na(数值孔径)和低倍率物镜109光学耦合至专用镜筒透镜107，用于光栅扫描放置在焦平面110的体积组织样本和用于收集样本产生的荧光信号，该荧光信号被引导至光电倍增管(pmt)116以产生电信号；和50.数据采集系统200，该数据采集系统200被耦合以从该pmt接收电信号，在一个或在多个脉冲激光源的情况下，每个采样事件分别与来自该一个脉冲激光源的或来自最高重复率脉冲激光源的每个光脉冲同步，该数据采集系统200由跨阻抗放大器117、alazartech数字化仪118a，美国国家仪器卡118b、谐振扫描镜控制器119、16位数模转换器(dac)120、检流计扫描镜控制器121以及控制和采集软件122组成。51.其中，扫描透镜和专用管透镜构成具有低放大倍率的光束扩展器，从而最大化视场(fov)，但同时在高na和低放大倍率物镜的后孔径上提供放大的光束尺寸，以保持高激发na(highexcitation-na)，从而提供高分辨率。52.根据本发明的大角度光学光栅扫描系统100，所述数据采集系统200能够以等于第n个脉冲激光源的重复率rn≥an×nn的采样率进行同步采样，该第n个脉冲激光源即该一个脉冲激光源或最高重复率脉冲激光源(分别在一个或多个脉冲激光源的情况下)，每个采样事件与每个光学脉冲同步，从而实现超越奈奎斯特(超越奈奎斯特标准)像素数以解析跨越大于1mm的水平fov的微光学分辨率而不缩小fov尺寸。53.在本发明的大角度光学光栅扫描系统中，高na和低放大倍率物镜109的数值孔径大于0.9，有效放大倍率小于等于20x。54.如所提供的，谐振扫描透镜102的频率是至少4khz，并且谐振扫描反射镜102提供12mm×9.25mm的通光孔径(clearaperture)，该通光孔径被该输入的一个或多个激光束过填充以最大化扫描光束尺寸。55.在本发明中，第一脉冲激光源以以1070nm为中心的70mhz的重复率操作，第二脉冲激光源以以1260nm纳米为中心的95mhz的重复率操作。56.根据本发明，所述专用镜筒透镜107包括组合在一起的所述三个平凸透镜，每个平凸透镜具有500mm的有效焦距，从而导致166.7mm的组合有效焦距，并且提供直径大于60mm的大通光孔径以支持该谐振扫描镜和该检流计扫描镜的大扫描角度。57.在本发明的大角度光学光栅扫描系统100的一个实施例中，有效焦距分别为110mm和166.7mm的该专用镜筒透镜104和该扫描透镜107构成了放大倍率为1.515的低放大倍率中继系统，从而在高na和低放大倍率物镜的后孔径上提供高达约±7.16°的扫描角度，在整个扫描透镜上提供高达约±10.8°的扫描角度，并因此分别提供高达1.6×1.6mm2和直径高达2.26mm的方形和圆形视场(fov)，但同时在高na和低放大倍率物镜(na》0.9)的后孔径上提供大于14mm(高达18mm)的放大光束尺寸，从而提供高分辨率。58.在本发明的大角度光学光栅扫描系统100的进一步实施例中，直径为9.25mm而λ等于1070nm的输入光束和被模拟为近轴透镜的高na和低放大倍率物镜，对于x和y方向上离轴0°和±7.7°的配置(在扫描透镜上)，分别产生小于0.07λ和大于80％的均方根(rms)波前误差(无散焦)和斯特列尔比，确认在1.6×1.6mm2的fov的边缘中心处的衍射极限性能，表明大于78％的fov，即来自1.6×1.6mm2＝2.56mm2方形fov的π×0.82mm2＝2.01mm2圆形fov，是衍射极限(maréchal准则)59.在本发明的另一个实施例中，直径为9.25mm而λ等于1070nm的输入光束和被模拟为近轴透镜的高na和低放大倍率物镜，对于在x和y两个方向上在所述扫描透镜上离轴0°和±7.7°的所有配置在0.1之下时，同时在固定图像平面处产生rms波前误差(无散焦)，表明(concluding)系统的低场曲率。60.进一步，通过缩倍因子为3.75的中继系统实现所述荧光信号的有效收集，从而产生位于该pmt的感光区域内的约4mm的聚焦光斑直径。61.根据本发明，第一转向镜105和第二转向镜106光学耦合至所述扫描透镜104，所述专用镜筒透镜107光学耦合至所述第二转向镜106，第三转向镜108光学耦合至所述专用镜筒透镜107，并且所述高na和低放大倍率物镜109光学耦合至所述第三转向镜108以实现便携式形状因子(portableformfactor)。62.另外，还提供了位于高na和低倍率物镜109的后孔径与光电倍增管(pmt)116之间的分色分束器111、双凸透镜112、第四转向镜113、第五转向镜114和平凸透镜115。63.在本发明中，为了超越对具有亚微米横向光学分辨率的完整fov的奈奎斯特准则的要求，所述数据采集系统提供以高达每秒125m样本的采样率同时对四个通道进行采样的能力，具有同时对四个通道数据采集、传输、处理、预览和存储具有14位分辨率的16位原始数据的能力，并达到15720×16000(×4通道)的单帧像素数，从而导致每帧约1十亿像素的采集，同时保持约0.5fps。64.或者，借助以70mhz重复率脉冲的所述一个脉冲激光源，以每秒70m样本最大化所述数据采集系统的采集速度，具有每个光学脉冲1体素的同步采样，具有扫描1.6×1.6×1.6mm3体积的能力，具有8800×8800×2000(×4通道)，即619.52十亿体素，以0.8μmz步长在小于39分钟内捕获约1.13万亿字节的具有14位分辨率的16位原始数据，并保持小于27阿升，大于1750μm3/ms和大于12mm/ms的超越奈奎斯特的体素尺寸(nyquist-exceededvoxel-size)、超越奈奎斯特的体积扫描速度(nyquist-exceededvolume-scanningspeed)和超越奈奎斯特的行扫描速度(nyquist-exceededline-scanningspeed)，同时以高达小于500nm的有效横向分辨率保持小于40ns的有效像素停留时间。65.在本发明的更进一步的实施例中，借助以95mhz重复率脉冲的所述一个脉冲激光源，以每秒95m样本最大化所述数据采集系统的采集速度，具有每个光学脉冲1体素的同步采样，具有扫描1.6×1.6×1.6mm3体积的能力，具有12000×12000×2000(×4通道)，即1.152万亿体素，以0.8μmz步长在小于53分钟内捕获约2.1万亿字节的具有14位分辨率的16位原始数据，并保持小于15阿升，大于1288μm3/ms和大于12mm/ms的超越奈奎斯特的体素尺寸、超越奈奎斯特的体积扫描速度和超越奈奎斯特的行扫描速度，同时以高达小于420nm的有效横向分辨率保持小于35ns的有效像素停留时间。66.进一步，所述数据采集系统200还包括多线程控制算法，该多线程控制算法用于使所述检流计扫描镜(保持16位的精确移动)的慢y轴扫描与所述谐振扫描镜的快速x轴扫描同步，在每帧完成后不发送外部电帧触发信号，从而达到具有每帧15720×8(×4通道)体素的约983fps的谐振扫描器有限帧速率。此外，所述数据采集系统200使得gpu加速的实时校准能够校正由所述谐振扫描镜的非线性速度剖面(nonlinearspeedprofile)引起的沿所述快速x轴的失真。67.根据本发明的大角度光学光栅扫描系统100，由所述全场(而不缩小所述fov)超越奈奎斯特采样解析的有效双光子横向和轴向分辨率分别为小于0.5μm和小于2μm，导致小于0.5毫微微升的有效3d分辨率，所述横向分辨率的平均值的标准偏差和标准误差分别为小于0.04μm和小于0.007μm，轴向分辨率的平均值的标准偏差和标准误差分别为小于0.31μm和小于0.061μm。68.表1.全场超奈奎斯特解析性(resolvability)的数据采集系统的性能。[0069][0070]表2.数据采集系统与目前最先进系统(徕卡sp8共焦(leicasp8confocal))的比较。[0071][0072]表3.基于c++的gpu加速控制和采集软件的软件依赖性和必备硬件(pre-requisitehardware)。[0073]当前第1页12当前第1页12